A 群輪狀病毒一步法RT-ddPCR 方法的建立

徐蕾蕊，馬 丹，魏詠新，李 丹，魏海燕，劉 莉，張西萌，汪 琦，付溥博，趙曉娟，曾 靜*

（北京海關(guān)技術(shù)中心，北京 100026）

20世紀(jì)70年代之后，各國(guó)學(xué)者相繼發(fā)現(xiàn)諾如病毒（norovirus，NoV）、輪狀病毒（rotavirus，RV）、人星狀病毒（human astrovirus，HAstV）、腺病毒、札如病毒等是引起兒童、老年人以及免疫力低下人群急性水樣腹瀉和重癥腹瀉的主要病原體[1-4]。其中，RV是世界范圍內(nèi)引起兒童急性腹瀉和兒童重癥腹瀉的最常見病毒，全球每年約有1.14億兒童發(fā)生RV腹瀉，最近監(jiān)測(cè)顯示全國(guó)范圍內(nèi)因腹瀉入院的5 歲以下兒童中RV檢測(cè)陽(yáng)性率高達(dá)47.8%[5-6]。

R V是一種R N A病毒，屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）輪狀病毒屬（Rotavrus）。RV基因組由11 條雙鏈RNA組成，共編碼11 種蛋白質(zhì)，包括6 種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1～4、VP6和VP7）和5 種非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP1～5）[7-8]。根據(jù)抗原蛋白VP6不同，RV可分為A～H八個(gè)群，只有A、B、C和H群RV能感染人類，A群RV是嬰幼兒腹瀉的主要病原體[9-10]。非結(jié)構(gòu)蛋白NSP3編碼基因序列具有高度保守性[11-12]，參與RV侵染宿主細(xì)胞過(guò)程，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[13-14]。本研究根據(jù)NSP3基因序列特征，建立檢測(cè)A群RV一步法逆轉(zhuǎn)錄微滴式數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcriptase droplet digital polymerase chain reaction，RT-ddPCR）方法，該方法不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線可實(shí)現(xiàn)A群RV的精準(zhǔn)定量，旨在為開展A群RV的流行病學(xué)調(diào)查及感染水平的定量分析提供新的技術(shù)手段和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蟶子、胡蘿卜、生食蔬菜（生菜）、冷凍桑葚 市購(gòu)。

A群RV陽(yáng)性糞便樣本（2003—2004年收集自北京兒童醫(yī)院）均為本室分離、鑒定和保存；NoV（基因型GI、GII）、HAstV、甲肝病毒RNA由本實(shí)驗(yàn)室保存。

焦碳酸二乙酯（diethyl paracabonate，DEPC）處理水北京天根生化科技有限公司；Trizol、質(zhì)粒載體pcDNAII、SuperScript?III Platinum?One-Step Quantitative RT-PCR System 美國(guó)Invitrogen公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit 德國(guó)Qiagen公司；Dynabeads?mRNA Purification Kit 美國(guó)Life Technology公司；One-step RT-ddPCR advanced kit for probes 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7900HT Fast RT-PCR儀、Veriti 96-Well Thermal Cycler 美國(guó)ABI公司； QX200 Droplet Digital PCR System 美國(guó)Bio-Rad公司；CP413電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 A群RV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備

應(yīng)用QIAamp Viral RNA Mini Kit從A群RV陽(yáng)性的生物糞便樣品中提取RNA，采用針對(duì)A群RV NSP3基因的特異性引物ATG CTC AAG ATG GAG TCT ACTC/GGT CAC ATA ACG CCCC TAT AG擴(kuò)增NSP3基因全長(zhǎng)，長(zhǎng)度1 049 bp。將該特定基因片段與pcDNAII連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNAII-RV，轉(zhuǎn)化到Top10感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，構(gòu)建含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，通過(guò)大腸桿菌的增殖，大量制備提取pcDNAII-RV；采用BamHI限制性內(nèi)切酶將pcDNAIIRV單酶切；以酶切后的線性化pcDNAII-RV為模板，通過(guò)T7啟動(dòng)子體外轉(zhuǎn)錄合成獲得A群RV NSP3基因RNA片段，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期后，根據(jù)ISO指南35∶2006[15]要求，制備A群RV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，確定該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值為（5.8±1.5）×107拷貝/μL，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物探針設(shè)計(jì)和篩選

