四溴雙酚A 類阻燃劑的酶聯(lián)免疫方法的構(gòu)建及應(yīng)用

黃 哲，邵 杰，曾 昆，2*，張旭蕓，陳 斌，杜道林，3*

（1.江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)環(huán)境生態(tài)研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3.江蘇大學(xué)農(nóng)業(yè)工程研究院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

四溴雙酚A（Tetrabromobisphenol A，TBBPA）由于極好的阻燃性能成為大量使用的溴代阻燃劑（Bromi?nated flame retardants，BFRs），常見于電子產(chǎn)品、紡織品等生活用品中[1]。2001年全球市場(chǎng)總需求達(dá)12萬t，2004年約17萬t[2]。正是由于TBBPA類阻燃劑的大量應(yīng)用，導(dǎo)致其在環(huán)境樣品中廣泛檢出，在大氣[3-4]、水體、魚類[5-6]、土壤[7]、底泥[8-9]、植物[10]、鳥蛋[11]以及哺乳動(dòng)物[12-13]中均有報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)TBBPA類化合物是潛在的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，類似于持久性有機(jī)污染物，會(huì)在環(huán)境和生物體內(nèi)積聚并且具有細(xì)胞毒性[14]、神經(jīng)毒性[15]、內(nèi)分泌干擾性[16]、免疫毒性[17]以及干擾甲狀腺激素[18]等作用。

四溴雙酚A雙（2-羥乙基）醚[TBBPA bis（2-hy?droxyethyl）ether，TBBPA-DHEE]是主要的 TBBPA 衍生物之一，在工程聚合物、環(huán)氧樹脂、熱塑性聚酯、聚氨酯等中廣泛應(yīng)用。由于其具有較高的log Kow值，有研究人員認(rèn)為TBBPA-DHEE具有一定持久性和生物蓄積性，并且具有較高的神經(jīng)毒性。四溴雙酚A單（2-羥乙基）醚[TBBPA mono（2-hydroxyetyl）ether，TBBPA-MHEE]是TBBPAs類化合物及其衍生物在生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物[19]。由于結(jié)構(gòu)與TBBPA-DHEE類似，TBBPA-MHEE可能與TBBPA-DHEE具有類似的毒性作用。然而，TBBPA-DHEE/TBBPA-MHEE在環(huán)境中累積、轉(zhuǎn)運(yùn)以及分布的研究較為少見。因此，亟需建立TBBPA-DHEE/TBBPA-MHEE的檢測(cè)方法，為評(píng)估其環(huán)境行為提供技術(shù)手段。Liu等[19]建立了基于ESI-MS用于測(cè)定TBBPA-MHEE和TBBPA-DHEE及其他副產(chǎn)物或降解產(chǎn)物。但是TBBPA-DHEE的質(zhì)子親和力低，基于ESI或APCI的離子源無法生成足夠的特定離子簇用于定量測(cè)定，必須通過AgNO3的衍生化，然而高濃度AgNO3的引入可能會(huì)增加儀器污染[20-21]。Liu等[22]應(yīng)用超高效液相色譜儀-Orbitrap Fu?sion三重質(zhì)譜檢測(cè)TBBPA-MHEE。但是若采用儀器方法，則需要優(yōu)先獲得儀器資源并且需要在測(cè)樣品前對(duì)樣本按要求進(jìn)行處理，且該方法也不能實(shí)現(xiàn)一次檢測(cè)多種樣品。以抗原-抗體特異性結(jié)合為基礎(chǔ)的免疫分析方法，由于其檢測(cè)手段簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)在環(huán)境分析領(lǐng)域被大量使用[21-24]。然而，應(yīng)用免疫分析方法檢測(cè)TBBPA-DHEE/TBBPA-MHEE卻鮮有報(bào)道。

本研究以阻燃劑TBBPA-DHEE/TBBPA-MHEE為目標(biāo)物，先通過設(shè)計(jì)半抗原結(jié)構(gòu)，定期免疫小鼠；之后利用雜交瘤技術(shù)篩選出高靈敏度的單克隆抗體，并且對(duì)抗體的靈敏度等性質(zhì)進(jìn)行了鑒定；建立間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法用于TBBPA-DHEE/TBBPA-MHEE的檢測(cè)；采集典型區(qū)域的環(huán)境樣本，分析其中TBBPADHEE/TBBPA-MHEE的分布情況。

