益氣解毒方通過Wnt/β-catenin信號通路對鼻咽癌CNE2細胞增殖的影響

范婧瑩　劉潔　劉曉丹　戴娜　何蘭　王賢文　李麗鵬　鄒韻　何迎春

〔摘要〕 目的 探討益氣解毒方對鼻咽癌CNE2細胞增殖及Wnt/β-catenin信號通路的影響。方法 將CNE2細胞用不同濃度（0.25、0.50、1.0 g/L）的益氣解毒方水提物和陽性對照藥（順鉑，4 mg/L）分別處理24、48、72 h，采用MTT法檢測細胞增殖率，流式細胞術檢測藥物作用48 h后細胞周期分布情況;Western blot檢測Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白Wnt5a/b、β-catenin及細胞周期蛋白CyclinD1的表達情況。結果 MTT結果顯示，益氣解毒方對鼻咽癌CNE2細胞增殖具有明顯抑制作用，且其抑制作用與作用時間、藥物濃度呈正相關（P<0.05）。細胞周期結果顯示，處理48 h后，G0/G1期比例降低，S期和G2/M期比例增加（P<0.05， P<0.01）。Western blot結果顯示，水提物處理 48 h 后，Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白Wnt5a/b、β-catenin及細胞周期蛋白CyclinD1的表達量明顯下降（P<0.01）。結論 益氣解毒方可通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白Wnt5a/b、β-catenin及細胞周期蛋白CyclinD1的表達，阻滯細胞周期，抑制人鼻咽癌CNE2細胞的增殖。

〔關鍵詞〕 益氣解毒方;鼻咽癌;Wnt/β-catenin信號通路;細胞周期;細胞增殖

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.05.005

〔Abstract〕 Objective To explore the effects of Yiqi Jiedu Formula （YQ） on proliferation of CNE2 cells and Wnt/β-catenin signaling pathway in nasopharyngeal carcinoma. Methods CNE2 cells were respectively treated with different concentrations （0.25， 0.50， 1.0 g/L） of YQ water extract and positive control medicine （cisplatin， 4 mg/L） for 24， 48， and 72 h. Then cell proliferation rate activity was detected by MTT method and the cell cycle distribution after 48 h was detected by flow cytometry. Western blot method was used to detect the expression levels of key proteins Wnt5a/b， β-catenin and CyclinD1 in Wnt/β-catenin signaling pathway. Results MTT results showed that YQ group had significant inhibitory effect on the proliferation of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells， and the inhibitory effect was positively correlated with the time and medicine concentration （P<0.05）. The results of cell cycle showed that after 48 h of treatment， the proportion of G0/G1 was decreased， and the proportion of S and G2/M was increased （P<0.05， P<0.01）. Western blot results showed that after 48 h of water extraction treatment， the expression levels of Wnt/β-catenin signaling pathway related protein Wnt5a/b， β-catenin and CyclinD1 decreased significantly （P<0.01）. Conclusion YQ could inhibit the proliferation of human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells and block cell cycle by down-regulating the expression of Wnt/β-catenin signaling pathway key proteins Wnt5a/b， β-catenin and CyclinD1.

〔Keywords〕 Yiqi Jiedu Formula; nasopharyngeal carcinoma; Wnt/β-catenin signaling pathway; cell cycle; cell proliferation

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma， NPC）源于鼻咽上皮，是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，我國南方地區(qū)高發(fā)[1]。目前，鼻咽癌的主要治療方法為放療和化療相結合的綜合治療，鼻咽癌的局部控制得到明顯提高，但放、化療有其固有的局限性，如不良反應大、敏感性降低、復發(fā)甚至轉(zhuǎn)移等[2]。因此，選擇合理有效的治療方法對減少治療不良反應及提高鼻咽癌患者的生存率和生活質(zhì)量有重要的意義[3]。田道法教授綜合古今醫(yī)學對鼻咽癌發(fā)病機制的認識，確立了“益氣解毒”治法，并創(chuàng)立益氣解毒方[4]。多年臨床實踐證實，益氣解毒方（以下簡稱YQ）可明顯減輕放療化療所帶來的不良反應[5]。Wnt/β-catenin信號通路在細胞的生長發(fā)育、增殖、分化和凋亡中發(fā)揮重要作用，該信號通路的異常與包括人類鼻咽癌在內(nèi)的許多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[6]。本研究以人鼻咽癌細胞株CNE2為研究對象，探討益氣解毒方對CNE2細胞增殖及Wnt/β-catenin信號通路的影響。