根據(jù)A群RV VP6和NSP3基因序列，通過(guò)NCBI在線工具進(jìn)行序列分析和比對(duì)，利用Prime Express軟件V4.0（ABI, Foster City, CA, USA）設(shè)計(jì)出4 組引物和探針組合，用提取的A群RV RNA和SuperScript?III Platinum?One-Step Quantitative RT-PCR System對(duì)設(shè)計(jì)的引物探針進(jìn)行篩選。反應(yīng)參數(shù)：50 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min，95 ℃熱啟動(dòng)2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火及延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)。

1.3.3 一步法RT-ddPCR驗(yàn)證篩選的引物探針的特異性

應(yīng)用提取的A群RV RNA和NoV（基因型GI、GII）、HAstV、甲肝病毒等其他常見食源性病毒RNA進(jìn)行一步法RT-ddPCR方法擴(kuò)增，驗(yàn)證篩選的引物探針的特異性。參考One-step RT-ddPCR advanced kit for probes試劑盒說(shuō)明書配制反應(yīng)體系和生成微滴。將微滴置于Veriti 96-Well Thermal Cycler中按以下條件進(jìn)行反應(yīng)：60 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，95 ℃熱啟動(dòng)5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)；98 ℃酶滅活10 min；4 ℃ Hold。升降溫速不低于2.5 ℃/s。反應(yīng)結(jié)束后，用QX200微滴讀取儀檢測(cè)得到20 μL反應(yīng)體系中RNA的拷貝濃度。按照下式計(jì)算模板RNA拷貝濃度：

1.3.4 一步法RT-ddPCR擴(kuò)增溫度優(yōu)化

按One-step RT-ddPCR advanced kit for probes試劑盒說(shuō)明書配制反應(yīng)體系和進(jìn)行一步法RT-ddPCR檢測(cè)，以出現(xiàn)最高的陽(yáng)性微滴簇為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)退火溫度（52.5～62.5 ℃）進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.5 A群RV一步法RT-ddPCR方法學(xué)考察

1.3.5.1 定量限和準(zhǔn)確度分析

將制備的A群RV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別按稀釋倍數(shù)102、103、104、105、106、2×106、4×106和107稀釋，每個(gè)稀釋倍數(shù)各取2 μL作為模板，按One-step RT-ddPCR advanced kit for probes試劑盒說(shuō)明書配制反應(yīng)體系和進(jìn)行一步法RT-ddPCR檢測(cè)。每個(gè)梯度進(jìn)行4 個(gè)重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算各檢測(cè)梯度的相對(duì)偏差，確定各ddPCR檢測(cè)方法的定量限，分析各ddPCR檢測(cè)體系的檢測(cè)值與理論值之間的關(guān)系，驗(yàn)證其檢測(cè)準(zhǔn)確度。

1.3.5.2 重復(fù)性和復(fù)現(xiàn)性分析

將制備的A群RV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 倍梯度稀釋，取高、低兩個(gè)梯度各2 μL，按One-step RT-ddPCR advanced kit for probes試劑盒說(shuō)明書配制反應(yīng)體系和進(jìn)行一步法RT-ddPCR檢測(cè)。取3 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)平行樣品管進(jìn)行稀釋，每個(gè)樣品每個(gè)梯度重復(fù)檢測(cè)3 次，同時(shí)設(shè)置1 個(gè)空白對(duì)照（以DEPC水代替模板RNA）。每隔1 周復(fù)檢1 次，連續(xù)監(jiān)測(cè)3 次。計(jì)算組內(nèi)變異系數(shù)和組間變異系數(shù)，分析檢測(cè)方法的重復(fù)性和復(fù)現(xiàn)性。

1.3.6 不同食品基質(zhì)中的A群RV一步法RT-ddPCR檢測(cè)

采用本實(shí)驗(yàn)室保存的A群RV陽(yáng)性糞便制備染毒樣品。將該陽(yáng)性糞便樣品充分混勻后，表層、中層、底層3 個(gè)不同取樣點(diǎn)吸取100 μL樣品溶液，經(jīng)Trizol充分提取RNA后，用建立的A群RV一步法RT-ddPCR方法檢測(cè)，每個(gè)采樣點(diǎn)重復(fù)檢測(cè)5 次，采用單因素方差分析方法比較不同采樣點(diǎn)的檢測(cè)值，確定該陽(yáng)性糞便樣品中A群RV濃度，梯度稀釋制備成從高到低4 個(gè)濃度A群RV染毒液。

