QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-同位素內(nèi)標(biāo)法快速測定茶葉中氟蟲腈及其代謝物殘留量

倪韻晨，徐小民*，黃百芬，徐美佳，李祖光*

（1.浙江工業(yè)大學(xué)教育科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.浙江省疾病預(yù)防控制中心理化毒理所，浙江 杭州 310051；3.浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310014）

氟蟲腈是一種苯基吡唑類殺蟲劑，主要用于殺滅土壤中鞘翅目害蟲的幼蟲，同時(shí)用以消除蚤、虱、蜱、蟑螂及螨等昆蟲[1-2]。氟蟲腈通過環(huán)境或生物轉(zhuǎn)化會產(chǎn)生氟甲腈、氟蟲腈亞砜和氟蟲腈砜等代謝物[3-4]。有研究表明其代謝物相對于氟蟲腈具有更持久的穩(wěn)定性[5]，且經(jīng)過對氟甲腈、氟蟲腈亞砜和氟蟲腈砜3 種代謝物的研究表明，其毒性高于氟蟲腈原藥[6]，因此，氟蟲腈的代謝物更容易導(dǎo)致食品中的農(nóng)藥殘留問題[7-8]。各國對氟蟲腈的限量值作了嚴(yán)格規(guī)定，其中日本與歐盟茶葉中的限量值分別為2 μg/kg[9]與5 μg/kg[10]，且只限于氟蟲腈而不涉及其他代謝物。我國GB 2763—2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》制定了氟蟲腈在蔬菜、除糙米外的谷類等農(nóng)產(chǎn)品中的限量值分別為20 μg/kg與100 μg/kg，并以氟蟲腈、氟甲腈（MB46513）、氟蟲腈砜（MB46136）、氟蟲腈亞砜（MB45950）之和計(jì)算[11]，但沒有規(guī)定茶葉中氟蟲腈的限量值。氟蟲腈內(nèi)標(biāo)與氟蟲腈及其代謝物化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 氟蟲腈-13C2,15N2同位素內(nèi)標(biāo)與氟蟲腈及其代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of fipronil-13C2,15N2, fipronil and its metabolites

茶葉中氟蟲腈及其代謝物的檢測方法有氣相色譜法[12-13]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用法[14-15]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GCMS/MS）法[16]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[17]等。提取溶劑主要包括丙酮-正己烷混合溶劑[12,14-15]或乙腈[13,16-17]。前處理主要采用固相萃取[8,12-13,15-16]或固相微萃取[14]。除了周昱等[14]開發(fā)的固相萃取前處理技術(shù)與GC-MS的檢測方法可同時(shí)定量檢測氟蟲腈及其代謝物，其他方法只能定量檢測氟蟲腈一種成分?，F(xiàn)有方法主要為外標(biāo)法定量，外標(biāo)法對操作條件的穩(wěn)定性和進(jìn)樣的重現(xiàn)性要求較高。榮杰峰等[15]采用固相萃取-GC-MS法檢測氟蟲腈的定量限為1 μg/kg，周昱等[14]采用固相微萃取-GC-MS法檢測氟蟲腈及其代謝物的定量限為1～4 μg/kg。雖然可通過高靈敏度的分析儀器或者大體積進(jìn)樣以降低定量限[15]，然而更多的進(jìn)樣量可能導(dǎo)致嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng)或者儀器污染等問題。