1 材料與方法

1.1 材料

5～6周齡的雌性Balb/C小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，SP2/0骨髓瘤細(xì)胞購自武漢博士德生物工程有限公司，四溴雙酚A單（2-羥基二乙）醚標(biāo)準(zhǔn)品、四溴雙酚A雙（2-羥基二乙）醚標(biāo)準(zhǔn)品來自中科院生態(tài)環(huán)境中心，BSA、OVA、EDC·HCl、FCA、FIA、HAT（50×）、HT（50×）、50%PEG、3′-3′-5′-5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）購自美國Sigma公司，HRP-IgG購自美國Jacket公司，胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibico公司。其他常規(guī)試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。酶標(biāo)板購于廈門怡佳美公司。多功能酶標(biāo)儀（TECAN Infinite M1000 PRO）為奧地利TECAN公司生產(chǎn)。

1.2 TBBPA-DHEE半抗原的合成與鑒定

稱取2.86 g雙酚酸裝入圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入甲醇20 mL，回流2 h得到2.9 g雙酚酸甲酯（a）；將雙酚酸甲酯溶于40 mL冰醋酸中，然后慢慢加入10 mL含25.7 g液溴的冰醋酸，連續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)5 h；將其倒入亞硫酸氫鈉的飽和水溶液，將上述步驟得到的物質(zhì)通過快速硅膠柱色譜法獲得4，4-雙（3，5-二溴-4-羥苯基）戊酸甲酯（b）；隨后利用（b）與2-溴乙醇進(jìn)行相互作用，得到了化合物4，4-雙[3，5-二溴-4-（2-羥基乙氧基）苯基]戊酸甲酯（c）；最后再通過化合物（c）與氫氧化鈉的相互作用后，即可得到半抗原4，4-雙[3，5-二溴-4-（2-羥基乙氧基）苯基]戊酸D3。合成路線如圖1所示。對(duì)合成TBBPA-DHEE的半抗原D3用質(zhì)譜與核磁共振進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.3 TBBPA-DHEE人工抗原的合成與鑒定

為了制備完全抗原，本研究采取了碳化二亞胺法將之前合成好的半抗原D3與載體蛋白（BSA、OVA）進(jìn)行偶聯(lián)。400 mg EDC·HCl和20 mg載體蛋白溶于2 mL PBS（0.01 mol·L-1，pH 7.4）中，在室溫下?lián)u勻 30 min。取60 mg半抗原D3溶于2 mL PBS中，和上述溶液混合均勻，反應(yīng)4 h，然后在4℃冰箱條件下反應(yīng)16 h。隨后將其吸出，在PBS溶液（0.01 mol·L-1，pH 7.4）中透析2 d。2 d后剩余在透析袋中的溶液，就是試驗(yàn)需要的完全抗原，其中把BSA-D3用作免疫原，把OVA-D3用作包被原。將其進(jìn)行分裝后，置于-20℃冰箱存放。

圖1 D3合成路線Figure 1 The synthetic route of the D3

人工抗原 BSA-D3、OVA-D3、BSA、OVA 和 TBB?PA-DHEE，配制濃度均為1 mg·mL-1，并用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長掃描。

1.4 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的流程

將OVA-D3通過包被液（0.05 mol·L-1碳酸鹽緩沖液，pH 9.6）稀釋，以每孔100μL逐孔入酶標(biāo)板中，4℃條件反應(yīng)9 h。甩去包被液，利用洗滌液進(jìn)行清洗。之后每孔加入200μL封閉液（含1%明膠的0.01 mol·L-1PBS，pH 7.4），37 ℃培養(yǎng)箱反應(yīng)2 h。反應(yīng)后，去除封閉液，拍干。用抗體稀釋液（含0.1%明膠的0.01 mol·L-1PBS，pH 7.4）將血清降低濃度，標(biāo)準(zhǔn)品用PBS降低濃度，將反應(yīng)濃度的血清和標(biāo)準(zhǔn)品每孔對(duì)半各加入，每個(gè)濃度做3個(gè)平行并設(shè)空白對(duì)照和陽性對(duì)照，37℃反應(yīng)2 h。競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)后，用洗滌液清洗，用吸水紙將板拍干后，逐孔加入適量濃度的羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37℃孵育60 min，隨后步驟和之前反應(yīng)結(jié)束后步驟一致。拍干后每孔滴入100μL的TMB顯色液，在培養(yǎng)箱內(nèi)放置20 min左右。從培養(yǎng)箱中取出酶標(biāo)板后滴入2 mol·L-1的H2SO4，使反應(yīng)結(jié)束進(jìn)程。最后通過儀器酶標(biāo)儀來測(cè)定其在450 nm處的吸光度。