1.3.6.1 食品樣品類型及染毒

選取有代表性的4 種食品基質(zhì)：貝類（蟶子）、硬表面食品（胡蘿卜）、生食蔬菜（生菜）和軟質(zhì)水果（冷凍桑葚）。染毒前先檢查牡蠣樣品的外殼是否完整，提取消化腺后勻漿，分裝為2 g/份；胡蘿卜分裝為若干份，生菜和冷凍桑葚分裝為25 g/份。分別取各濃度染毒液100 μL加入分裝好的蟶子消化腺，點(diǎn)涂到胡蘿卜表面（點(diǎn)涂面積≤100 cm2），添加到分裝好的生菜和冷凍桑葚表面，室溫吸附30 min，每種食品類型的每個(gè)染毒梯度均添加3 個(gè)樣品，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3 次。

1.3.6.2 染毒樣品前處理及核酸提取

參照歐盟CEN ISO/TS 15216:2013[16]對(duì)染毒的食品樣品進(jìn)行病毒洗脫和濃縮，然后采用Trizol提取病毒RNA溶于100 μL DEPC水，再進(jìn)行一步法RT-ddPCR檢測(cè)。

1.3.6.3 回收率計(jì)算

不同濃度染毒樣品經(jīng)前處理、核酸提取、一步法RT-ddPCR檢測(cè)得到的檢出值與染毒液中A群RV理論含量的比值即為回收率，當(dāng)回收率高于1%時(shí)，認(rèn)為人工染毒樣品中模擬病毒的回收和提取有效。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)和F檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性引物探針

根據(jù)A群RV的VP6和NSP3基因序列，設(shè)計(jì)出4 組引物和探針組合。篩選結(jié)果表明：僅VP6-F2/R2/P2（序列未給出）未擴(kuò)增出靶基因（圖1）。特異性驗(yàn)證結(jié)果說(shuō)明，擴(kuò)增強(qiáng)度最大的NSP3-F1/R1/P1（序列見表1）特異性較好（圖2），故選取該組引物探針建立A群RV一步法RT-ddPCR方法。

圖1 熒光PCR方法篩選A群RV引物探針Fig. 1 Screening of primers and probes by fluorescence PCR method for RV group A strains

圖2 熒光PCR方法驗(yàn)證NSP3-F1/R1/P1特異性Fig. 2 Speci ficity veri fication of NSP3-F1/R1/P1 by fluorescence PCR method

表1 一步法RT-ddPCR引物和探針序列Table 1 Primer and probe sequences used for RT-ddPCR

2.2 A群RV一步法RT-ddPCR檢測(cè)方法的建立及退火溫度優(yōu)化

2.2.1 一步法RT-ddPCR檢測(cè)方法

應(yīng)用篩選的引物探針NSP3-F1/R1/P1，建立A群RV一步法RT-ddPCR檢測(cè)方法。該法僅能檢出A群RV RNA，出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增的微滴，其余病毒RNA均呈陰性微滴，證明該檢測(cè)方法具有良好的特異性（圖3）。

圖3 A群RV一步法RT-ddPCR體系特異性Fig. 3 Specificity of RT-ddPCR for assay of RV group A strains

2.2.2 退火溫度的優(yōu)化

退火溫度55 ℃和60 ℃均可出現(xiàn)比較明顯的陽(yáng)性微滴簇，且在55 ℃擴(kuò)增的熒光信號(hào)略高于60 ℃，因此，將55 ℃作為最佳退火溫度（圖4）。

圖4 A群RV一步法RT-ddPCR體系退火溫度優(yōu)化Fig. 4 Optimization of annealing temperature for RT-ddPCR assay of RV group A strains

2.3 A群RV一步法RT-ddPCR檢測(cè)方法的定量限和準(zhǔn)確度

將制備的A群RV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別按稀釋倍數(shù)102、103、104、105、106、2×106、4×106和107稀釋，每個(gè)稀釋倍數(shù)的理論濃度分別為580 000.00、58 000.00、5 800.00、580.00、58.00、29.00、14.50、5.80 拷貝/μL。結(jié)果表明，理論濃度為580 000.00 拷貝/μL的溶液超過(guò)了一步法RT-ddPCR的檢測(cè)范圍，其他稀釋梯度的檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為3.6%～16.0%，且理論濃度與檢測(cè)濃度之間呈線性關(guān)系，方程：Y=1.029X-11.444，R2=0.998 7，P＜0.000 1，說(shuō)明A群RV一步法RT-ddPCR檢測(cè)方法可準(zhǔn)確定量檢測(cè)A群RV RNA濃度（表2，圖5）。當(dāng)A群RV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋至5 拷貝/μL左右時(shí)，理論值與檢測(cè)體系檢測(cè)的實(shí)際值仍然接近，4 次重復(fù)的RSD均小于25%，表明該檢測(cè)體系定量限可達(dá)5 拷貝/μL。