QuEChERS技術(shù)[18-19]自發(fā)明以來廣泛應(yīng)用于植物源性食品農(nóng)藥殘留分析，以乙腈作為提取溶劑，前處理時(shí)間短且操作過程簡單。采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，一定程度上消除了操作條件的變化所引起的誤差，測定結(jié)果準(zhǔn)確，可同時(shí)定量檢測氟蟲腈及氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜3 種代謝物。除此之外，QuEChERS技術(shù)與抗干擾能力強(qiáng)的二級質(zhì)譜聯(lián)用，不僅克服了基質(zhì)的干擾和假陽性問題，并且使二級質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn)得到充分發(fā)揮[15]。本方法采用氟蟲腈-13C2,15N2同位素內(nèi)標(biāo)（化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1）法對茶葉中氟蟲腈及其代謝物進(jìn)行QuEChERS-GC-MS/MS定量測定。在較簡單、快速的前處理?xiàng)l件下完成對氟蟲腈及其代謝物的準(zhǔn)確定量，氟蟲腈及其代謝物的方法的定量限均可達(dá)到1 μg/kg，能夠滿足歐盟與日本的殘留限量要求的同時(shí)，適合于茶葉中痕量氟蟲腈及其代謝物殘留的快速分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜（純度＞95%）德國Dr. Ehrenstorfer公司；氟蟲腈-13C2,15N2（同位素內(nèi)標(biāo)，純度＞98%） 加拿大TRC公司；乙腈、丙酮（均為色譜純） 美國Fisher Chemical公司；環(huán)己烷（色譜純）美國貝克公司；NaCl（分析純） 廣東光華科技公司；無水MgSO4（分析純） 江蘇永華化學(xué)科技公司；N-丙基乙二胺（N-propyl ethylenediamine，PSA，分析純）天津博納艾杰爾科技公司；石墨化碳黑（graphite carbon black，GCB，分析純） 美國Supelco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TQ-8040 GC-MS/MS聯(lián)用儀 日本島津公司；高速粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；WH-861旋渦混合器太倉華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MTN-5800氮吹濃縮裝置天津市津南八里臺微電子公司；V-125AllegraTMX-22R離心機(jī) 德國Beckman Coulter公司；HC-3018高速離心機(jī)安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GC條件

色譜柱：Rxi-5Sil（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：50 ℃保持1 min，以20 ℃/min升至200 ℃，以40 ℃/min升至250 ℃，保持3 min，以40 ℃/min升至280 ℃，保持6 min；進(jìn)樣口溫度：240 ℃；載氣（He）壓力70 psi，進(jìn)樣量1 μL；不分流進(jìn)樣。

1.3.2 MS/MS條件

電子電離源；多反應(yīng)離子監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM），離子源溫度為200 ℃；接口溫度為250 ℃；溶劑延遲為6 min。氟蟲腈及其代謝物的保留時(shí)間、定量離子和定性離子見表1。

表1 氟蟲腈及其代謝物的GC-MS/MS分析條件參數(shù)Table 1 Analytical parameters of fipronil and its metabolites by GC-MS/MS

1.3.3 基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線

氟蟲腈及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：用丙酮配制成1 000 mg/L的單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再用環(huán)己烷-丙酮（1∶1，V/V）逐級稀釋，配制成2.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。

氟蟲腈-13C2,15N2內(nèi)標(biāo)使用液：用丙酮配制成1 000 mg/L的內(nèi)標(biāo)儲備液，再用環(huán)己烷-丙酮（1∶1，V/V）逐級稀釋，配制成2.00 mg/L的內(nèi)標(biāo)使用溶液。

基質(zhì)校正曲線：用質(zhì)量濃度為0、0.4、0.8、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，分別溶解于經(jīng)過凈化氮吹至近干后的空白樣品基質(zhì)，同時(shí)分別添加氟蟲腈-13C2,15N2內(nèi)標(biāo)使用液10 μL，配制基質(zhì)匹配系列校正溶液。以氟蟲腈及其代謝物的質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)（X），氟蟲腈及其代謝物儀器檢測的峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)（Y），制作基質(zhì)校準(zhǔn)曲線。

1.3.4 樣品前處理

樣品預(yù)處理：茶葉樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎混勻，制備好的試樣裝入潔凈食品塑料袋中保存。

提取：稱取2 g（精確至0.01 g）樣品至50 mL離心管中，加2.00 mg/L氟蟲腈-13C2,15N2內(nèi)標(biāo)使用液50 μL，加2 mL水和10 mL乙腈，渦旋10 min，超聲10 min，加1 g NaCl和2 g MgSO4，混勻，8 000 r/min離心2 min。

凈化：取全部上清液至已添加200 mg無水MgSO4、PSA和GCB的10 mL塑料離心管中，渦旋1 min，8 000 r/min離心2 min。取凈化液2 mL于玻璃試管中，氮吹至近干，用1 mL環(huán)己烷-丙酮（1∶1，V/V）溶解殘?jiān)? 000 r/min離心2 min，取上清液，待測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

以氟蟲腈為例，其內(nèi)標(biāo)法的計(jì)算方法為以1.3.3節(jié)方法制作的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知含量的樣品進(jìn)行定量，標(biāo)準(zhǔn)曲線通用表達(dá)式見式（1），x、y具體計(jì)算見式（2）、（3）：

式中：a為斜率；b為截距；y為氟蟲腈峰面積（Af）與氟蟲腈-13C2,15N2（Af-IS）內(nèi)標(biāo)的峰面積比值；x為氟蟲腈含量（xf）與氟蟲腈-13C2,15N2（xf-IS）內(nèi)標(biāo)的含量比值。

