等電點(diǎn)沉淀提取蛋白和漂洗魚糜蛋白的高溫膠凝特性

石 柳，章 蔚,2，周俊鵬,2，汪 蘭，李 新，丁安子，熊光權(quán)，楊 宏*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心農(nóng)產(chǎn)品加工研究分中心，湖北 武漢 430064；2.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430070）

蛋白質(zhì)是魚肉的重要組成成分和營(yíng)養(yǎng)成分，魚肉蛋白的提取及特性研究對(duì)于食品業(yè)的發(fā)展具有重要意義。等電點(diǎn)沉淀法（isoelectric solubilization precipitation，ISP）是根據(jù)肌肉蛋白在極酸極堿條件下溶解度不同的原理，通過改變?nèi)芤簆H值誘導(dǎo)原料中蛋白質(zhì)溶解或沉淀進(jìn)行分離提取的方法[1]。相較于傳統(tǒng)漂洗法，ISP法具有操作簡(jiǎn)單、蛋白質(zhì)得率高、去脂效果好等優(yōu)勢(shì)[2-3]。目前，該技術(shù)已成功應(yīng)用于提取鯡魚、巖魚、鯰魚、鰱魚等魚類肌肉蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是一種提取魚肉蛋白質(zhì)的高效方法[4-8]。

不同的提取方法或酸堿處理都會(huì)導(dǎo)致魚肉蛋白組成和結(jié)構(gòu)的變化，直接影響蛋白質(zhì)的功能特性，從而影響魚肉蛋白的加工過程和產(chǎn)品品質(zhì)[9-10]。魚肉蛋白具有諸多功能特性，如水合性、乳化性、成膜性、膠凝性等。其中，膠凝特性是魚肉蛋白最重要的功能特性，目前關(guān)于魚肉蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的機(jī)理研究較多，加熱溫度主要集中在100 ℃以下。馬瑤蘭等[11]研究發(fā)現(xiàn)在40～90 ℃條件下，非二硫共價(jià)鍵是形成鰱魚魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)的主要作用力之一。鄭昇陽等[12]通過研究發(fā)現(xiàn)大黃魚魚糜的凝膠強(qiáng)度和質(zhì)構(gòu)特性隨著凝膠化溫度的升高而降低，在35 ℃時(shí)制得的魚糜凝膠產(chǎn)品特性較好。張夢(mèng)玲等[13]研究發(fā)現(xiàn)鰱魚糜在40 ℃保溫1 h后90 ℃加熱30 min條件下可以形成較高凝膠強(qiáng)度的魚糜凝膠，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在100 ℃以下熱誘導(dǎo)形成的凝膠需貯藏在4 ℃，且保質(zhì)期較短。而100 ℃以上熱處理形成的凝膠保質(zhì)期得到延長(zhǎng)，但蛋白質(zhì)在高溫下品質(zhì)也發(fā)生較大的變化。張莉莉[14]研究發(fā)現(xiàn)在100～120 ℃溫度范圍內(nèi)，阿拉斯加狹鱈魚糜凝膠的凝膠強(qiáng)度隨著加熱溫度的升高而顯著降低。韓靜文[15]研究不同熱加工條件的魚糜凝膠特性變化，同樣發(fā)現(xiàn)隨著加熱溫度的升高，魚糜凝膠的凝膠強(qiáng)度、彈性、持水性等相關(guān)指標(biāo)的下降速度加快。Belibagli等[16]研究發(fā)現(xiàn)，魚糜在溫度超過85 ℃的條件下，熱特性發(fā)生變化，并認(rèn)為是高溫處理破壞了其魚糜凝膠結(jié)構(gòu)所致。但目前關(guān)于ISP提取蛋白質(zhì)的高溫膠凝特性研究還鮮見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以白鰱為原料，采用漂洗法和ISP法提取蛋白質(zhì)，對(duì)比研究ISP提取蛋白質(zhì)與漂洗魚糜蛋白質(zhì)的高溫膠凝特性的差異，以期為常溫即食ISP提取蛋白凝膠制品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮白鰱（Hypohthalmichthyx mitrix） 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菜市場(chǎng)；冷凍白鰱魚糜（AAA級(jí)，添加6%蔗糖和0.3%三聚磷酸鹽為抗凍劑） 洪湖井立水產(chǎn)食品有限公司。冷凍魚糜切分300 g左右小塊，真空包裝，-80 ℃凍藏備用。

氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、考馬斯亮藍(lán)G-250、山梨醇、蔗糖、尿素、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、磷酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、四甲基乙二胺、冰醋酸、丙烯酰胺、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品、過硫酸銨、甲叉雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍(lán)R-250 美國(guó)Bio-Rad公司；三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris）、8-苯胺-1-萘磺酸 美國(guó)Sigma公司；5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 瑞士Fluka公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

812絞肉機(jī) 美國(guó)Biro公司；ZM-100反壓蒸煮消毒鍋 廣州標(biāo)際包裝設(shè)備有限公司；HH-6恒溫水浴鍋中國(guó)欣靈電氣股份有限公司；Avanti-JE高速冷凍離心機(jī)美國(guó)Beckman Coulter公司；T18高速分散均質(zhì)機(jī) 德國(guó)IKA公司；UMC5真空斬拌機(jī)（配RB 0006C真空泵）美國(guó)Stephan Machinery公司；TA-HDi質(zhì)構(gòu)儀 美國(guó)Texture Technologies Corp公司；CR-400色差儀 日本Minolta Camera司；722s可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；818 pH計(jì) 美國(guó)奧立龍公司；Mini電泳系統(tǒng)、XR凝膠掃描儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 ISP提取蛋白質(zhì)的制備

參考Abdollahi等[17]的方法并作適當(dāng)調(diào)整。白鰱在4 ℃解凍12 h，稱取860 g樣品，與冷卻蒸餾水以料液比1∶6（g/mL）混合，均質(zhì)10 min，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)均質(zhì)液pH值至11.5，繼續(xù)均質(zhì)10 min，4 ℃、10 000×g離心10 min。離心后均質(zhì)液出現(xiàn)分層，表層為漂浮的脂質(zhì)組分，底層為不溶性物質(zhì)組分，中間層為可溶性蛋白。8 層紗布過濾獲得中間層的可溶性蛋白溶液，用8 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至5.5，輕微攪拌10 min，4 ℃、10 000×g離心10 min。離心后傾倒上清液，收集的沉淀即為ISP提取蛋白質(zhì)組分。

1.3.2 蛋白凝膠的制備

參考張瑞婷等[18]的方法，將冷凍白鰱魚糜（漂洗蛋白）和ISP提取蛋白在室溫下解凍30 min，切成小塊后于真空斬拌機(jī)中低速空斬1 min；加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的NaCl，低速斬拌1 min；加入0.5%谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（transglutaminase，TGase），加入冰水調(diào)節(jié)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)至78%，低速斬拌1 min；最后在真空（50 kPa）條件下高速斬拌3 min。整個(gè)過程中控制斬拌機(jī)內(nèi)溫度在1～4 ℃。將斬拌好的魚糊手動(dòng)灌入塑料腸衣（直徑約20 mm）中，用卡口機(jī)兩端封口。蛋白凝膠經(jīng)低溫凝膠化（40 ℃水浴加熱60 min）后在不同高溫（100、110、120 ℃）條件下加熱不同時(shí)間（15、30、60 min）。以40 ℃水浴加熱60 min后90 ℃水浴加熱30 min的樣品為對(duì)照。加熱完成后，迅速用冰水冷卻至室溫，于4 ℃冰箱放置過夜，待次日進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.3 質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定

參考王蒙娜等[19]的方法，將蛋白凝膠于室溫恒溫2 h后，切成2 cm長(zhǎng)的圓柱體，采用P/0.25s球形探頭進(jìn)行穿刺實(shí)驗(yàn)。測(cè)試參數(shù)：觸發(fā)力5 g，測(cè)前速率5 mm/s，測(cè)中速率1 mm/s，測(cè)后速率5 mm/s，穿刺距離15 mm。記錄破斷力（g）和凹陷深度（mm）。

1.3.4 持水性的測(cè)定

參考Yin等[20]的方法，將蛋白凝膠切成約3 mm厚的薄片，稱質(zhì)量（m1），用兩層濾紙包裹后，于3 000×g室溫離心10 min，再稱量凝膠的質(zhì)量（m2）。持水性的計(jì)算如式（1）所示：

1.3.5 色度的測(cè)定

參考周俊鵬等[21]的方法，將蛋白凝膠于室溫恒溫2 h后，切成2 cm長(zhǎng)的圓柱體，用色度儀檢測(cè)其橫截面的亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*）。白度（W）的計(jì)算如式（2）所示：