表2 A群RV一步法RT-ddPCR檢測(cè)方法的定量限和準(zhǔn)確度Table 2 Limit of quanti fication and accuracy of RT-ddPCR

圖5 A群RV一步法RT-ddPCR檢測(cè)方法的線性關(guān)系Fig. 5 Linearity of RT-ddPCR

2.4 A群RV一步法RT-ddPCR檢測(cè)方法的重復(fù)性和復(fù)現(xiàn)性

對(duì)于濃度5.8×103拷貝/μL，組內(nèi)RSD為5.79%、6.27%和5.70%，與理論值的偏差分別為0.17%、0.43%和2.68%；濃度5.8 拷貝/μL，組內(nèi)RSD分別為10.40%、12.09%和6.01%，與理論值的偏差分別為0.52%、5.86%和3.28%（表3）。單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，2 個(gè)濃度的3 次重復(fù)檢測(cè)值之間差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明A群RV一步法RT-ddPCR檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性和復(fù)現(xiàn)性。

表3 A群RV一步法RT-ddPCR檢測(cè)方法的重復(fù)性（n=9）Table 3 Repeatability of RT-ddPCR (n= 9)

2.5 A群RV陽(yáng)性糞便樣品一步法RT-ddPCR定量結(jié)果

不同取樣部位的一步法RT-ddPCR檢測(cè)平均值相近，單因素方差分析表明，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.122），Tukey多重比較分析發(fā)現(xiàn)，不同取樣點(diǎn)定量結(jié)果之間沒有顯著差異（P＞0.05），同一取樣點(diǎn)的5 次重復(fù)取樣檢測(cè)RSD均小于15%（表4）。將不同采樣點(diǎn)檢測(cè)值的平均值作為A群RV陽(yáng)性糞便樣品的濃度，為1.579×1 06拷貝/μ L，染毒液濃度分別為1.5 7 9×1 04、1.579×103、1.579×102拷貝/μL和1.579×101拷貝/μL。

表4 A群RV陽(yáng)性糞便樣品一步法RT-ddPCR定量檢測(cè)結(jié)果Table 4 Quantitative results of RV group A strains in positive fecal samples by RT-ddPCR

2.6 不同食品基質(zhì)中A群RV一步法RT-ddPCR檢測(cè)結(jié)果

分別以蟶子、胡蘿卜、生菜和冷凍桑葚為代表的4 種食品基質(zhì)（貝類消化腺、硬表面食品、生食蔬菜和軟質(zhì)水果）的回收率分別為27.82%～53.82%、23.08%～38.27%、2.37%～7.63%和1.15%～2.73%。單因素方差分析結(jié)果表明，各染毒量中不同食品基質(zhì)的A群RV檢出量和回收率差異顯著（P＜0.001），蟶子和胡蘿卜的檢出量和回收率明顯高于生菜和冷凍桑葚。冷凍桑葚中各染毒量的回收率均小于3%，而當(dāng)實(shí)際染毒量為1 579 拷貝時(shí)，從生菜和冷凍桑葚染毒樣品檢出量的RSD大于25%，有的染毒樣品不能檢出A群RV RNA，說(shuō)明提取的RNA溶液濃度低于一步法RT-ddPCR的檢測(cè)限（表5）。進(jìn)一步進(jìn)行Tukey多重比較發(fā)現(xiàn)，各染毒劑量下，不同食品基質(zhì)之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性（P＜0.05）。

3 討 論

dPCR可將PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的熒光信號(hào)由經(jīng)典指數(shù)形式轉(zhuǎn)換為單分子信號(hào)，將檢測(cè)靈敏度提高到單分子水平[18-19]。目前，ddPCR是常見的dPCR系統(tǒng)之一，采用油包水的方式分割PCR體系為微滴，PCR后，微滴逐一通過(guò)檢測(cè)器，有熒光信號(hào)的微滴記為“1”（存在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物），無(wú)熒光信號(hào)的微滴記為“0”（不存在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物），從而產(chǎn)生“數(shù)字”的概念[20-21]。按照泊松分布原理，根據(jù)陽(yáng)性微滴的數(shù)量，計(jì)算反應(yīng)體系內(nèi)的模板拷貝數(shù)濃度，實(shí)現(xiàn)核酸的精準(zhǔn)定量[21-24]。因此，ddPCR不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增循環(huán)閾值，可直接定量檢測(cè)核酸，屬于終點(diǎn)檢測(cè)，某些程度上，擴(kuò)增不會(huì)造成定量的偏倚，對(duì)PCR抑制劑更為耐受，在改善定量分析準(zhǔn)確性和變異性上有較大優(yōu)勢(shì)[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，A群RV一步法RT-ddPCR定量檢測(cè)值與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液理論濃度相符，相關(guān)系數(shù)為0.998 7，定量范圍包括104～100拷貝/μL 5 個(gè)數(shù)量級(jí)，定量限可達(dá)5 拷貝/μL，檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性和復(fù)現(xiàn)性。

