實時PCR 技術(shù)在羊亞科肉類鑒定中的應用

尚 柯，梁恒興，張 彪，段慶梓，王 巍，張 玉

（成都市食品藥品檢驗研究院，四川 成都 610045）

羊肉作為一種優(yōu)良的畜肉，屬于高蛋白、低脂肪、低膽固醇類營養(yǎng)保健食品，有著悠久的食用歷史[1]。我國的肉類生產(chǎn)以豬肉為主，隨著生活水平的提高，豬肉產(chǎn)量的比例逐年下降，而牛、羊等高價格肉類產(chǎn)量逐年上升，在2015年羊肉產(chǎn)量達到了肉類產(chǎn)量的7%[2]。目前，我國的羊肉市場以綿羊、山羊為主，同時部分地區(qū)，如貴州、云南等地也生產(chǎn)與食用麻羊等[3]。羊肉中的賴氨酸、精氨酸、組氨酸含量明顯高于豬、牛、雞等肉類，且膽固醇含量僅有豬、牛的1/3甚至1/4，同時羊肉易于消化吸收，深受消費者喜愛[4-5]。

近年來，政府及消費者對肉及肉制品的產(chǎn)品質(zhì)量和食用安全越來越重視，但不法商販在肉制品生產(chǎn)（加工）中進行肉質(zhì)摻偽、造假的現(xiàn)象仍屢有發(fā)生，這一摻假造假現(xiàn)象在羊肉制品中表現(xiàn)較為突出[6]。摻假的方式越來越多，形式越來越復雜[7]。目前，肉制品的摻假主要表現(xiàn)為原料肉摻假、組織替換等[8]，鴨肉冒充羊肉事件、歐洲馬肉門事件、巴西肉類丑聞、阿膠用豬皮制作、歐洲魚肉事件層出不窮[9-10]，“掛羊頭賣狗肉”的肉類摻假摻雜事件近年來屢被曝光。這些食品問題嚴重地侵害了消費者的合法利益，給肉制品食用安全帶來潛在危害，同時也對民族宗教信仰帶來較大的風險[11]。

DNA雜交、免疫擴散和等電點聚焦等方法曾經(jīng)被用于肉類品種鑒定[12]，但這些方法大都存在成本高、基質(zhì)單一、對檢測對象要求高、工作量大、無法檢測深加工肉類等缺點[13]。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，目前從基因角度檢測物種的真實屬性已經(jīng)成為主流檢測技術(shù)，規(guī)避了性狀檢測、蛋白檢測、化學成分檢測所存在的諸多局限[14]。Nataliav等[15]利用雞尾酒引物實現(xiàn)了物種的通用擴增，采用條形碼技術(shù)鑒定肉類的成分；Guan Feng等[16]采用八重聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）方法，可區(qū)分山羊、綿羊、鹿、水牛、牛、牦牛、豬和駱駝；馮海永等[17]采用七重PCR檢測方法，可區(qū)分豬、牛、綿羊、山羊、雞、馬和牦牛7 種動物；楊冬燕等[18]對國外現(xiàn)有方法進行優(yōu)化與完善，建立了豬、馬、牛、鴨多重實時PCR（real-time PCR）檢測體系，用于檢測羊肉制品摻假情況；熊蕊等[19]采用限制性片段長度多態(tài)性PCR技術(shù)，可從牛羊肉中檢測豬源性成分。但這些方法均存在一定的局限性，普通PCR方法及DNA條形碼技術(shù)由于操作繁瑣，準確度與靈敏度不高，對樣本及實驗設備要求高，易造成污染等問題，不適于檢測技術(shù)發(fā)展的需要[20]；目前已建立的實時熒光檢測技術(shù)大多僅針對某一種羊肉進行檢測，無法確定羊肉的具體種類[21]。

為提高肉制品中羊源性成分檢測方法的可操作性，建立建全羊肉具體種類的檢測方法，本實驗針對山羊、綿羊、麻羊3 種食用羊的基因序列，分別建立綿羊、山羊、羊亞科的專屬性real-time PCR檢測方法，對羊肉制品中的羊源性成分進行檢測，以期為監(jiān)管部門提供技術(shù)手段與數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用樣品包括確定基原的對照物種20 種，以及市場采購樣品20 種。樣品采自養(yǎng)殖廠、研究所、農(nóng)貿(mào)市場、電商、超市等。所有樣品通過合成引物[22-23]進行線粒體基因測序驗證，保證樣品的真實性。樣品的具體信息見表1。