1.5 單克隆抗體的制備與篩選

通過頸背部皮下多處注射的方法將BSA-D3與FCA進(jìn)行乳化后的乳化物免疫6～8周齡Balb/C雌性小鼠；4周后換取BSA-D3與FIA乳化后的乳化物進(jìn)行小鼠免疫。第5次免疫后，采用1.4的方法對(duì)抗血清進(jìn)行篩查，選擇抗體效價(jià)與靈敏度滿足要求的小鼠，取出脾臟細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，并進(jìn)一步克隆并篩選出單克隆細(xì)胞。

1.6 單克隆抗體的鑒定

1.6.1 類與亞型的鑒定

采用Thermo單克隆抗體亞型鑒定試劑盒對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液上清進(jìn)行亞類鑒定。

1.6.2 抗體靈敏度的測(cè)定

通過建立的ELISA方法模擬出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算抗體的半數(shù)抑制率（50%Inhibition of concentration，IC50）。其中以不添加標(biāo)準(zhǔn)品OD值為B0，添加不同比例標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為B，將B和B0的比值設(shè)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值設(shè)為橫坐標(biāo)。

1.6.3 抗體交叉反應(yīng)率測(cè)定

選取結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行交叉反應(yīng)測(cè)定，測(cè)定其特異性。公式為：交叉反應(yīng)率（CR%）=IC5（0待檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)片濃度）/IC5（0其他衍生物濃度）×100%。

1.7 ELISA方法建立

1.7.1 抗體和包被原用于反應(yīng)的最佳濃度

采用棋盤法確定抗原-抗體結(jié)合濃度。包被不同濃度的OVA-D（31∶1 000倍比稀釋到1∶32 000），不同濃度的抗體（1∶20倍比稀釋到1∶2 560），其他流程同1.4。采用酶標(biāo)儀確定其在450 nm的OD值，并選取OD值在1.0左右的包被原和抗體稀釋濃度作為優(yōu)化后的反應(yīng)濃度。

1.7.2 確定最優(yōu)pH值

按1.7.1確定的結(jié)果進(jìn)行前面的步驟，之后利用不同pH值的緩沖溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，pH分別為4.0、5.0、7.4、8.0和10.0，之后步驟不變，測(cè)定450 nm處的吸光度，確定pH值。

1.7.3 確定最優(yōu)蛋白濃度

標(biāo)準(zhǔn)品用不同蛋白質(zhì)濃度（0、0.10%、0.50%、1%、5%、10%）的緩沖液降低濃度，完成ELISA反應(yīng)，確定蛋白質(zhì)濃度。

1.7.4 確定最優(yōu)離子強(qiáng)度值

利用不同離子強(qiáng)度（0、0.01、0.05、0.1、0.2 mol·L-1）緩沖液降低標(biāo)準(zhǔn)品濃度，ELISA反應(yīng)后，確定離子強(qiáng)度。

1.7.5 確定有機(jī)溶液濃度

用不同濃度的甲醇（分別為0、5%、10%、20%、30%、50%）緩沖液降低標(biāo)準(zhǔn)品濃度，ELISA反應(yīng)后，通過450 nm處的吸光度，選擇甲醇濃度。

1.7.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

基于上述優(yōu)化條件，按照1.4中的操作流程，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)平行設(shè)置2組重復(fù)。用四參數(shù)方程擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照下式計(jì)算檢測(cè)限（Limit of detection，LOD）、半數(shù)抑制率（IC50）及檢測(cè)范圍（IC20～I(xiàn)C80）。

式中：y為吸光度的比值A(chǔ)/A0；X為已知的標(biāo)準(zhǔn)品濃度，ng·mL-1；A1為擬合成功曲線的上漸近線斜率；A2為擬合成功曲線的下漸近線斜率；X0即為IC50的值，ng·mL-1；P是IC50處點(diǎn)的斜率。

1.8 典型環(huán)境樣本的采集、前處理及檢測(cè)

山東省壽光市是我國主要的BFRs生產(chǎn)地，當(dāng)?shù)赜卸嗉襎BBPA及其衍生物生產(chǎn)工廠。于2016年10月對(duì)山東省壽光市溴代阻燃劑加工基地附近水樣和土樣進(jìn)行收集，分裝并保存在-20℃條件下。