1.3.6 化學(xué)作用力的測(cè)定

參考Zhang Longteng等[22]的方法略作修改。稱取2 g蛋白凝膠樣品，加入10 mL 0.05 mol/L NaCl溶液（A），混合均質(zhì)后于4 ℃放置1 h，10 000×g、4 ℃離心15 min，過濾后取沉淀；向沉淀中加入10 mL 0.6 mol/L N a C l溶液（B），混合均質(zhì)后于4 ℃放置1 h，10 000×g、4 ℃離心15 min，取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即為離子鍵質(zhì)量分?jǐn)?shù)，過濾后取沉淀；向沉淀中加入10 mL 0.6 mol/L NaCl和1.5 mol/L尿素混合溶液，混合均質(zhì)后于4 ℃放置1 h，10 000×g、4 ℃離心15 min，取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即為氫鍵質(zhì)量分?jǐn)?shù)，過濾后取沉淀；向沉淀中加入10 mL 0.6 mol/L NaCl和8 mol/L尿素混合溶液，混合均質(zhì)后于4 ℃放置1 h，10 000×g、4 ℃離心15 min，取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即為疏水鍵質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.7 總巰基含量的測(cè)定

參考賈丹[23]的方法，稱取8 g蛋白凝膠樣品，加入22 mL 0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0，含0.6 mol/L KCl和0.01 mol/L EDTA），均質(zhì)，6 000×g離心10 min，取上清液，調(diào)節(jié)上清液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為2 mg/mL，取0.5 mL上溶液，加入4.5 mL 0.2 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 7.0，含0.01 mol/L EDTA、8 mol/L尿素和20 mg/mL SDS和0.5 mL 1 mg/mL DTNB，混合均勻后于40 ℃水浴25 min，412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度?？値€基含量的計(jì)算如式（3）所示：

式中：A412nm為412 nm波長(zhǎng)處吸光度；ε為摩爾消光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）；B為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.8 SDS-PAGE分析

參考朱萌等[24]的方法，樣品采用5% SDS溶液加熱溶解，離心后取上清液，調(diào)節(jié)上清液蛋白質(zhì)濃度至2 mg/mL，加入上樣緩沖液。采用40 mg/mL和100 mg/mL的濃縮膠和分離膠進(jìn)行電泳，用0.125% R-250考馬斯亮藍(lán)固定和染色，然后用50%甲醇和10%冰乙酸脫色。蛋白質(zhì)條帶的分子質(zhì)量通過蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品確定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel進(jìn)行處理，采用SPSS 20.0進(jìn)行差異顯著性分析和相關(guān)性分析，用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠強(qiáng)度分析

如圖1所示，在相同熱處理?xiàng)l件下，ISP提取蛋白凝膠的破斷力低于漂洗蛋白凝膠，而凹陷深度高于漂洗蛋白凝膠，表明ISP蛋白凝膠硬度較小而彈性更高。魚肉蛋白的熱誘導(dǎo)聚集是魚肉肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性變化的復(fù)雜物化過程。在加工過程中，蛋白質(zhì)展開，暴露蛋白質(zhì)內(nèi)部的功能團(tuán)。這些功能基團(tuán)在隨后的分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)作用下形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)快速展開和隨后慢速聚集條件下，熱變性蛋白通過有序排列形成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，凝膠強(qiáng)度高[25]。而在ISP加工過程中，蛋白部分變性，表面疏水性增加，結(jié)構(gòu)未充分展開的蛋白質(zhì)在加熱前部分聚集，降低凝膠強(qiáng)度。另外，ISP蛋白凝膠破斷力的降低還可能與內(nèi)源性蛋白酶在加熱過程中降解魚肉蛋白有關(guān)。內(nèi)源性蛋白酶為水溶性的肌漿蛋白，在漂洗過程中大部分被除去，而在ISP加工中部分被回收。

圖1 高溫?zé)崽幚韺?duì)漂洗蛋白凝膠和ISP蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響Fig. 1 Effects of high temperature treatments on the texture properties of washed surimi gels and ISP protein gels