因樣品中提前加入了確定濃度的氟蟲腈內(nèi)標(biāo)，故未知濃度的樣品中氟蟲腈含量計(jì)算見式（4）：

本研究的氟蟲腈及其代謝物的定量計(jì)算按照G B 2 7 6 3—2 0 1 6的要求，以氟蟲腈、氟甲腈（MB46513）、氟蟲腈砜（MB46136）、氟蟲腈亞砜（MB45950）之和計(jì)算[11]，見式（5）：

式中：xA為氟蟲腈及其代謝物的總含量；x1、x2、x3、x4分別為氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈與氟蟲腈砜的含量，該含量均為內(nèi)標(biāo)法計(jì)算得到。

根據(jù)所得數(shù)據(jù)，柱狀圖采用GraphPad Prism 5軟件制作完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

除乙腈外，丙酮是QuEChERS法中另外一種較為常用的提取溶劑。與乙腈相比，丙酮揮發(fā)性更強(qiáng)，大大縮短了樣品濃縮所需的時(shí)間[20]。付曉芳等[13]研究了乙腈和丙酮對茶葉中氟蟲腈的提取回收率，均獲得了滿意的結(jié)果（81.49%～94.43%）。本實(shí)驗(yàn)的被測物包括氟蟲腈及3 種代謝物，實(shí)驗(yàn)中對比考察乙腈、丙酮及兩者組成的混合溶劑對茶葉中氟蟲腈及其代謝物的提取效果。在添加量25 μg/kg的條件下，分別比較乙腈-丙酮為1∶0、1∶1、2∶8（V/V）的混合溶劑對茶葉的提取效果，結(jié)果見表2，3 種提取液均符合回收率要求，但丙酮比例高時(shí)，提取液顏色較深，雜質(zhì)較多，故選擇純乙腈作為提取液。

表2 不同配比溶劑對茶葉中氟蟲腈及其代謝物的提取回收率（n=3）Table 2 Recoveries of fipronil and its metabolites in tea extracted with different solvents (n= 3)

PSA通過陰離子交換吸附蛋白質(zhì)、糖類和極性較高的酸性物質(zhì)[21]。在凈化茶葉過程中，PSA具有去除茶葉中色素和長鏈脂肪酸等干擾物質(zhì)的良好效果[22-24]。且各種農(nóng)藥的回收率與PSA用量之間相關(guān)性不大，考慮茶葉樣品的復(fù)雜性，參照原始QuEChERS方法的用量，將PSA的用量定為每1 mL提取液使用25 mg PSA凈化[25]。為了加強(qiáng)儀器的維護(hù)，在PSA的基礎(chǔ)上再加上一種吸附劑——C18或GCB[26]。GCB作為非極性吸附劑，能夠有效去除疏水性的化合物，如色素和甾醇等[27]?？紤]到GCB具有良好的去除茶葉色素的能力，實(shí)驗(yàn)比較了加入GCB的凈化效果。如圖2所示，GCB能有效去除茶葉中的色素。根據(jù)回收率和基質(zhì)效應(yīng)優(yōu)化，分散固相萃取填料的用量為PSA 200 mg和GCB 200 mg。

圖2 不同凈化條件下的提取液對比Fig. 2 Comparison of extracts purified under two different cleaning conditions

2.2 內(nèi)標(biāo)特征離子的選擇

圖3 氟蟲腈及其代謝物（5 μg/kg）的基質(zhì)加標(biāo)MRM色譜圖Fig. 3 MRM chromatograms for matrix-matched standards of fipronil and its metabolites (5 μg/kg)

氟蟲腈-13C2,15N2同位素內(nèi)標(biāo)與氟蟲腈無法用色譜分開（圖3），且兩者之間只差4 個(gè)質(zhì)量數(shù)，從圖4和圖5可以看出，內(nèi)標(biāo)的基峰m/z371會受氟蟲腈同位素峰的干擾，本實(shí)驗(yàn)采用同位素內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜次高峰m/z373作為母離子建立MRM條件，以消除氟蟲腈同位素峰的干擾。

圖4 氟蟲腈全掃描質(zhì)譜圖Fig. 4 Full-scan mass spectrum of fipronil

圖5 氟蟲腈-13C2,15N2全掃描質(zhì)譜圖Fig. 5 Full-scan mass spectrum of fipronil-13C2,15N2

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

質(zhì)譜分析中基質(zhì)干擾物會影響目標(biāo)化合物的離子化，造成目標(biāo)化合物儀器響應(yīng)信號的增強(qiáng)或抑制[28]。在相同加標(biāo)水平下，基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算公式如下：