表1 樣品信息Table 1 Detailed information about the samples tested in this study

續(xù)表1

動物基因組提取試劑盒 上海捷瑞生物工程有限公司；實時熒光PCR擴增試劑盒：Bio-Rad SsoAdvancedTMUniversal Probes Supermix、Tiangen SuperReal PreMix(Probe)、TransStart?Probe qPCR SuperMix、TaKaRa Premix ExTaqTM(Probe qPCR)。

1.2 儀器與設備

Applied Biosystems Veriti II PCR儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；CFX96 Touch實時熒光PCR儀、PowerPac電泳儀 美國Bio-Rad公司；GelDoc-It凝膠成像儀 美國UVP公司；Centrifuge 5427 R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；ME2002E電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；MK3渦旋振蕩器 德國IKA公司；P330核酸蛋白定量儀 德國Implen公司；MM400行星球磨儀 德國Retsch公司；Milli-Q Academic實驗室超純水儀美國Millipore公司；Thermo-Shaker BG-100干式恒溫器杭州瑞誠儀器有限公司；SW-CJ-FD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物及探針

將GenBank數(shù)據(jù)庫中山羊、綿羊以及其他18 種動物的cyt b基因序列運用生物軟件進行比對分析，選擇山羊（EU130780.1）、綿羊（KP228916.1）、羊亞科（MF503655.1）的基因序列進行引物和探針的設計。引物及探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。探針熒光基因為FAM，淬滅基團為BHQ1，最終確定的引物組具體序列見表2。

表2 引物信息Table 2 Sequences of PRC primers and probes

1.3.2 real-time PCR方法建立

按照試劑盒說明書對樣品進行基因組提取，用核酸蛋白定量儀確定DNA提取的效率與純度，進行OD260nm/OD280nm值測定，測得值均在1.7～2.0之間，表明可用于PCR實驗。real-time PCR包括10 μL 2×SsoFast Advanced Supermix real-time PCR預混液、DNA模板、可變引物和探針量以及去離子水，其體積為20 μL。通過改變引物濃度、探針濃度和退火溫度進行方法的篩選與建立。引物終濃度分別為25、50、100 nmol/L和150 nmol/L，探針終濃度分別為5、12.5、25 nmol/L和50 nmol/L，退火溫度分別為56、58、60、62 ℃和64 ℃。

1.3.3 特異性實驗

以20 種基原動物基因組DNA（JY-1～JY-20）為模板，用建立的real-time PCR方法進行擴增，評價特異性。陽性、陰性和空白對照在實驗中同步進行，進行質(zhì)量控制。

1.3.4 靈敏度實驗

對模板DNA進行倍比稀釋，質(zhì)量濃度設定為10-4、10-3、10-2、10-1、100、101ng/μL。作為反應模板進行擴增反應，確定模板DNA質(zhì)量濃度范圍與Ct值線性關系，同時根據(jù)原理，參考文獻[24]建立擴增效率計算公式：擴增效率/%=（lg稀釋倍數(shù)/lg2）/|標曲斜率|×100，并建立本方法的判定原則。

1.3.5 檢出限實驗

分別將山羊、綿羊肉樣品以1%、0.1%、0.01%三個水平摻入雞肉樣品中，充分混勻后，提取基因組DNA，作為檢測模板，分別使用山羊、綿羊、羊亞科檢測體系進行肉樣水平檢出限檢測。

1.3.6 試劑一致性考察

考察不同公司實時熒光預混液對檢測結(jié)果的一致性，分別進行常見品牌的實時熒光預混液比對實驗，確定不同試劑盒對檢測結(jié)果的影響。檢測體系僅替換real-time PCR預混液，其他條件均一致。

1.3.7 加工肉制品Ct值變化

確定肉制品影響DNA質(zhì)量的主要是殺菌環(huán)節(jié)。目前，國內(nèi)肉制品企業(yè)的殺菌方式主要為高溫殺菌、巴氏殺菌、輻照殺菌等。據(jù)此，采用對DNA影響最大的高溫殺菌方式對樣品進行處理，確定殺菌工藝對DNA質(zhì)量的影響，以及本方法是否適用于加工后的肉制品。聯(lián)系肉制品生產(chǎn)企業(yè)獲取加工前綿羊、山羊生肉原料及最終成品肉制品，提取DNA后，依照建立的方法分別進行檢測。

