HPLC同時測定葵樹子中5種化學成分的含量

潘立衛(wèi)，羅澤萍，黃秀香，覃芳芳

（1.河池學院化學與生物工程學院，廣西宜州 546300；2.廣西高校微生物及植物資源開發(fā)利用重點實驗室，廣西宜州 546300）

葵樹子為棕櫚科蒲葵屬常綠喬木蒲葵（Livistona chinensis R.Br.）的種子，具有敗毒抗癌、消瘀止血、軟堅散結(jié)等功效，主治癥瘕積聚、慢性肝炎、血崩、外傷出血、食道癌、絨毛膜上皮癌、惡性葡萄胎、白血病等（國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會，1999）。該藥材有著良好的民間藥用基礎(chǔ)及豐富的藥理活性，其在化學成分（黃月鳳，2011；劉志平等，2007；國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會，1999；Unar，1997）、 抗癌作用 （王慧等，2008；Huang，2007；Susan，2005）、 抗氧化作用 （陳艷，2011）、生藥學研究（詹曉如等，2012）、園藝栽培（朱洪武等，2011）、質(zhì)量控制（劉國雄，2016）等方面都有研究。目前，采用液相色譜法對中草藥定量多指標檢測，為當今中藥材含量測定一種發(fā)展趨勢，能更有效地控制其質(zhì)量。對于葵樹子質(zhì)量控制，目前使用HPLC 測定蒲葵藥材中的指標成分有小麥黃素、葒草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、苜蓿素、原兒茶酸、原兒茶醛等（劉國雄，2016；林菲娟等，2013；王慧，2008）。研究表明葵樹子所含成分大多為酚酸和黃酮類（黃月鳳，2011；劉志平等，2007；國家中醫(yī)藥管理局 《中華本草》 編委會，1999；Unar DM，1997），兩大類成分在抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌、降血糖、提高免疫力上都發(fā)揮作用，可考慮作為添加劑，應(yīng)用在食品、保健品和飼料加工等方面。本文采用HPLC 同時測定葵樹子中原兒茶酸、綠原酸、異槲皮苷、山柰酚、芹菜素5 種化學成分的含量，旨在建立一種簡便可行的同時測定葵樹子中5 種成分含量的方法，為完善葵樹子質(zhì)量控制及制劑方面開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料 葵樹子采于河池學院校園內(nèi)，經(jīng)河池學院化學與生物工程學院植物學實驗室副教授鑒定為棕櫚科蒲葵屬植物葵樹子的干燥種子。

1.1.2 儀器與試藥 Agilent 1260 型高效液相色譜儀 （四元泵、VWD 檢測器、 柱溫箱、 自動進樣器 ）；Agilent 1260 series色譜工作站；島津AUW220D 型十萬分之一天平；Agilent 8453 二極管陣列紫外可見分光光度計；Millipore D-Q3 超純水機。對照品：原兒茶酸（110809-201205 中國食品藥品檢定研究院）；異槲皮苷（must-15070211成都曼思特生物科技有限公司）；山柰酚（20160328 北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）；芹菜素（lot-151228 成都植標化純生物技術(shù)有限公司）；綠原酸（自制，HPLC 峰面積歸一化法測定純度大于98.0%），經(jīng)理化性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)分析，鑒定其結(jié)構(gòu)；乙腈（色譜純，美國天地）；水為純凈水；其余試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取原兒茶酸、綠原酸、異槲皮苷、山柰酚、芹菜素對照品適量，加入甲醇使其溶解，定容至100 mL，配制成每毫升含原兒茶酸0.025 mg、綠原酸0.030 mg、異槲皮苷 0.033 mg、 山柰酚 0.058 mg、 芹菜素 0.032 mg的混合對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 葵樹子打碎成粗粉，過篩（40 目）。使用具塞錐形瓶精密稱取藥材粉末50 g，精確移入70%乙醇液300 mL，密塞，稱重，冷浸48 h，每隔4 h 振搖一次，補重濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾即得。