水樣的前處理方法：用10 mL注射器吸取水樣，并使用0.22μm硝酸纖維素膜進(jìn)行過濾，濾液直接用于檢測(cè)。

土壤樣本的前處理方法：將樣本凍存干燥后，使用研缽打碎研磨至粉狀；在加速溶劑萃?。ˋccelerat?ed solvent extraction，ASE）反應(yīng)釜中加入一半量的硅藻土，稱取1 g土壤樣本加入反應(yīng)釜中用玻璃棒輕輕攪勻，使得土樣樣本與硅藻土充分混勻后，用硅藻土將反應(yīng)釜填滿，上機(jī)待測(cè)；加入萃取劑，萃取樣本中待檢測(cè)物；收集萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，保留5 mL左右；將剩余的萃取劑用氮?dú)獯蹈?，然后用含有一定濃度的甲醇進(jìn)行復(fù)溶，用于檢測(cè)。

參考Tian等[25]的方法采用ESI-MS方法對(duì)樣本中的TBBPA-DHEE/TBBPA-MHEE進(jìn)行檢測(cè)。其中針對(duì)TBBPA-DHEE的最低檢測(cè)限LOD為0.49 ng·mL-1，TBBPA-MHEE的LOD為0.33 ng·mL-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 TBBPA-DHEE半抗原的鑒定

由于TBBPA-DHEE屬于小分子物質(zhì)，不具備免疫原性，需要與大分子載體蛋白偶聯(lián)獲得完全抗原。然而，TBBPA-DHEE結(jié)構(gòu)中沒有活性基團(tuán)，無法直接偶聯(lián)，需要衍生化；同時(shí)需要考慮暴露適當(dāng)結(jié)構(gòu)，作為抗原識(shí)別表位[26-28]。根據(jù)目標(biāo)物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，采用兩種策略：（1）從苯環(huán)側(cè)鏈的羥基衍生，以兩個(gè)苯環(huán)及其側(cè)鏈作為表位；（2）從兩個(gè)苯環(huán)中間的支鏈進(jìn)行衍生，以一側(cè)的苯環(huán)及其側(cè)鏈作為表位。前期本課題組采用前一種策略合成了半抗原M3，免疫家兔制備了TBBPA-DHEE多克隆抗體，并建立了競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法，其IC50為9.868 ng·mL-1[26]。在本研究中，通過苯環(huán)中間的支鏈衍生出羧基，獲得半抗原D3。對(duì)TBB?PA-DHEE的半抗原D3用核磁共振氫譜和質(zhì)譜分析法進(jìn)行鑒定。質(zhì)譜結(jié)果如圖2所示，核磁共振氫譜結(jié)果如圖3所示，根據(jù)對(duì)特征峰形的研究、化合物官能團(tuán)中氫原子數(shù)量種類的分析以及對(duì)化學(xué)位移的分析，結(jié)果表明反應(yīng)產(chǎn)物為目標(biāo)化合物，即TBBPA-DHEE半抗原D3。

2.2 TBBPA-DHEE人工抗原的鑒定

通過紫外掃描全光譜的方法按照吸收峰位置的變化，可以判斷出半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)情況。如圖4為BSA-D3、OVA-D3等物質(zhì)的紫外吸收光譜圖。半抗原、載體蛋白和結(jié)合物的紫外吸收光譜發(fā)生了顯著變化，結(jié)合物的峰位發(fā)生了位移，說明免疫原偶聯(lián)是成功的。

圖2 半抗原D3的電噴霧質(zhì)譜圖Figure 2 ESI-MSspectrogramfor hapten D3

圖3 半抗原D3的核磁共振氫譜圖Figure 3 1H-NMRspectrogramfor hapten D3

圖4 OVA、BSA及偶聯(lián)物的紫外吸收光譜Figure 4 UV absorption spectrogramof the D3 and conjugate

2.3 單克隆抗體制備與鑒定

用ELISA方法對(duì)免疫后的抗血清進(jìn)行效篩選，結(jié)果見表1，其中抗血清以1∶2 000用抗體稀釋液稀釋?？梢钥闯?、2、3號(hào)小鼠血清的效價(jià)較高，同時(shí)比較其在0.250μg·mL-1時(shí)抑制率，發(fā)現(xiàn)1號(hào)小鼠的抑制率最高（75.9%）。因此，最終選擇1號(hào)Balb/C小鼠進(jìn)行后面細(xì)胞融合試驗(yàn)。

