基于質(zhì)譜的高通量蛋白質(zhì)組學技術(shù)探索腫瘤蛋白標志物的研究進展*

癌癥是全球人類死亡的主要原因之一，占總死亡人數(shù)的21%，位居發(fā)達國家第2位死因［1］。2012年全球新發(fā)腫瘤病例達1 410 萬例，預計2030年將增至2 360 萬例［1-2］。為了確定腫瘤早期診斷和預測治療反應的生物標志物，同時制定精準特異的治療策略，基因組和轉(zhuǎn)錄組的研究取得顯著進展。盡管如此，大多數(shù)癌癥患者的長期生存率仍然較低，精準診斷和治療依然是臨床工作者的主要挑戰(zhàn)。根據(jù)中心法則，蛋白質(zhì)是生物體生命活動的主要執(zhí)行者和體現(xiàn)者。近年基于質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）的高通量和高精度蛋白質(zhì)組學技術(shù)的飛速發(fā)展使得蛋白質(zhì)組學在腫瘤研究中得到廣泛應用［3-4］，主要包括揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展機制、尋找特異性生物標志物、闡明耐藥性產(chǎn)生機制和發(fā)現(xiàn)新治療靶點等。生物標志物在腫瘤早期發(fā)現(xiàn)、診斷、治療及預后評估等方面發(fā)揮著重要作用。因此，本文將重點綜述近年基于質(zhì)譜的高通量蛋白質(zhì)組學技術(shù)在探索腫瘤特異性蛋白質(zhì)生物標志物中的研究進展，為腫瘤診斷、治療提供新思路。

1 常用蛋白質(zhì)組學定量技術(shù)和標本類型

蛋白質(zhì)組學可以系統(tǒng)全面地研究不同時期和不同條件下細胞內(nèi)發(fā)生的蛋白質(zhì)變化，具有重要的理論和應用價值。近年來，蛋白質(zhì)組學研究取得快速進展，其得益于MS 技術(shù)的快速發(fā)展。目前，常用的蛋白質(zhì)組學定量技術(shù)主要分為非靶向相對定量和靶向絕對定量。在非靶向相對定量中，根據(jù)是否進行標記，又分為非標記定量和標記定量技術(shù)。常用的非標記定量技術(shù)主要包括Lable-free 定量技術(shù)和DIA/SWATH（data-independent acquisition/sequential window acquisition of all theoretical mass spectra），標記定量技術(shù)主要為同位素標記相對和絕對定量/串聯(lián)質(zhì)量標記（isobaric tags for relative and absolute quantification/tandem mass tags，iTRAQ/TMT）技術(shù)、同位素親和標簽（isotope-coded affinity tag，ICAT）和穩(wěn)定同位素標記細胞培養(yǎng)（stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC）技術(shù)［5-7］。另外，靶向絕對定量技術(shù)則主要包括質(zhì)譜多反應監(jiān)測/選擇反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring/selected reaction monitoring，MRM/SRM）技術(shù)、平行反應監(jiān)測（parallel reaction monitoring，PRM）技術(shù)等［5］。不同定量技術(shù)的優(yōu)勢、局限性及特定的適用范圍如圖1所示，在實際應用中應根據(jù)具體研究項目加以選擇。此外，新近研發(fā)的基質(zhì)輔助激光解吸電離成像技術(shù)（MALDI-imaging）將MS 獲得的數(shù)據(jù)與顯微技術(shù)聯(lián)系起來，是組織蛋白質(zhì)組學中的重要工具［8］。

圖1 常用定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)及優(yōu)缺點

考慮腫瘤生物標志物的臨床實用性和可行性，相關(guān)研究主要采用容易獲得的標本類型，主要包括血液標本、組織標本、細胞標本和尿液標本等，不同標本類型具有各自優(yōu)缺點。1）血液標本：創(chuàng)傷小，易收集，成本低，可短時間內(nèi)重復檢測，是首選的標本類型；但血液蛋白成分復雜，個體差異較大，且儲存運輸困難等問題是其不可忽視的局限性。2）腫瘤組織標本：可通過手術(shù)或常規(guī)活檢獲得，蛋白豐度較高，是最直接最準確的標本類型。但標本收集過程中往往創(chuàng)傷較大，成本較高。3）細胞標本：樣本新鮮，可研究疾病類型廣泛，均一性較好；同時，其存在研究成本較高，獲取時間較長等問題。4）尿液標本：以其完全無創(chuàng)、可連續(xù)收集、標本容量充足、成本低等優(yōu)點逐漸受到學者的關(guān)注。但其也存在一些局限性，如蛋白濃度低、穩(wěn)定性差、標本中蛋白濃度易受多種因素影響等。除此之外，針對不同腫瘤的特殊性，其他體液標本正在成為方便無創(chuàng)的可能來源，如各種消化液（胰液、胃液、唾液等）、乳頭溢液、痰液、淚液、汗液、腦脊液、關(guān)節(jié)腔液、精液、糞便、腫瘤間質(zhì)液等。