1.2.3 色譜條件 ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）色譜柱，以乙腈（A）-0.2%磷酸（B）為流動相進行梯度洗脫（0～5 min，2%～8%A；5～10 min，8%～16%A；10～20 min，16%～20% A；20～25 min，20%～24% A；25～30 min，24%～30% A，30～36 min，30%～35%A，36～42 min，35%～45% A，42～50 min，45%～55%A），設(shè)定流速：0.6 mL/min，檢測波長：263 nm，柱溫：30 ℃，進樣量：5 μL。

1.2.4 線性關(guān)系考察 精確吸取混合對照品溶液2、4、6、8、10、12 μL 按“1.2.3 項”色譜條件注入高效液相色譜儀。以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，求得線性回歸方程。

1.2.5 檢測限與定量限 參照《中國藥典》信噪比法，按信噪比為3:1 計算原兒茶酸、綠原酸、異槲皮苷、山柰酚、芹菜素的檢測限；按信噪比為10:1計算原兒茶酸、綠原酸、異槲皮苷、山柰酚、芹菜素的最低定量限。

1.2.6 精密度試驗 取同一混合對照品溶液重復(fù)進樣6 次，每次5 μL，測定峰面積，按峰面積外標法計算含量，并計算日間精密度RSD。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗 精密稱取葵樹子干燥藥材粉末（40 目）50 g，按“1.2.2 項”下制備供試液，“1.2.3項”下室溫放置 2、4、6、8、12 h 后注入高效液相色譜儀測定相應(yīng)峰面積，按峰面積外標法計算含量，并計算RSD。

1.2.8 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批葵樹子干燥藥材粉末（40 目）6 份，每份 50 g，按“1.2.2 項”下制備供試液，“1.2.3 項”下測定其峰面積，按峰面積外標法計算含量，并計算RSD。

1.2.9 加樣回收率試驗 精密稱取6 份已知含量的葵樹子供試品溶液5 mL，分別精密加入混合對照品溶液（含原兒茶酸0.025 mg/mL、綠原酸0.03 mg/mL、異槲皮苷 0.033 mg/mL、山柰酚 0.058 mg/mL、芹菜素 0.032 mg/mL） 5 mL，甲醇定容至 10 mL，按“1.2.3 項”下測定供試溶液，進樣 5 μL，記錄色譜峰面積，并計算樣品的平均加樣回收率和RSD。

1.2.10 樣品含量測定 選取來自不同采集點的葵樹子藥材粉末（40 目）各約50 g，精密稱定，共5份，按“1.2.2 項”方法制備樣液，“1.2.3 項”測定供試樣液，進樣5 μL，測定5 批葵樹子中5 種目標成分的含量，記錄對照品、樣品色譜圖及峰面積，并用外標法計算各采集點葵樹子中5 種成分含量平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的線性考察結(jié)果 葵樹子中原兒茶酸、綠原酸、異槲皮苷、山柰酚、芹菜素5 種化學成分進樣量分別為 0.05～0.30、0.06～0.36、0.066～0.396、0.023～0.139、0.013～0.079 μg；各組分的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1，線性范圍r＞0.999，表明各組分在相應(yīng)進樣量范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2 檢測限與定量限 按信噪比為3:1 計算原兒茶酸、綠原酸、異槲皮苷、山柰酚、芹菜素的檢測限分別為 0.97、0.74、1.39、1.38、1.42 ng；按信噪比為10:1 計算原兒茶酸、綠原酸、異槲皮苷、山柰酚、芹菜素的最低定量限分別為 3.26、2.49、4.65、4.59、4.74 ng。

表1 線性關(guān)系測定結(jié)果（n=6）

2.3 精密度試驗結(jié)果 測定原兒茶酸、 綠原酸、異槲皮苷、山柰酚、芹菜素峰面積，計算日間精密度。結(jié)果測得RSD 依次為1.14%、1.30%、1.37%、1.15%、1.24%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果 測定原兒茶酸、 綠原酸、異槲皮苷、山柰酚、芹菜素峰面積，計算5 種成分含量的 RSD 依次為 0.69%、1.96%、1.34%、1.01%、1.15%，說明被測供試品溶液在24 h 內(nèi)表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。