在高溫加熱過程中，漂洗蛋白凝膠的破斷力隨著溫度的升高先增加后降低，而ISP提取蛋白凝膠的破斷力逐漸降低，漂洗蛋白凝膠和ISP蛋白凝膠獲得最高破斷力的熱處理溫度分別是110 ℃和100 ℃。而Zhang Lili等[26]報(bào)道漂洗法生產(chǎn)的阿拉斯加狹鱈魚糜的凝膠強(qiáng)度隨著加熱溫度的升高（100～120 ℃）而逐漸下降，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果不同，其原因可能與不同的魚種和加熱模式有關(guān)。阿拉斯加狹鱈生長(zhǎng)在低溫水域，蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定較差，在高溫下易降解；而白鰱生長(zhǎng)環(huán)境溫度較高，蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性相對(duì)較高，因此適宜的最高加熱溫度相對(duì)較高。在加熱過程中，有2 種相反的現(xiàn)象（內(nèi)源性蛋白酶裂解蛋白質(zhì)和內(nèi)源性TGase催化肌球蛋白交聯(lián)）共同影響蛋白凝膠的質(zhì)地，取決于哪種作用在一定的加熱條件中處于主導(dǎo)地位，使凝膠強(qiáng)度被增強(qiáng)或者減弱。本實(shí)驗(yàn)中，在高溫加熱前，魚肉蛋白先進(jìn)行低溫凝膠化（40 ℃加熱60 min），TGase催化反應(yīng)基本完成，提高加熱溫度有利于快速通過凝膠劣化區(qū)間（55 ℃左右，蛋白酶活力高），增加凝膠強(qiáng)度。但當(dāng)最終加熱溫度過高時(shí)，肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白分子被熱降解，巰基和二硫鍵發(fā)生裂解，離子鍵和疏水相互作用減弱，凝膠強(qiáng)度下降[14]。隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，漂洗蛋白凝膠和ISP蛋白凝膠各熱處理組的破斷力和凹陷深度均逐漸降低，這與Zhang Lili等[26]的研究一致。張莉莉[14]報(bào)道在100 ℃加熱溫度下，直徑為30 mm的魚腸中心溫度從15 ℃加熱到90 ℃的時(shí)間約為20 min。在本實(shí)驗(yàn)中，魚腸的直徑為20 mm，其在20 min內(nèi)中心溫度可以達(dá)到設(shè)定的最高加熱溫度。因此，與提高加熱溫度會(huì)影響魚腸的升溫速率不同，延長(zhǎng)加熱時(shí)間只會(huì)增加魚肉蛋白的降解程度。

2.2 持水性分析

圖2 高溫?zé)崽幚韺?duì)漂洗蛋白凝膠和ISP蛋白凝膠持水性的影響Fig. 2 Effects of high temperature treatments on the water holding capacity of washed surimi gels and ISP protein gels

如圖2所示，漂洗蛋白凝膠的持水性在110 ℃加熱30 min時(shí)取得最大值，其整體趨勢(shì)是隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)持水性降低；ISP蛋白凝膠的持水性各組之間無顯著性差異；ISP蛋白凝膠的持水性整體上低于漂洗蛋白凝膠。凝膠強(qiáng)度高的蛋白凝膠一般具有均勻致密的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，能截留更多的水分。因此，蛋白凝膠的持水性的變化趨勢(shì)基本與質(zhì)構(gòu)特性的變化趨勢(shì)相一致。

Zhang Lili等[26]報(bào)道了在相同加熱時(shí)間下（10 min），阿拉斯加狹鱈魚糜凝膠的持水性在加熱溫度超過115 ℃時(shí)開始顯著下降，其原因是凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在120 ℃加熱時(shí)受到一定程度的破壞。陳斌等[27]報(bào)道了羅非魚魚糜在相同加熱溫度下（121 ℃），隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)持水性顯著降低，其原因是高溫加熱導(dǎo)致疏水基團(tuán)暴露，原有的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞，凝膠的持水性。盧彥宇[28]通過研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)加熱溫度到達(dá)120 ℃時(shí)，魚糜凝膠的持水性顯著下降，這與形成魚糜凝膠的肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)在高溫情況下被破壞有關(guān)。

2.3 色度分析

表1 高溫?zé)崽幚韺?duì)漂洗蛋白凝膠和ISP蛋白凝膠色度的影響Table 1 Effects of high temperature treatments on the color parameters of washed surimi gels and ISP protein gels

如表1所示，漂洗蛋白凝膠的L*值和W值整體上高于ISP蛋白凝膠，a*值和b*值整體上低于ISP蛋白凝膠。隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，所有熱處理組的b*值均呈上升趨勢(shì)；漂洗蛋白凝膠的L*值和W值呈下降趨勢(shì)，ISP蛋白凝膠呈相反趨勢(shì)。漂洗蛋白凝膠100 ℃和110 ℃熱處理組的L*值和W值均顯著高于對(duì)照組，120 ℃熱處理組顯著低于對(duì)照組。除120 ℃加熱15 min處理組外，ISP蛋白凝膠的