經(jīng)過多次克隆培養(yǎng)后，獲得5株能夠穩(wěn)定分泌TBBPA-DHEE單克隆抗體的雜交流細(xì)胞株，標(biāo)記為E2D2、D2D4、C2D6、D4G6、F7D5。經(jīng)亞型鑒定試劑盒測(cè)定，5株單克隆抗體均為IgG1型、Kappa鏈。

同時(shí)對(duì)5株單克隆抗體的特異性進(jìn)行了鑒定（表2）。結(jié)果顯示，這5株單克隆抗體與TBBPA、TBBPADAE、TBBPA-DBPE、TBBPA-MHPE、TBBPA-MBPE、TBBPA-MAE沒有交叉反應(yīng)，而與TBBPA-MHEE均有不同程度的交叉反應(yīng)（55.32%～83.32%）。根據(jù)TBBPA-DHEE和TBBPA-MHEE的結(jié)構(gòu)，可以看出，二者結(jié)構(gòu)具有較高的相似性，僅在側(cè)鏈有所不同。因此所得抗體能夠同時(shí)識(shí)別這兩種物質(zhì)。鑒于D4G6株抗體與TBBPA-MHEE有較高的交叉反應(yīng)，因此后續(xù)試驗(yàn)中用其構(gòu)建同時(shí)檢測(cè)TBBPA-DHEE與TBBPAMHEE的免疫分析方法。

2.4 ELISA條件優(yōu)化結(jié)果

首先采用棋盤法確定抗原-抗體最佳反應(yīng)濃度，結(jié)果見表3。選擇吸光度在1.2前后且相鄰濃度結(jié)果下吸光度區(qū)分較為明顯的位點(diǎn)，由此確定的濃度為包被原1∶640，抗體1∶4 000。

在ELISA反應(yīng)體系中，抗原抗體的結(jié)合通過非共價(jià)鍵的結(jié)合作用，體系處于動(dòng)態(tài)平衡中，故反應(yīng)緩沖液對(duì)整個(gè)體系起著至關(guān)重要的作用。在反應(yīng)過程中，溶液的成分、pH以及有機(jī)溶劑均能夠影響檢測(cè)方法的靈敏度。本研究選擇IC50和ODmax兩個(gè)指標(biāo)來判斷最佳條件，通常認(rèn)為最優(yōu)條件下IC50越低而ODmax越高。試驗(yàn)結(jié)果整合于圖5。從試驗(yàn)結(jié)果來看，隨著pH的增加，IC50和ODmax均呈現(xiàn)先升高后降低的態(tài)勢(shì)，其中當(dāng)pH為10時(shí)，IC50最小，而pH為7.4時(shí)，ODmax最大。綜合兩個(gè)指標(biāo)的結(jié)果，選用pH 7.4作為優(yōu)化參數(shù)。從圖中可以看出，溶液中含有適量的蛋白（0.5%BSA）有助于提升方法的靈敏度。緩沖液中Na+離子強(qiáng)度升高會(huì)導(dǎo)致ODmax的降低，同時(shí)使得IC50先降低后升高。最終選擇0.01 mol·L-1Na+作為最佳濃度。由于TBB?PA-DHEE和TBBPA-MHEE脂溶性較強(qiáng)，因此需要有機(jī)溶劑進(jìn)行助溶[29]，本研究選擇常用的甲醇作為助溶劑進(jìn)行評(píng)估。伴著緩沖液中甲醇含量的增加，ODmax呈先減小后增加再減小的趨勢(shì)。故選擇甲醇含量為30%作為優(yōu)化條件。

表1 抗血清的篩選Table 1 Screening of antiserum

表2 單克隆抗體的交叉反應(yīng)率（%）Table 2 Cross-reactivity of monoclonal antibodies（%）

表3 棋盤法選擇包被原及抗體反應(yīng)稀釋比例Table 3 Dilution rate of coating antigen and antibody by checkerboard method

2.5 同時(shí)檢測(cè)TBBPA-DHEE和TBBPA-MHEE標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在上述ELISA的優(yōu)化條件下，基于D4G6株單克隆抗體，按照梯度分別稀釋TBBPA-MHEE的標(biāo)準(zhǔn)品濃度（CK、0、0.1、1、3、10、30、100、1 000 ng·mL-1）和TBB?PA-DHEE的標(biāo)準(zhǔn)品濃度（CK、0、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20 ng·mL-1）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，每組4個(gè)平行。建立TBBPA-MHEE與TBBPA-DHEE的競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖6）。該方法檢測(cè)出TBBPA-MHEE的IC50為3.51 ng· mL-1，線性范圍是0.86～13.7 ng·mL-1，LOD為0.78 ng·mL-1，R2≥0.99。檢測(cè)TBBPA-DHEE的IC50為2.76 ng·mL-1，線性范圍在0.96～8.098 ng·mL-1，LOD為0.56 ng·mL-1，R2≥0.99。