2 高通量蛋白質(zhì)組學技術(shù)在探索腫瘤蛋白質(zhì)標志物中的應用進展

目前，基于MS 的高通量蛋白質(zhì)組學在多種腫瘤標志物研究中得到廣泛應用。其中肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌多高發(fā)，且惡性程度高，因而受到廣泛關(guān)注。本文選取發(fā)表期刊影響因子較高，研究樣本量大、擴大樣本量驗證或功能驗證的文獻進行總結(jié)，分別從早期診斷、預測預后、化療耐藥等方面闡述蛋白質(zhì)組學在探索蛋白標志物方面取得的最新進展，進而為實現(xiàn)腫瘤精準診療提供新的思路和依據(jù)。

2.1 肺癌

肺癌（lung cancer，LC）是發(fā)病率最高的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，也是死亡率最高的惡性腫瘤［9］。多數(shù)LC患者在診斷時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，目前的治療手段不足以降低肺癌死亡率?；诟咄康牡鞍踪|(zhì)組學技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)新的肺癌生物標志物，可能是改善現(xiàn)有診斷和治療狀況的重要策略。

2.1.1 早期診斷 Dai 等［10］基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS）技術(shù)對非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者的血清標本進行分析發(fā)現(xiàn)，當ENO1（alphaenolase 1）與CEA和CYFRA 21-1聯(lián)合時，對NSCLC診斷的敏感性可從35.1%提高至84.0%。血清標本中，蛋白質(zhì)PON1（paraoxonase/arylesterase 1）和AACT（alpha-1-antichymotrypsin）聯(lián)合檢測對早期NSCLC的診斷敏感度為94.4%，特異度為90.2%［11］。另外，Bohnenberger等［12］首次發(fā)現(xiàn)了可以區(qū)分原發(fā)性肺鱗癌和頭頸部鱗癌肺轉(zhuǎn)移癌的蛋白質(zhì)標志物組合，為來源不明的肺鱗癌診斷提供可靠依據(jù)。

2.1.2 預測預后 通過對比分析16對NSCLC和癌旁標本的蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)CALR（calreticulin）和PDIA3（protein disulfide isomerase family A member 3）的低表達與肺癌患者較差的生存預后呈正相關(guān)，提示CALR聯(lián)合PDIA3使用可能是一種有效的生物標志物，可顯著提高對NSCLC 預后的預測效能（P=0.023）［13］。

2.1.3 化療耐藥 Bottger 等［14］選取6 種對順鉑具有不同IC50的NSCLC細胞系，比較分析各細胞系間分泌蛋白質(zhì)組，304個蛋白質(zhì)在順鉑敏感和不敏感細胞系之間有顯著性差異。進一步在肺癌患者痰液中檢測發(fā)現(xiàn)，UGGT1（UDP-glucose glycoprotein glucosyltransferase 1）、COL6A1［collagen alpha-1（VI）chain］和MAP4（microtubule associated protein 4）3 種蛋白質(zhì)組合可以較好地預測患者對順鉑的耐藥情況，可作為指導治療的非侵入性生物標志物。

2.1.4 治療靶點 基于LC/MS-MS分析，Sung等［15］發(fā)現(xiàn)與鄰近正常組織相比，肺癌組織中QSOX1（quiescin sulfhydryl oxidase）蛋白表達水平明顯增高。進一步研究發(fā)現(xiàn)，敲除QSOX1的Lewis肺癌細胞在氧化應激下存活能力、遷移和侵襲能力降低。此外，在小鼠模型中也證明了QSOX1 具有促進腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。這表明QSOX1可能是肺癌組織衍生的生物標志物，其參與肺癌的發(fā)生發(fā)展，可作為肺癌的潛在治療靶點。

2.2 乳腺癌

乳腺癌（breast cancer，BC）是全球女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因［9］。癌灶遠處轉(zhuǎn)移和藥物耐藥性是目前臨床治療的主要挑戰(zhàn)［16］。探索乳腺癌蛋白質(zhì)組學水平的生物標志物有助于患者的精準診療。