1.3.8 方法適用性考察

對不同產(chǎn)地、不同基質(zhì)的肉及肉制品（表1）進行檢測，確定3 種檢測方法的適用性。1.3.9 方法驗證

為了保證方法的一致性和可重復性，起草組制定驗證工作方案，邀請了山東省食品藥品檢驗研究院、中國檢驗檢疫科學研究院、北京市食品安全監(jiān)控和風險評估中心、河北省食品檢驗研究院、國家副食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心5 家檢測機構(gòu)進行方法驗證，由驗證單位獨立完成從DNA提取到結(jié)果判定的全過程驗證實驗。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

使用Bio-Rad CFX Manager 3.0.1224.1015軟件制作real-time PCR結(jié)果圖譜，使用Microsoft Excel 2007軟件對real-time PCR數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并繪制相關的數(shù)據(jù)分析圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針的設計篩選

圖1 山羊目標序列比對分析Fig. 1 Target sequence alignment analysis of Capra

根據(jù)引物設計原則，利用DNAStar軟件設計山羊、綿羊、羊亞科通用的引物探針，并對各物種的引物及探針進行序列高級結(jié)構(gòu)分析比對，以確保其高度的特異性，防止出現(xiàn)二聚體、莖環(huán)及發(fā)卡等影響檢測效率的結(jié)構(gòu)。具體信息見圖1～3。

圖3 羊亞科目標序列比對分析Fig. 3 Target sequence alignment analysis of Caprinae

2.2 real-time PCR方法建立

表3 real-time PCR體系篩選與建立（Ct值）Table 3 Screening and establishment of real-time fluorescence PCR

分別進行引物濃度篩選、探針濃度篩選和退火溫度篩選，具體信息見表3。最終確定的real-time PCR方法為：PCR預混液（2×）10 μL，5’端、3’端引物（10 μmol/L）各0.2 μL，探針（10 μmol/L）0.1 μL，DNA模板（1～100 ng/μL）1 μL，用無菌雙蒸水補足20 μL。PCR擴增程序為：95 ℃預變性5 min；35 個循環(huán)（95 ℃變性15 s，58 ℃退火及延伸1 min，收集熒光）。

2.3 特異性結(jié)果

特異性實驗結(jié)果顯示，相應動物源性成分有典型擴增曲線且Ct值均小于25，其他動物源性成分均未檢出，實驗結(jié)果理想，均能達到檢測要求，其中羊亞科源性檢測可同時檢測綿羊、山羊、麻羊。具體檢測情況見圖4。

圖4 特異性檢測圖譜Fig. 4 Specificity evaluation

2.4 靈敏度結(jié)果

在Ct值小于或者等于30時，靈敏度均可達10-3ng/μL，滿足多種檢測要求，在線性范圍內(nèi)均有良好的線性關系，山羊、綿羊、羊亞科檢測方法的R2分別為0.999、0.997、0.999，擴增效率分別為99.37%、92.48%、96.32%。具體檢測情況見圖5。

圖5 靈敏度實驗圖譜Fig. 5 Sensitivity evaluation

2.5 檢出限結(jié)果

圖6 檢出限實驗圖譜Fig. 6 Detection limit evaluation

圖6 及表4顯示，在雞肉中摻入1%、0.1%的山羊、綿羊肉時，本方法檢測Ct值均小于30。而在0.01%的摻入比例實驗時，相應Ct值接近甚至超過30 個循環(huán)，對其判定可能會出現(xiàn)偏差。根據(jù)以上驗證結(jié)果，本方法的檢出限為0.1%。

表4 檢出限檢測結(jié)果Table 4 Detection limit validation

2.6 試劑一致性分析

選擇Bio-Rad SsoAdvancedTMUniversal Probes Supermix、Tiangen SuperReal PreMix(Probe)、TransStart?Probe qPCR SuperMix、TaKaRa Premix ExTaqTM(Probe qPCR) 4 種real-time PCR預混液對方法進行重復性考察，結(jié)果顯示，不同試劑表現(xiàn)出一致的檢測結(jié)果，表明本方法的試劑一致性較好，常用實時熒光預混液均適用于本方法的檢測。具體情況見圖7及表5。

圖7 試劑一致性實驗圖譜Fig. 7 Reagent consistency evaluation

表5 試劑一致性結(jié)果（Ct值）Table 5 Reagent consistency validation

2.7 加工肉制品Ct值變化情況分析

如圖8所示，原料肉與最終產(chǎn)品檢測結(jié)果存在一定的差異，但加工后的成品與原料肉相比Ct值差異在3以內(nèi)，且Ct值均在30以下，有典型擴增曲線，不影響結(jié)果的判斷。因此，本方法適用于生鮮肉及肉制品的檢測。

圖8 生鮮肉與加工肉制品real-time PCR結(jié)果比較Fig. 8 Comparison of real-time PCR results of raw meat and processed meat