L*、b*值和W值均顯著高于對(duì)照組，且在100 ℃熱處理組L*值和W值取得最大值。在漂洗過程中色素蛋白（血紅蛋白和肌紅蛋白）隨肌漿蛋白被去除，而在ISP加工過程中，色素蛋白在堿的作用下發(fā)生變性和氧化[29]，與魚蛋白結(jié)合在一起，使ISP提取蛋白呈現(xiàn)相對(duì)較高的a*值和b*值。L*值表示為從凝膠表面反射的總能量的高低，與凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有關(guān)，凝膠結(jié)構(gòu)越均一致密，L*值越高。ISP提取蛋白在加熱過程中可能形成了簇狀的蛋白質(zhì)聚集體，漂洗魚糜蛋白在加熱過程中形成了更均一的凝膠結(jié)構(gòu)，因此漂洗蛋白凝膠的L*值更高。凝膠的W值與L*值呈正相關(guān)，因此漂洗蛋白凝膠的W值也相對(duì)較高。高溫?zé)崽幚硗ㄟ^影響凝膠中水分子的重新排列，而影響凝膠的折光性和透明度[15]。高溫使蛋白質(zhì)氧化，因此凝膠的b*會(huì)隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；同時(shí)高溫使色素蛋白發(fā)生熱降低而褪色，因此a*逐漸降低。

2.4 化學(xué)作用力分析

圖3 高溫?zé)崽幚韺?duì)漂洗蛋白凝膠和ISP蛋白凝膠化學(xué)作用力的影響Fig. 3 Effects of high temperature treatments on the chemical bond content of washed surimi gels and ISP protein gels

如圖3所示，在不同熱處理?xiàng)l件下，ISP蛋白凝膠的離子鍵質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于漂洗蛋白凝膠，但2 種蛋白凝膠離子鍵的變化趨勢(shì)相同。在100 ℃和110 ℃條件下，2 種蛋白凝膠的離子鍵質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。而在120 ℃加熱溫度下，離子鍵質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。漂洗蛋白凝膠的離子鍵在110 ℃加熱60 min處理組取得最大值，ISP蛋白凝膠的離子鍵質(zhì)量分?jǐn)?shù)在120 ℃加熱15 min處理組取得最大值，與對(duì)照組相比均顯著上升。ISP蛋白氫鍵與其離子鍵的變化趨勢(shì)一致。漂洗蛋白凝膠的氫鍵質(zhì)量分?jǐn)?shù)在110 ℃加熱15 min處理組取得最大值，ISP蛋白凝膠的氫鍵質(zhì)量分?jǐn)?shù)在120 ℃加熱15 min處理組取得最大值，和對(duì)照組相比漂洗蛋白凝膠的氫鍵質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降。漂洗蛋白凝膠的疏水相互作用和總巰基含量隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，ISP蛋白凝膠的疏水相互作用和總巰基含量隨加熱溫度和時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì)。離子鍵、氫鍵、疏水鍵和二硫鍵是維持蛋白凝膠的主要化學(xué)作用力。在魚肉蛋白斬拌過程中，鹽的加入使肌原纖維蛋白溶解，水合作用增強(qiáng)，離子鍵和氫鍵含量升高。在加熱過程中，肌球蛋白結(jié)構(gòu)展開，其內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露出來，在疏水相互作用下蛋白質(zhì)發(fā)生聚集。一般認(rèn)為凝膠中巰基含量降低是因?yàn)閹€基氧化形成了二硫鍵，因此用總巰基含量的變化表征二硫鍵的含量[30]。本實(shí)驗(yàn)中，漂洗蛋白凝膠的離子鍵、氫鍵和疏水鍵質(zhì)量分?jǐn)?shù)都在110 ℃熱處理組取得較大值，而在120 ℃熱處理組隨著加熱時(shí)間延長(zhǎng)而顯著降低，其趨勢(shì)與凝膠強(qiáng)度的結(jié)果一致。ISP蛋白凝膠的離子鍵和氫鍵的變化趨勢(shì)與漂洗蛋白凝膠類似，而疏水相互作用和總巰基含量在100 ℃熱處理組取得最大值，與凝膠強(qiáng)度的結(jié)果一致。張莉莉[14]認(rèn)為在加熱過程中疏水相互作用的減弱和二硫鍵含量的增高表明蛋白質(zhì)的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中分子間側(cè)鏈之間的締和減少，而分子鏈內(nèi)部的聚合增多，但其推測(cè)有待進(jìn)一步證實(shí)。