1 材料

1.1? 細胞株

人鼻咽癌細胞CNE2（低分化）購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院細胞庫。

1.2? 藥物

益氣解毒方藥物組成：黃芪30 g，茯苓15 g，黨參15 g，天花粉10 g，黃連10 g，白花蛇舌草10 g，甘草6 g，購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房。水提物具體制備方法參考本課題組前期研究[7]，密封保存于-20 ℃。

注射用順鉑Cisplatin（貨號：P4394-25MG， Sigma公司）。

1.3? 主要試劑及儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone公司）;細胞周期檢測試劑盒（聯(lián)科生物公司）;兔抗鼠Wnt5a/b單克隆抗體、兔抗鼠β-catenin單克隆抗體、兔抗鼠Cyclin D1單克隆抗體、鼠抗兔 β-actin 單克隆抗體（CST 公司）;胎牛血清（Gibco公司）;二甲基亞砜（AMRESCO公司）;彩虹180廣譜蛋白 Marker（Solarbio公司）;R Dye 800CW山羊抗兔熒光二抗、R Dye 680CW山羊抗小鼠熒光二抗（LI-COR公司）。SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）;倒置顯微鏡（日本 Olympus 公司）;Odyssey CLX熒光掃描成像系統(tǒng)（基因有限公司）;賀利氏HERAcell 150i系列 CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾公司）;Guava easyCyte HT流式細胞儀（德國默克密理博）;ELX800全自動酶標分析儀（BioTek公司）。

2 方法

2.1? 細胞培養(yǎng)

將CNE2細胞置于37 ℃、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換培養(yǎng)液，常規(guī)傳代，將含10%胎牛血清的RPMI-1640作為培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

2.2? MTT法檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期細胞，胰蛋白酶消化，重懸成細胞懸液，調(diào)整細胞密度為3×104～5×104個/mL，種于96孔板（每孔100 μL）。過夜，將CNE2細胞分為5組：對照組（Control組）、不同濃度益氣解毒方水提物（YQ組，0.25、0.50、1.0 g/L）、陽性對照順鉑組（Cisplatin組，4 mg/L），每組設置5個復孔，Control組每孔加入200 μL細胞培養(yǎng)液，藥物組每孔加入不同濃度的含藥培養(yǎng)液200 μL。除此，設定空白孔（用于OD值校正）。處理 24、48、72 h后，每孔（包含空白孔）加入MTT溶液100 μL，4 h后，棄上清液，加入二甲基亞砜150 μL/孔。用酶標儀檢測490 nm波長處的吸光度值（A），計算細胞的增殖率。

細胞增殖率=（A實驗組-A空白孔）/（AControl組-A空白孔）×100%

2.3? 流式細胞儀檢測各組細胞的周期

實驗分組同“2.2”，不同濃度藥物處理CNE2細胞48 h后，用胰酶消化各組細胞，重懸成細胞懸液，離心收集細胞，調(diào)整細胞密度為1×106個/mL，加入70%冰乙醇1.0 mL混勻固定，-20 ℃過夜。檢測時，離心棄乙醇，PBS洗3 次，經(jīng)PI染色液染色后，流式細胞儀檢測各組細胞的周期，計算處于G0/G1期、S期和G2/M期的細胞所占比例。

2.4? Western blot法檢測蛋白表達

根據(jù)“2.2”項的結果確定水提物處理CNE2細胞的時間，待CNE2細胞生長至70%～80%，向培養(yǎng)皿中加入不同濃度YQ組（0.25、0.50、1.0 g/L）和Cisplatin組（4 mg/L）各加入含藥培養(yǎng)液3 mL，Control組加入細胞培養(yǎng)液3 mL。處理48 h后冰上提取蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度確定上樣量。點樣，10% SDS-PAGE電泳分離，之后200 mA冰上轉(zhuǎn)膜2 h，室溫封閉1 h，加一抗（稀釋濃度1∶1 000）4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，加熒光二抗（稀釋濃度1∶20 000），避光孵育1 h，洗膜，用Odyssey CLX雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)分析蛋白表達。檢測蛋白指標有β-catenin、Wnt5a/b、CyclinD1、β-actin。

2.5? 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均以“x±s”表示，符合正態(tài)性以及方差齊性使用單因素方差分析，如不滿足，則行秩和檢驗。P<0.05時判定差異具有統(tǒng)計學意義。并用Graph Pad Prism 6.0軟件制作所有結果分析圖。

3 結果

3.1? MTT法檢測益氣解毒方對鼻咽癌CNE2細胞增殖的影響

MTT結果顯示，與Control組比較，不同濃度YQ組（0.25、0.50、1.0 g/L）和Cis組（4 mg/L）分別處理 CNE2細胞 24、48、72 h后，對CNE2細胞增殖具有明顯抑制作用，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且其抑制作用與作用時間、藥物濃度呈正相關。見圖1。