不同的食品基質(zhì)A群RV的污染方式不同[27]：貝類通過(guò)濾食將水體中的A群RV濃縮到消化腺內(nèi)，水果（包括硬表面水果和軟質(zhì)水果）和生食蔬菜等通過(guò)澆灌含有A群RV的肥料和灌溉水被污染；此外，食品中蛋白質(zhì)、多糖等某些大分子物質(zhì)，能直接影響病毒洗脫、RNA提取及分子檢測(cè)過(guò)程，影響定量檢測(cè)結(jié)果，因此不同的食品基質(zhì)需要采用針對(duì)性的前處理方法以洗脫和濃縮病毒顆粒。本研究參照歐盟的CEN ISO/TS 15216:2013[16]對(duì)染毒的食品樣品進(jìn)行洗脫和濃縮。通過(guò)計(jì)算檢出量和回收率發(fā)現(xiàn)，不同食品基質(zhì)中存在顯著差異（P＜0.001），且蟶子和胡蘿卜明顯高于生菜和冷凍桑葚，而低染毒量時(shí)，部分生菜和冷凍桑葚染毒樣品未檢出A群RV RNA，說(shuō)明食品基質(zhì)對(duì)A群RV一步法RT-ddPCR定量檢測(cè)量有較大影響。

貝類中病毒洗脫和濃縮主要通過(guò)將貝類消化腺撕裂后，采用蛋白酶K和65 ℃高溫處理相結(jié)合的方法破壞消化腺組織，釋放病毒顆粒[28]，再超速離心濃縮病毒顆粒，直接提取RNA。該方法已成功在0.15 g牡蠣消化組織中檢測(cè)出諾如病毒[29-30]，相對(duì)于采用異硫氰酸酯/苯酚為主的試劑直接提取食品中的食源性病毒RNA方法回收率更高[31-32]。洗脫液的pH值對(duì)軟質(zhì)水果與生食蔬菜中食源性病毒顆粒的洗脫效果影響比較大，通常采用堿性緩沖液（pH≥9）洗脫此類食品表面的食源性病毒[33]。同時(shí)采用牛肉膏和甘氨酸減少病毒顆粒對(duì)食品基質(zhì)的非特異性吸附，可分別使此類樣品中的食源性病毒回收率提高數(shù)倍[34]。草莓、桑葚等軟質(zhì)水果含有的果膠會(huì)影響洗脫效果，需要采用果膠酶破壞這些果膠分子，保證這類軟質(zhì)水果的洗脫效率。硬表面食品的范圍可包括堅(jiān)果、蘋果、胡蘿卜等多種食品類型，它們的共同點(diǎn)是表面比較堅(jiān)硬，可通過(guò)棉拭子擦拭法將食品表面吸附的病毒顆粒擦拭下來(lái)，操作簡(jiǎn)便，具有相當(dāng)?shù)幕厥章省?/p>

定量食品中的A群RV需要將病毒與食品基質(zhì)分離、濃縮，得到病毒懸液，提取RNA后，用A群RV一步法RT-ddPCR進(jìn)行檢測(cè)。在不考慮病毒分離、濃縮效率和RNA核酸提取效率時(shí)，本研究建立的A群RV一步法RT-ddPCR定量檢測(cè)方法的檢測(cè)限可達(dá)到5 拷貝/μL。但病毒濃縮、RNA提取的過(guò)程中存在回收率和RNA提取效率未知等不確定因素，很難檢測(cè)到食品中可能存在的全部病毒核酸，因此利用一步法RT-ddPCR方法檢測(cè)的病毒核酸含量不等于實(shí)際樣品中食源性病毒的實(shí)際載量。后續(xù)研究中，需要建立一種簡(jiǎn)便可操作性強(qiáng)的過(guò)程控制程序監(jiān)控病毒濃縮、核酸提取過(guò)程，反映實(shí)際樣品中A群RV回收率，并且通過(guò)回收率計(jì)算樣品中A群RV的實(shí)際載量。