2.5 SDS-PAGE分析

圖4 高溫?zé)崽幚韺?duì)漂洗蛋白凝膠和ISP蛋白凝膠蛋白質(zhì)模式的影響Fig. 4 Effects of high temperature treatments on the protein pattern of washed surimi gels and ISP protein gels

漂洗蛋白凝膠（圖4A）和ISP提取蛋白（圖4B）的主要蛋白條帶是肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）、肌動(dòng)蛋白（actin，AC）和原肌球蛋白（tropomyosin，TM）；與漂洗蛋白凝膠相比，ISP提取蛋白在45～70 kDa和25 kDa附近出現(xiàn)蛋白條帶。在高溫的作用下，各熱處理組的MHC完全消失，AC、TM、肌鈣蛋白（troponin，TN）、肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）和溶解酵素（lysozyme，LYS）蛋白條帶強(qiáng)度逐漸降低，位于10～25 kDa和50～100 kDa的蛋白條帶強(qiáng)度逐漸增加，其結(jié)果與張莉莉[14]的報(bào)道一致。

肌球蛋白、AC、TM和TN同屬肌原纖維蛋白。TM是細(xì)肌絲中與AC的結(jié)合蛋白，TN和TM共同調(diào)節(jié)AC和肌球蛋白的相互作用。漂洗造成魚肉蛋白水溶性肌漿蛋白損失，而ISP提取蛋白質(zhì)的組成與魚肉的蛋白質(zhì)組成基本相似。高溫使MHC和AC等發(fā)生熱降解而生成小分子質(zhì)量的蛋白和寡肽，并且隨著加熱溫度的升高和加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，降解現(xiàn)象逐漸明顯。MHC和AC在高溫下降解是造成凝膠強(qiáng)度下降的主要原因。

3 結(jié) 論

經(jīng)過低溫凝膠化（40 ℃水浴加熱60 min）的白鰱ISP提取蛋白質(zhì)與漂洗魚糜蛋白在不同高溫（100、110、120 ℃）下加熱不同時(shí)間（15、30、60 min），在高溫加熱過程中，漂洗蛋白凝膠的破斷力隨著溫度的升高先增加后降低，而ISP提取蛋白凝膠的破斷力逐漸降低。漂洗蛋白凝膠的持水性隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，并在110 ℃加熱30 min時(shí)取得最大值；ISP蛋白凝膠的持水性各組之間無顯著性差異。漂洗蛋白凝膠的L*和W隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，ISP蛋白凝膠則呈相反趨勢(shì)，同時(shí)所有熱處理組的b*均呈上升趨勢(shì)。漂洗蛋白凝膠的離子鍵在110 ℃加熱60 min處理組取得最大值，ISP蛋白凝膠的離子鍵在120 ℃加熱15 min處理組取得最大值，和對(duì)照組相比均顯著上升。漂洗蛋白凝膠的氫鍵在110 ℃加熱15 min處理組取得最大值，ISP蛋白凝膠的氫鍵在120 ℃加熱15 min處理組取得最大值，與對(duì)照組相比漂洗蛋白凝膠的氫鍵顯著下降。漂洗蛋白凝膠的疏水相互作用和總巰基含量隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，ISP蛋白凝膠的疏水相互作用和總巰基含量隨加熱溫度和時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì)。漂洗蛋白凝膠和ISP提取蛋白的主要蛋白條帶是MHC、AC和TM；在高溫的作用下，各熱處理組的MHC完全消失，AC、TM、TN、MLC和LYS蛋白條帶強(qiáng)度逐漸降低，位于10～25 kDa和50～100 kDa的蛋白條帶強(qiáng)度逐漸增加。ISP提取蛋白凝膠的破斷力、持水性、L*值、W值、離子鍵含量均顯著低于漂洗蛋白凝膠，同時(shí)ISP提取蛋白在45～70 kDa和25 kDa附近出現(xiàn)蛋白條帶。ISP提取蛋白和漂洗魚糜蛋白以上特性的差異與2 種蛋白質(zhì)的組成和蛋白結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)。ISP提取蛋白在加工過程中，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在酸堿的作用下部分展開，內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，使其凝膠特性降低，后期可通過添加合適的外源性添加物來加強(qiáng)其膠凝特性，從而進(jìn)一步開發(fā)常溫即食ISP提取蛋白凝膠制品。