2.8 方法適用性分析

山羊、綿羊、羊亞科源性成分檢測的10 個樣品3 個濃度水平Ct值均小于30，且具有典型擴增曲線，適用性實驗結(jié)果符合預期，滿足檢測要求，見圖9及表6。

圖9 適用性實驗圖譜Fig. 9 Applicability evaluation

表6 適用性檢測結(jié)果（Ct值）Table 6 Applicability validation

2.9 方法驗證

由成都市食品藥品檢驗研究院提供驗證樣品580 個，其中特異性驗證樣品100 個，適用性驗證樣品300 個，靈敏度驗證樣品90 個，檢出限驗證樣品90 個；由驗證單位獨立完成從DNA提取到結(jié)果判定的全過程驗證試驗。5 家驗證單位均獲得了滿意的驗證結(jié)果，驗證匯總結(jié)果見表7。

表7 驗證結(jié)果匯總Table 7 Summary of validation results from five domestic authoritative institutions

3 結(jié) 論

鑒于肉類摻假現(xiàn)象的出現(xiàn)，基于DNA的肉類鑒定方法已成為食品真實性鑒定的首選方法[25]。本研究開發(fā)并驗證了羊亞科3 種real-time PCR檢測普通肉制品的方法，分別為羊亞科通用檢測方法、山羊檢測方法及綿羊檢測方法。這些方法特異性強、靈敏度高、適用性強，可用于羊肉類原料及加工肉的鑒別，以及肉制品中羊源性成分的檢測。3 種方法的反應體系及檢測步驟一致，可在一次real-time PCR實驗中同步完成3 種方法的檢測。結(jié)果表明，該方法是一種高效、靈敏、特異、高實用性的羊亞科專屬性鑒別方法。

本方法以real-time PCR探針法為基礎，從基因水平對肉類DNA進行檢測。real-time PCR技術(shù)利用熒光基團的淬滅與激發(fā)[26]，在反應過程中可以通過熒光信號反映DNA擴增情況，在實驗過程中對反應情況進行實時監(jiān)測[27]，擴增反應結(jié)束，直接獲得檢測結(jié)果。整個過程閉管操作，不需要進行酶切、染色、電泳、測序等傳統(tǒng)PCR方法所需的繁瑣步驟，縮短了檢測時間，提高了檢測效率，減少了后續(xù)實驗的污染以及染色試劑對操作人員造成的潛在危害[28]。

本方法的成功依賴于以下3 個方面：適當?shù)陌谢蛭稽c、專屬性極強的引物和探針以及DNA真實性考察。首先，根據(jù)在動物物種中高度保守且母體遺傳的cyt b基因[29]，并對20 個物種進行了目的基因序列比對，以確保該方法的有效性。其次，用DNAStar v7.1.0.44軟件[30]設計了針對目標物種特定DNA序列的引物和探針，并對高級結(jié)構(gòu)進行分析，以確保引物與探針不存在莖環(huán)及發(fā)夾等影響擴增效率的結(jié)構(gòu)[31]。通過豬、牛、綿羊、雞、鴨、鵝等20 個物種的特異性鑒定，驗證了所有引物和探針的特異性，保證了方法的特異性。最后，本實驗所用的動物肉類樣品和PCR產(chǎn)物均經(jīng)過測序驗證，以確保樣品的真實性[32]，整個方法依據(jù)分子生物學標準流程進行設計、優(yōu)化與驗證[33]。

本研究的目的是建立一種快速、高通量的real-time PCR方法，以鑒定市場上銷售的肉制品的羊源性成分。因此，在建立了羊亞科3 種檢測方法后，本實驗邀請了5 家中國權(quán)威的檢測機構(gòu)對該方法進行系統(tǒng)、科學地驗證。在驗證之前，實驗設計了方法驗證的內(nèi)容和步驟，包括方法的特異性、適用性、靈敏度、擴增效率和檢出限。聯(lián)合驗證的結(jié)果表明，該方法的特異性滿足預期，僅能擴增目標物種，不能擴增其他非目標物種；方法的擴增效率達90%以上，檢出限均可達0.1%；此外，對真實的市售產(chǎn)品進行檢測，檢測準確率達100%，方法適用性滿足檢測要求。鑒于這些方法是基于real-time PCR原理進行開發(fā)，希望增加定量檢測方法，為肉制品的真實性鑒定和摻假提供了更加準確和科學的檢測方法，為監(jiān)管部門提供技術(shù)標準與檢測依據(jù)。