2.5 重復(fù)性試驗結(jié)果 根據(jù)測定原兒茶酸、綠原酸、異槲皮苷、山柰酚、芹菜素的峰面積，計算5 種成分含量的 RSD 依次為 0.62%、1.85%、0.97%、1.21%、1.37%，試驗結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗結(jié)果 由表2 可知，原兒茶酸、綠原酸、異槲皮苷、山柰酚、芹菜素的平均回收率分別為 101.60%、99.65%、96.36%、98.62%、100.62% ，RSD 分 別 為 1.93% 、0.86% 、1.43% 、1.12%、1.98%。說明采用HPLC 法測定葵樹子中5種成分含量具有較好的準確性和可靠性。

表2 葵樹子中5 種成分加樣回收率（n=6）

2.7 樣品含量測定結(jié)果 由圖1 可知，5 種化學成分組間分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按各成分計算不少于3000，基本能將待測成分完全分離，達到色譜分離要求，柱效良好。測定5 批葵樹子中5 種目標成分的含量，記錄對照品、 樣品色譜圖（圖1）及峰面積，并用外標法計算來自不同采集點的藥材中5 種成分含量平均值，以mg/g 計，結(jié)果見表3。5 批葵樹子中5 種成分含量分別為原兒茶酸2.67～1.85 mg/g、綠原酸 0.34～0.86 mg/g、異槲皮苷 0.72～1.17 mg/g、山柰酚 0.10～0.16 mg/g、芹菜素 0.024～0.059 mg/g。

圖1 葵樹子HPLC

表3 樣品含量測定結(jié)果（n=5） mg/g

3 討論

前期樣品的制備，曾采用加熱回流法考察了不同溶媒（甲醇、乙醇、水）濃度、提取溫度、提取時間對提取率的影響，并分別制備葵樹子供試品溶液，測定5 種指標成分的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冷浸法提取效果最佳，在此提取條件下基本能把有效成分提取完全，得到成分種類較多、敏感成分破壞少、重現(xiàn)性較好。故本試驗選擇該方法作為提取條件。

試驗考察了不同的流動相比例 （乙腈-0.1%乙酸、 乙腈-0.1%磷酸、 甲醇-0.1%乙酸、 甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、甲醇-0.2%磷酸）的等度和梯度洗脫分離效果，反復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)流動相為乙腈-0.2%磷酸梯度洗脫，5 種成分色譜峰形及分離效果最佳；不同色譜柱間的考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用Hypersil BDS C18 和ZORBAX Eclipse Plus C18 色譜柱分析效果較好，但由于ZORBAX E-clipse Plus C18 色譜柱為窄徑柱，其柱效更高，分析時間更短，而且峰形更好，且考慮到溶劑成本及紫外燈能量損耗等因素，故最終采用ZORBAX Eclipse Plus C18 柱，流速為 0.6 mL/min 進行分析。在190～400 nm 范圍內(nèi)對混合對照品溶液和供試品中進行全波長掃描，選擇最大吸收波長263 nm 做為測定波長，在該波長下基線穩(wěn)定，分析靈敏度好。樣品含量測定中不同采集點的試樣含量各異，有可能與其生長環(huán)境和樹齡相關(guān)。

葵樹子在民間常用于多種癌癥的治療，效果明顯。本試驗選取該植物中原兒茶酸、綠原酸、異槲皮苷、山柰酚、芹菜素5 種成分做為指標進行含量測定，探討和建立葵樹子HPLC 含量測定方法，結(jié)果表明，該方法簡便可行、準確可靠、靈敏度高、重現(xiàn)性好，為葵樹子作為藥材或飼料添加劑的質(zhì)量控制提供參考及抗癌天然藥物研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。