式中：A為純?nèi)軇┲修r(nóng)藥的響應(yīng)值；B為樣品基質(zhì)中添加的相同含量農(nóng)藥響應(yīng)值；基質(zhì)效應(yīng)＞100%時(shí)，為基質(zhì)增強(qiáng)；基質(zhì)效應(yīng)＜100%時(shí)，為基質(zhì)抑制；基質(zhì)效應(yīng)=100%時(shí)，無基質(zhì)增強(qiáng)或抑制效應(yīng)[29-30]。一般情況下，基質(zhì)效應(yīng)在80%～120%范圍內(nèi)為宜。

采用上述方法衡量茶葉基質(zhì)對氟蟲腈及其代謝物儀器測定值的影響，空白基質(zhì)提取液采用1.3.3節(jié)的處理方法制備，比較25、200 μg/kg兩個(gè)添加水平下基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測物的儀器檢測峰面積，每個(gè)平行測定3 次。

結(jié)果表明，茶葉中氟蟲腈及其代謝物在2 種不同添加量（25、200 μg/kg）下的基質(zhì)效應(yīng)在84.7%～111.7%（圖6），因此，本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線以提高氟蟲腈及其代謝物定量分析的準(zhǔn)確性。

圖6 不同添加量氟蟲腈及其代謝物的基質(zhì)效應(yīng)Fig. 6 Matrix effects of fipronil and its metabolites at two different spiked concentrations

2.4 線性范圍與定量限

系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液采用1.3.3節(jié)的方法制備，并制作基質(zhì)匹配的校準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表3，氟蟲腈及其代謝物在0.4～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均不小于0.995。氟蟲腈及其代謝物檢出限和定量限分別按信噪比3和10計(jì)算，結(jié)果均分別為0.3 μg/kg和1 μg/kg。定量限水平基質(zhì)加標(biāo)的色譜圖見圖7，采用本方法前處理凈化，GC-MS/MS測定，茶葉基質(zhì)未見明顯干擾峰。

表3 氟蟲腈及其代謝物的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Table 3 Regression equations, correlation coef ficients and linear rangers for matrix-matched fipronil and its metabolites

圖7 氟蟲腈及其代謝物基質(zhì)加標(biāo)1 μg/kg MRM色譜圖Fig. 7 MRM chromatograms of matrix-matched standards (1 μg/kg) of fipronil and its metabolites

2.5 精密度與回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

空白茶葉樣品中分別添加1、5、20、200 μg/kg的氟蟲腈及其代謝物，按照1.3.4節(jié)的方法進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)（n=6），計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表4。方法的平均回收率為76.72%～96.53%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.76%～13.07%。

表4 茶葉中氟蟲腈及其代謝物的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 4 Recoveries and RSDs of fipronil and its metabolites in tea (n= 6)

2.6 實(shí)際樣品檢測結(jié)果

隨機(jī)抽取市售的茶葉200 份，應(yīng)用建立的方法對樣品進(jìn)行測定，結(jié)果如圖8所示，在某一茶葉樣品中檢出氟蟲腈及其代謝物總計(jì)27.18 μg/kg。

圖8 氟蟲腈及其代謝物的陽性樣品MRM色譜圖Fig. 8 MRM chromatograms of fipronil and its metabolites in positive samples

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用QuEChERS技術(shù)，建立茶葉中氟蟲腈及3 種代謝物準(zhǔn)確、快速的定量測定方法。本方法涵蓋了GB 2763—2016及歐盟和日本的限量規(guī)定中氟蟲腈的全部殘留標(biāo)志物檢測，并通過提取試劑和凈化吸附劑的優(yōu)化，降低了基質(zhì)干擾，簡化了前處理，同時(shí)采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，GC-MS/MS的高靈敏度檢測，可以滿足目前國內(nèi)外的茶葉中氟蟲腈及其代謝物殘留的限量要求。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法回收率為76.72%～96.53%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.76%～13.07%，相關(guān)系數(shù)（r2）均不小于0.995，氟蟲腈及其代謝物檢出限和定量限分別為0.3 μg/kg和1 μg/kg，說明回收率、精密度、線性、定量限等均滿足殘留檢測方法確認(rèn)的要求，適用于茶葉中氟蟲腈及其代謝物的快速定量測定。