3.2? 益氣解毒方對鼻咽癌CNE2細胞周期的影響

流式細胞術檢測細胞周期結果顯示，與Control組比較，不同濃度益氣解毒方水提物處理CNE2細胞48 h后，隨著水提物濃度增加，細胞所占G0/G1期比例降低;S期和G2/M期比例增加;差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05， P<0.01），主要阻滯細胞周期于G2/M期。見圖2。

3.3? 益氣解毒方對鼻咽癌CNE2細胞周期相關蛋白及Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白表達的影響

Western blot法檢測Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白Wnt5a/b、β-catenin及細胞周期蛋白CyclinD1的表達水平，結果顯示：經(jīng)益氣解毒方水提物處理48 h后，與Control組比較，CNE2細胞中Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白Wnt5a/b、β-catenin及細胞周期蛋白CyclinD1的表達量明顯下降，且具有一定濃度依賴性，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖3。

4 討論

鼻咽癌是最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其發(fā)病具有種族易感性與地域集中性，病因可能與遺傳、環(huán)境、EB病毒感染等因素有關[8-9]。以放療和化療相結合的綜合治療是目前治療鼻咽癌的主要方法，但患者在治療后多易復發(fā)，且存在放療不敏感、化療耐藥等不良反應。因此，如何有效減輕不良反應、降低復發(fā)率是目前臨床治療中面臨的難題。益氣解毒方由黃芪、黨參、天花粉、黃連、白花蛇舌草、茯苓、甘草組成，該方是田道法教授多年的經(jīng)驗用方，具有扶正祛邪、益氣解毒、生津潤燥之功效。多年臨床觀察和實驗研究顯示，益氣解毒方聯(lián)合同期的放化療可明顯減輕放化療后不良反應，提高鼻咽癌患者的免疫力和生存率[10-11]。

本研究通過MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，益氣解毒方對人鼻咽癌CNE2細胞增殖具有明顯抑制作用，且其抑制作用與作用時間、藥物濃度呈正相關。腫瘤的發(fā)生與細胞周期失控密切相關，細胞周期調(diào)控涉及多種信號級聯(lián)傳導機制，當對關鍵“檢查點”G1期、S期或G2期等干擾時將導致腫瘤細胞分裂失控和過度增殖[12-13]。本研究通過流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，益氣解毒方可以使S期和G2/M期的細胞比例增多，主要阻滯細胞周期于G2/M期。目前研究發(fā)現(xiàn)，中藥有效成分主要通過影響周期蛋白、細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）等來影響細胞周期蛋白（Cyclin）-CDK復合物，或通過誘發(fā)DNA損傷、有絲分裂缺陷和胞質(zhì)分裂失敗等使腫瘤細胞阻滯于G2/M期，從而抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡[14]。周程[15]通過研究發(fā)現(xiàn)石蒜堿可下調(diào)細胞周期相關蛋白CyclinD1的表達，將細胞周期阻滯在G2/M期，并且抑制c-myc的表達，誘導細胞凋亡，抑制前列腺癌細胞增殖。Wnt/β-catenin信號通路是目前公認的與腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展密切相關的信號通路，其中β-catenin起關鍵作用[16]。當Wnt/β-catenin信號通路被激活后，GSK3p/APC/Axin復合物的形成被抑制，細胞質(zhì)中游離的β-catenin蛋白含量增多，過量的β-catenin入胞核[17-19]，激活下游眾多靶基因的表達，其中包括CyclinD1、c-myc等，從而導致腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[20]。CyclinD1作為Wnt信號通路的下游靶基因，同時又是細胞周期蛋白家族的一員，現(xiàn)已證實，腫瘤細胞異常增殖與CyclinD1的過度表達并伴隨CDK活性的失調(diào)相關[21]。本研究通過Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，益氣解毒方可以明顯下調(diào)CNE2細胞中Wnt5a/b、β-catenin和CyclinD1的蛋白表達水平，且具有一定濃度依賴性，提示益氣解毒方可通過下調(diào)Wnt5a/b、β-catenin和CyclinD1的蛋白表達，阻滯細胞周期，抑制鼻咽癌CNE2細胞增殖。

綜上所述，本實驗初步說明益氣解毒方可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路阻滯細胞周期，抑制鼻咽癌CNE2細胞增殖，且其抑制作用可能與誘導并促進凋亡相關，具體機制有待進一步深入研究。

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（本文編輯? 蘇? 維）