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    兩株淡水湖泊常見沉水植物共培養(yǎng)對斜生柵藻的抑制作用

    2020-06-15 09:25:46馬浩天張宏江史飛飛崔紅利李潤植
    生物學雜志 2020年3期
    關(guān)鍵詞:斜生柵藻沉水植物

    馬浩天, 張 飛, 張宏江, 史飛飛, 崔紅利, 李潤植

    (山西農(nóng)業(yè)大學 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所, 太谷 030801)

    水生生態(tài)系統(tǒng)由自養(yǎng)生物、異養(yǎng)生物和分解生物組成。各種生物群落及其與水環(huán)境的相互作用,維持著特定的物質(zhì)和能量循環(huán),從而構(gòu)成了一個完整、平衡的生態(tài)單元。但是該系統(tǒng)也會由于某個種群的過度擴大而紊亂,例如藻類[1]。作為主要生產(chǎn)者,藻類廣泛分布于各種環(huán)境的水體,生長速度快,經(jīng)常成為水生生態(tài)系統(tǒng)的優(yōu)勢種,因而可能造成大規(guī)模暴發(fā)而導致水生生態(tài)系統(tǒng)的退化;另一方面,沉水植物是水生單元的重要組成部分,它具有保持水體清澈、增加物種多樣性、為其他生物提供生長區(qū)域、生活媒介和營養(yǎng)等功能[2-3]。藻類和沉水植物在淡水湖中非常常見,因此,它們之間的生態(tài)位重疊更頻繁,關(guān)系更為密切[4]。兩種物種之間既存在附生等協(xié)同作用,也可存在對碳源和營養(yǎng)鹽的競爭作用,在競爭關(guān)系下,沉水植物往往具有獲得優(yōu)勢的能力[5]。有研究證實一些沉水植物對微藻具有化感抑制作用[6]。沉水植物化感作用限制藻類的過度繁殖,是水生生態(tài)系統(tǒng)恢復的關(guān)鍵,作為淡水生態(tài)穩(wěn)定和恢復物種的沉水植物將在水生生態(tài)系統(tǒng)的凈化、穩(wěn)定和正?;矫孀龀龈嘭暙I[7]。

    通過沉水植物抑制微藻生長已經(jīng)取得了廣泛的關(guān)注,閆志強等[8]研究了5種沉水植物及其種植水、浸提液對斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)的化感作用,其中共培養(yǎng)條件的抑藻效果最顯著;楊琳[9]等在研究兩種沉水植物的浸提液對斜生柵藻(S.obliquus) 的化感效應(yīng)中,發(fā)現(xiàn)眼子菜的效果更好。在化感作用的研究中,為研究化感作用的強弱,實驗往往通過共培養(yǎng)、種植水、浸提液等方式進行,且大多探究生物量、抑制率等基礎(chǔ)指標,對微藻的逆境生理關(guān)注較少。因此,本文以淡水湖泊中常見的沉水植物箬葉藻(Potamogetonmalaianus)、金魚藻(Ceratophyllumdemersum),以及淡水水體生態(tài)常用指示生物斜生柵藻(S.obliquus)進行實驗,擬通過測定微藻相關(guān)逆境指標,為上述沉水植物化感作用的效果評價、機理解釋、生態(tài)學研究提供數(shù)據(jù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料及培養(yǎng)

    受試植物斜生柵藻(S.obliquus)、箬葉藻(P.malaianus)、金魚藻(C.demersum)均保管于山西農(nóng)業(yè)大學分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所。斜生柵藻采用BG11培養(yǎng)基pH 7.2±0.2培養(yǎng)于光強3000 lx、光暗比12 h∶12 h、溫度25 ℃±1 ℃的光照箱中。沉水植物經(jīng)蒸餾水沖洗去除雜質(zhì)、5%次氯酸鈉溶液消毒及漂洗后移入BG11培養(yǎng)基中,進行為期14 d的適應(yīng)性培養(yǎng), 培養(yǎng)條件均與斜生柵藻相同。

    1.2 共培養(yǎng)實驗設(shè)置

    根據(jù)前人湖泊生態(tài)學沉水植物豐度的調(diào)查結(jié)果[10],將沉水植物的生物量控制在4.0 g/L左右,即取箬葉藻、金魚藻、金魚藻+箬葉藻各3.0 g, 分別接種于含有750 mL 已滅菌BG11培養(yǎng)基的1 L三角瓶中,并接入斜生柵藻,初始接種量為2.8×105cells/mL,另取750 mL已滅菌 BG11培養(yǎng)基,接入密度為2.8×105cells/mL的斜生柵藻作為空白對照。共設(shè)4個處理,每個處理各重復3次。將三角瓶移至山西農(nóng)業(yè)大學分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所培養(yǎng)室進行培養(yǎng)(光強3000 lx, 光暗比12 h∶12 h,pH 7.2±0.2, 溫度25 ℃±1 ℃), 每日隨機調(diào)換各瓶位置,實驗持續(xù)一周。