2.2.1 早期診斷 基于高通量蛋白質(zhì)組學技術(shù)，Tyanova 等［17］分析了40 例雌激素受體陽性（Luminal 型）乳腺癌、HER-2 陽性乳腺癌和三陰性乳腺癌（triplenegative breast cancer，TNBC）的組織標本，蛋白定量深度＞10 000，分析發(fā)現(xiàn)19種蛋白質(zhì)組合可以很好地區(qū)分3種亞型，進而針對不同亞型提供特異性治療方案。另外，有研究［18］表明，OLFM4（human olfactomedin-4）在乳腺癌組織和乳腺癌血清中的表達水平均顯著增高，血清OLFM4 在區(qū)分BC 與健康對照組時AUC值為0.80（95%CI：0.76～0.84），在區(qū)分乳管原位癌與健康對照組時AUC 可達0.87（95%CI：0.81～0.93），其可能是提高現(xiàn)有BC篩查手段敏感性的潛在蛋白標志物。

2.2.2 預測預后 基于對44例TNBC原發(fā)腫瘤和10例相應轉(zhuǎn)移瘤組織的蛋白組學研究，有研究［19］發(fā)現(xiàn)CYPOR（cytochrome P450 reductase）蛋白高表達是TNBC患者較短無復發(fā)生存期的獨立預后標志物（P=0.032，HR=2.19，95%CI：1.07～4.47）。類似在組織標本中，Zeng等［20］檢測了23例BC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶與其配對原發(fā)腫瘤組織的差異表達蛋白發(fā)現(xiàn)，EpCAM（epithelial cell adhesion molecule）和αB-crystallin（alpha-crystallin B chain）蛋白的表達水平顯著影響乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預后。另外，有研究［21-22］發(fā)現(xiàn)，早期乳腺癌組織中，CAPG（macrophage-capping protein）、GIPC1（PDZ domaincontaining protein GIPC1）和DOCK4（dedicator of cytokinesis protein 4）高表達與晚期腫瘤骨轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，同時，這3種蛋白高表達提示該患者可能對唑來膦酸的治療更為敏感。

2.2.3 化療耐藥 乳腺癌患者血液標本中的定量蛋白質(zhì)組學結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)MUC1（mucin-1）可能是監(jiān)測乳腺癌EGFR 靶向治療效果的“效應傳感器”［23］。另外，針對雌激素受體陽性乳腺癌患者，F(xiàn)oxO3a（forkhead box class O3a factor）可以間接預測是否對他莫昔芬耐藥，并且是內(nèi)分泌治療耐藥型乳腺癌的新靶點［24］。

2.3 結(jié)直腸癌

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是最常見的消化系統(tǒng)腫瘤，位居成年人高發(fā)癌癥的第3 位［9，25］。鑒于其高發(fā)病率和高死亡率，利用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學技術(shù)對潛在生物標志物進行探索，以期改善腫瘤的早期診斷和治療。

2.3.1 早期診斷 Yu等［26］采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOFMS）技術(shù)對127 例CRC 患者和90 例健康對照組的血清標本進行分析，鑒定出候選蛋白標志物MST1（serine/threonine kinase 4），其聯(lián)合CEA 和糞便潛血試驗診斷CRC的敏感性和特異性高達92.3%和100%。類似血清標本中SETD7（SET domain containing lysine methyltransferase 7）也對CRC 具有很高的診斷價值（AUC=0.947 7），敏感度和特異度分別為92.17%和81.08%，進一步的功能實驗證實SETD7 缺失可抑制癌細胞增殖和誘導癌細胞凋亡，提示SETD7 與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［27］。因單一標志物診斷效能較為有限，Bhardwaj 等［28］提出1 個可以用于檢測CRC 的5種蛋白標志物組合，包括MASP1（mannan-binding lectin serine protease 1）、OPN（osteopontin）、PON3（serum paraoxonase lactonase 3）、TR（transferrin receptor protein 1）、AREG（amphiregulin），其在診斷任意階段CRC 時AUC 為0.82（95%CI：0.74～0.89）。若進一步區(qū)分，其對早期CRC的診斷優(yōu)于晚期CRC，AUC分別為0.86（95%CI：0.77～0.92）和0.76（95%CI：0.64～0.86）。上述研究均為實現(xiàn)CRC的早期診斷提供重要的參考依據(jù)。