圖5 不同緩沖液條件下的ODmax和IC50值Figure 5 ODmax and IC50 value of ELISA in various buffer conditions

圖6 同時(shí)檢測(cè)TBBPA-DHEE和TBBPA-MHEE的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 6 Calibration curve for TBBPA-DHEEand TBBPA-MHEEby ELISA

2.6 典型區(qū)域環(huán)境樣本中的TBBPA-DHEE和TBB?PA-MHEE

由于TBBPAs的廣泛應(yīng)用，在多種環(huán)境樣本中均有檢出報(bào)道，然而對(duì)于TBBPA-DHEE/TBBPA-MHEE在環(huán)境中分布情況報(bào)道較少。僅有Liu等[30]在山東省一家BFR廠家周圍的土壤樣本中檢測(cè)到TBBPAMHEE，濃度在ND～13.7 ng·g-1DW；Zhang等[26]在鎮(zhèn)江市區(qū)域內(nèi)采集了池塘水、自來水、湖水、河水和稻田水，并應(yīng)用ELISA方法對(duì)環(huán)境水樣進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TBBPA-DHEE/TBBPA-MHEE的含量在1.5～7.7 ng·mL-1。

山東省壽光市是我國主要的BFRs生產(chǎn)地，當(dāng)?shù)赜卸嗉襎BBPA及其衍生物生產(chǎn)工廠。于2016年8月對(duì)山東省壽光市某生產(chǎn)BFRs工業(yè)區(qū)域周邊環(huán)境采樣，對(duì)樣本采用1.8中提到的處理流程及方法，并應(yīng)用建立的ELISA方法檢測(cè)樣本中TBBPA-DHEE和TBBPA-MHEE。在表4中發(fā)現(xiàn)TBBPA-DHEE/TBB?PA-MHEE在水樣中檢出率為80%，檢出濃度在1.759～15.45 ng·mL-1，土壤樣本中檢出率為100%，檢出濃度在1.12～6.75 ng·g-1。同時(shí)，采用ESI-MS對(duì)采集的樣本進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果與ELISA具有較好的一致性。但是，由于所獲得的抗體對(duì)TBBPA-DHEE和TBBPA-MHEE均有較好的識(shí)別能力，因此建立的ELI?SA方法檢測(cè)的是TBBPA-DHEE和TBBPA-MHEE的總量。在后續(xù)試驗(yàn)中，篩選特異性識(shí)別這兩種靶物質(zhì)的抗體，建立特異性的檢測(cè)方法，則是筆者的研究重點(diǎn)。

表4 環(huán)境樣本中TBBPA-DHEE和TBBPA-MHEE濃度Table 4 Occurrence of TBBPA-DHEEand TBBPA-MHEEin samples

3 結(jié)論

（1）設(shè)計(jì)并合成制備TBBPA-DHEE半抗原D3，并將D3與載體蛋白BSA、OVA偶聯(lián)結(jié)合；免疫小鼠并篩選血清后，采用雜交瘤技術(shù)制備抗TBBPA-DHEE單克隆抗體5株，經(jīng)鑒定這5株抗體均能同時(shí)識(shí)別TBB?PA-MHEE和TBBPA-DHEE，并與其他TBBPA類似物沒有交叉反應(yīng)；基于單克隆抗體D4G6，建立了ELI?SA方法，優(yōu)化條件后，其針對(duì)TBBPA-DHEE的IC50和LOD分別為2.76 ng·mL-1和0.56 ng·mL-1，針對(duì)TBB?PA-MHEE的IC50和LOD分別為3.51 ng·mL-1和0.78 ng·mL-1。

（2）以建立的ELISA方法檢測(cè)了山東省壽光市一家BFR工廠周邊的水樣和土壤樣本，發(fā)現(xiàn)TBBPADHEE/TBBPA-MHEE在水樣中檢出濃度在1.759～15.45 ng·mL-1，土壤樣本中檢出濃度在1.12～6.75 ng·g-1。酶聯(lián)免疫分析方法的建立為環(huán)境中污染物的分布調(diào)查，繼而進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了有效的技術(shù)手段。