    表1 BG11培養(yǎng)基的成分

    1.3 柵藻生物量測定

    柵藻生物量采用血球計數(shù)板法。每日17:00取100 μL混勻后的水樣,經(jīng)魯格試劑固定后置于光學顯微鏡下進行細胞計數(shù),每個處理重復3次。

    1.4 柵藻生理指標的測定

    1.4.1 柵藻葉綠素熒光觀察

    取藻樣20 μL滴于載玻片上,小心加蓋蓋玻片,防止產(chǎn)生氣泡,隨后將玻片置于正置熒光顯微鏡(OLYMPUS, BX53),選擇藍光為激發(fā)光,在鏡下觀察并拍照。

    1.4.2 柵藻葉綠素含量的測定

    葉綠素含量測定參照Arnon等的方法[11],取藻樣8 mL, 10 000 r/min 離心10 min后將藻細胞重懸于5 mL 80% (V/V) 預(yù)冷丙酮中,石英砂研磨后將勻漿離心(10 000 r/min, 10 min, 4 ℃),取上清液,使用分光光度計測定645和663 nm處的吸光值,按照下式計算:

    葉綠素b含量=總?cè)~綠素含量-葉綠素a含量

    公式中:A663為663 nm樣品吸光值,A645為645 nm樣品吸光值。

    1.4.3 柵藻粗酶液的提取及抗氧化系統(tǒng)相關(guān)指標的測定

    試驗結(jié)束后收集藻類培養(yǎng)物樣品(50 mL),以4000 r/min離心20 min,棄去上清液。將收集的藻類轉(zhuǎn)移到5 mL PBS緩沖溶液(pH 7.8)中,在4 ℃下用石英砂研磨,將研磨后的勻漿在4 ℃下以8000 r/min離心20 min。上清液用于測定CAT、SOD、POD、MDA等指標,CAT采用紫外分光光度法[12],SOD采用氮藍四唑法[13],POD采用愈創(chuàng)木酚法[14],MDA采用硫代巴比妥酸法[15]測定。

    1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

    沉水植物對斜生柵藻的抑制率公式[16]如下:

    公式中:Id為抑制率/(%),N0為空白對照中的微藻生物量,N為處理組中的微藻生物量。

    試驗數(shù)據(jù)重復3次,試驗結(jié)果使用SPSS13.0軟件(SPSS Inc.), Tukey法分析試驗結(jié)果在P<0.05水平上是否具有顯著性差異,使用Origin8.0軟件(OriginLab Inc.)繪制統(tǒng)計圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 兩種沉水植物對斜生柵藻的生長抑制效應(yīng)

    兩株沉水植物對斜生柵藻的細胞密度影響見圖1。試驗結(jié)果表明,兩種沉水植物(金魚藻、箬葉藻)及其混合種植對斜生柵藻的生長具有顯著的抑制作用,隨著培養(yǎng)周期的增加,微藻的細胞密度漸進性減少,在第6天時達到最低,與金魚藻共培養(yǎng)的柵藻密度為0.44×105cells/mL, 與箬葉藻共培養(yǎng)的柵藻密度為0.42×105cells/mL, 而在沉水植物混合種植的條件下,微藻的生物量為0.66×105cells/mL;均顯著低于空白對照組生物量(9.82×105cells/mL)。

    沉水植物對斜生柵藻的抑制率也隨著培養(yǎng)時間的延長而增加,并在第6天時達到最大,金魚藻對藻類的抑制率達到95.5%,箬葉藻達到95.7%,混合組達到93.2%。第7天時,抑制率有所下降,微藻生物量有一定程度的恢復,但是仍然保持在極低水平(圖1)。