2.3.2 預測預后 Mori 等［29］利用iTRAQ 標記蛋白質(zhì)組學尋找CRC 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預測因子，多因素分析表明大腸癌組織中高表達的Ezrin 蛋白是CRC 伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立預測因素。Mori 等［30］還提出HSP47（heat shock protein 47）與CRC 進展和預后不良密切相關(guān)。另有研究［31］發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞中高表達的HLAB（HLA class 1 histocompatibility antigen，B39 alpha chain）、ADAMTS2（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 2）、LTBP3（latent transforming growth factor beta binding protein 3）、JAG2（jagged 2 protein）和NME2（nucleoside diphosphate kinase 2）與CRC 進展、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為預測CRC患者腫瘤轉(zhuǎn)移風險的潛在生物標志物。

2.3.3 化療耐藥 基于對奧沙利鉑（L-OHP）耐藥結(jié)直腸癌細胞（HT-29/L-OHP）和非耐藥結(jié)直腸癌細胞（HT-29）的對比分析，有研究［32］發(fā)現(xiàn)，與HT-29 細胞相比，HT-29/L-OHP 細胞中PCBP1［Poly（C）-binding protein 1］蛋白水平增加了15.6 倍。進一步驗證發(fā)現(xiàn)，PCBP1 缺失使HT-29/L-OHP 和HT-29 細胞對奧沙利鉑敏感，而過表達PCBP1 則使HT-29 細胞對奧沙利鉑的抗性增強。此外，在L-OHP 難治性患者的腫瘤樣本中，PCBP1 的表達明顯高于L-OHP 反應性患者。這些結(jié)果提示PCBP1是結(jié)直腸癌L-OHP潛在耐藥分子標志物。

2.4 肝癌

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的肝癌類型。目前，廣泛應用于臨床的蛋白標志物甲胎蛋白（AFP）在HCC 診斷、預后、預測等方面均顯示出一定價值，但效能有限。亟待探索新型蛋白標志物以促進HCC的早期診斷與精準治療。

2.4.1 早期診斷 基于多重蛋白質(zhì)組學分析，有研究［33］發(fā)現(xiàn)，血清Trim22（tripartite motif-containing antigen 22）在診斷血清AFP水平正常的HCC時敏感度為90.0%，特異度為85.7%，Trim22、BMP1（bone morphogenetic protein1）和Seprase 3 種蛋白聯(lián)合診斷HCC 的敏感度和特異度可分別高達95.2%和90.0%。另外，功能驗證分析表明抑制Trim22表達將促進人肝癌細胞增殖，而過表達Trim22 則減少肝癌細胞的增殖。另有研究［34］提出，尿液AFP（u-AFP）對HCC的診斷敏感度為62.5%，特異度為95.4%，與血清AFP診斷效能無顯著性差異。而u-AFP 和u-ORM1（urinary orosomucoid 1）組合診斷HCC 的敏感度為85.1%，為HCC的無創(chuàng)篩查和早期診斷提供新視角。

2.4.2 預測預后 Gao等［35］利用159對肝細胞癌和癌旁組織，首次對與HBV相關(guān)肝細胞癌的蛋白基因組學特點進行表征。研究表明，依據(jù)不同蛋白質(zhì)組亞群可對患者生存狀態(tài)進行分層。進一步患者生存分析表明，蛋白質(zhì)PYCR2表達越高，預后越差；ADH1A表達越低，預后越差，提示其可能是HCC潛在的臨床預后生物標志物?；趯?2個HCC小鼠模型的腫瘤蛋白質(zhì)組學研究，Hindupur等［36］發(fā)現(xiàn)在HCC中，整體蛋白質(zhì)的組氨酸磷酸化顯著上調(diào)。組氨酸磷酸酶LHPP（phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase）在HCC小鼠模型中的持續(xù)表達可減輕腫瘤負擔，防止肝功能喪失。在HCC患者中，LHPP低表達與腫瘤嚴重程度增加和總生存期降低有關(guān)，提示LHPP可能是HCC潛在預后和抑制因子。

2.4.3 治療靶點 應用蛋白質(zhì)組學和磷酸蛋白質(zhì)組學等技術(shù)，Jiang 等［37］針對110 個與HBV 感染相關(guān)的臨床早期HCC 的成對腫瘤和非腫瘤組織進行分析，發(fā)現(xiàn)SOAT1（sterol O-acyltransferase 1）表達水平與肝癌患者較差的預后呈正相關(guān)。SOAT1 的一種小分子抑制劑阿伐麥布（avasimibe）在肝癌患者的人源腫瘤異種移植（PDX）模型上表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果，表明阿伐麥布有望成為治療預后較差HCC患者的靶向治療藥物。

2.4.4 化療耐藥 通過對115例HCC患者血清標本連續(xù)分析，Kim等［38］揭示了與索拉非尼獲得性耐藥相關(guān)的蛋白質(zhì)組層面的變化。研究提出CD5L（comprising CD5）、IGJ（immunoglobulin J）、LGALS3BP（galectin-3-binding protein）3種蛋白質(zhì)組合可有效預測索拉非尼治療HCC療效（AUC＞0.95），并且該組合是接受索拉非尼治療的HCC患者不良預后和疾病快速進展的獨立危險因素。

2.5 其他類型腫瘤

除上述幾種癌癥類型（表1），還有一些腫瘤蛋白質(zhì)標志物的研究也取得了很多進展，如胰腺癌、腎癌、卵巢癌、甲狀腺癌、黑色素瘤等。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白THBS2（thrombospondin-2）、IGFBP2（insulin-like growth factorbinding protein 2）和IGFBP3（insulin-like growth factorbinding protein 3）可能是提高CA19-9對胰腺癌診斷效能的潛在蛋白標志物［39-40］。Qi等［41］研究發(fā)現(xiàn)，SERPINH1（serpin peptidase inhibitor clade H member 1）高表達與腎透明細胞癌患者生存率降低顯著相關(guān)?；贚C-MS/MS的靶向蛋白質(zhì)組學研究［42］表明，HSP27（heat shock protein 27）聯(lián)合CA125可能更有利于上皮性卵巢癌的早期診斷，但其效能仍需進一步評估。為了探索鑒別甲狀腺乳頭狀癌與良性結(jié)節(jié)的分子標志物，F(xiàn)arrokhi等［43］基于血清蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn)補體C3和載脂蛋白A4在甲狀腺乳頭狀癌中呈特異性改變，為發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌新的潛在標志物提供了基礎(chǔ)。但仍需進一步擴大樣本驗證。另外，在肺轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的鑒定中，NID1（nidogen 1）被證實可促進黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移，其表達與較差臨床預后相關(guān)［44］。上述研究均為開發(fā)不同腫瘤蛋白標志物給予參考，但研究證據(jù)相對較弱，仍需要進一步深入探索以發(fā)現(xiàn)效能更高、更便捷的蛋白標志物，最終應用于臨床。

表1 基于MS的高通量蛋白質(zhì)組學技術(shù)發(fā)現(xiàn)不同腫瘤蛋白標志物

表1 基于MS的高通量蛋白質(zhì)組學技術(shù)發(fā)現(xiàn)不同腫瘤蛋白標志物（續(xù)表1）

3 結(jié)語

目前，癌癥精準診療的主要挑戰(zhàn)是闡明腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制、尋找特異的生物標志物、開展精準的靶向治療。隨著MS 技術(shù)的飛速發(fā)展，基于MS 的蛋白質(zhì)組學在腫瘤研究中廣泛應用，尤其在發(fā)現(xiàn)有助于早期診斷和預測預后生物標志物等方面獲得了諸多突破。然而有許多瓶頸和技術(shù)難題有待攻克：1）多種技術(shù)并存，各有優(yōu)勢和局限性，難以形成如基因組研究比較一致的方法；2）各種策略間缺乏整合和互補以適應不同蛋白質(zhì)的不同特征；3）研究標本量多較小、統(tǒng)計方法不夠嚴謹、研究設(shè)計未從臨床應用出發(fā)；4）缺乏與其他組學如基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、代謝組學的交叉；5）缺少多中心聯(lián)合，鼓勵全國多中心聯(lián)合共同收集具有中國特色的腫瘤標本，亟待建立中國蛋白質(zhì)表達譜。因此，期待更多的腫瘤蛋白質(zhì)組學研究能夠從臨床應用出發(fā)，在與其他組學整合分析的基礎(chǔ)上，全面系統(tǒng)地闡述癌癥相關(guān)臨床問題。相信隨著技術(shù)的發(fā)展，從臨床問題出發(fā)的腫瘤蛋白質(zhì)組學研究以及多組學整合研究將最終惠及廣大腫瘤患者，為早期診斷和提高生存率建立理論基礎(chǔ)。