    2.2 兩種沉水植物對斜生柵藻葉綠素含量的影響

    采用熒光顯微鏡觀察葉綠素自發(fā)熒光進行定性分析。如圖2所示,空白對照組柵藻細胞在白光下清晰可見,顏色呈現(xiàn)深綠色,在藍光激發(fā)下,細胞中的葉綠素自發(fā)橘紅色熒光,熒光清晰、均勻,未見異常光點;在金魚藻處理中,藻細胞顏色較淺,但尚可觀察,藍色激發(fā)光下表現(xiàn)出不均一的紅色,摻加黃綠色光點;柵藻細胞在箬葉藻處理中較為透明,白光下若干細胞不可見,僅能在激發(fā)光下觀察到亮度較高的綠色,形態(tài)不規(guī)整,樣本以亮綠色居多;與箬葉藻處理相同,混合組內(nèi)若干藻細胞在白光下不可見,激發(fā)光下表現(xiàn)出亮綠色,紅色光較少。

    圖1 共培養(yǎng)條件下沉水植物對斜生柵藻的生長影響及抑制率

    通過檢測葉綠素a、b含量進行定量分析。如圖3所示,與對照相比,各個處理均顯著減少了斜生柵藻葉綠素a、b的含量(P<0.05)。在試驗結(jié)束時,箬葉藻影響下的柵藻葉綠素含量僅相當于空白對照組的30%左右,在其余處理中,柵藻的葉綠素含量也有所下降,但均不如箬葉藻組明顯。

    圖2 葉綠素自發(fā)熒光定性檢測

    2.3 斜生柵藻應(yīng)對沉水植物化感作用的生理響應(yīng)

    斜生柵藻在沉水植物抑制時會產(chǎn)生生理應(yīng)答,因此本實驗測定了各處理中斜生柵藻抗氧化酶活、丙二醛和可溶性蛋白、可溶性多糖的影響。

    2.3.1 沉水植物對斜生柵藻抗氧化系統(tǒng)的影響

    過氧化氫酶活性是衡量細胞清除過氧化氫能力的重要指標。在沉水植物組中,CAT顯著增高,與對照相比,最高增加了57.4%(箬葉藻組)。丙二醛通常用來反映細胞膜脂過氧化程度。3組處理均顯著提高了柵藻細胞丙二醛的含量(P<0.05)。與空白對照相比,金魚藻組、混合組分別提高了88.3%、89.3%的丙二醛,而箬葉藻組相對增加較少,約為83.3%。

    過氧化物酶是細胞抗氧化系統(tǒng)的重要酶,一定程度上反映衰老程度。與先前的指標類似,其在沉水植物影響下顯著增高;不同的是,超氧化物歧化酶活性增加不明顯,各個處理間差異不太顯著。

    圖4 沉水植物對斜生柵藻抗氧化系統(tǒng)的影響

    2.3.2 沉水植物對斜生柵藻可溶性蛋白、可溶性糖的影響

    可溶性蛋白質(zhì)和糖含量如圖5所示。沉水植物抑制了斜生柵藻的蛋白質(zhì)含量(柱狀圖),各處理均低于對照(P<0.05),但糖合成受到刺激,可溶性糖含量增多。

    圖5 沉水植物對柵藻可溶性蛋白、可溶性多糖含量的影響

    3 討論

    沉水植物通過分泌化學物質(zhì)抑制同一環(huán)境內(nèi)微生物藻類的生長,這似乎可以作為控制水體藻類數(shù)量的方法,但是沉水植物的種類、生物量等條件都會影響對藻類的化感作用[17]。本研究通過參考淡水湖泊中沉水植物的最大生物量設(shè)置濃度,選擇了兩種常見的沉水植物(金魚藻、箬葉藻),以及淡水環(huán)境常用指示藻種(斜生柵藻)作為供試材料,在相對自然的生物量條件下進行實驗,探究沉水植物化感作用對斜生柵藻的影響。通過實驗發(fā)現(xiàn),金魚藻、箬葉藻及其混合培養(yǎng),都會對斜生柵藻的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用,并持續(xù)較長時間,這與先前的諸多報道基本相似;在共生條件下,微藻生長勢的抑制可能是由于營養(yǎng)元素的缺失或者沉水植物遮擋光照而引起的,然而,根據(jù)Wu等[18]的研究,營養(yǎng)鹽競爭、影響光照等因素均可以排除。

    另外,在第7天時,微藻的生物量呈現(xiàn)一定程度的恢復趨勢,推測生物量的恢復與沉水植物分泌的化感物質(zhì)的揮發(fā)或者分解有關(guān)[19],因其多為有機酸、揮發(fā)油和酚類[20-21]。

    在生理學層面上,藻類可以對化感抑制做出反應(yīng),其光合系統(tǒng)、抗氧化防御系統(tǒng)和膜脂質(zhì)過氧化都會發(fā)生一系列變化。測定逆境生理學指標有助于明確化感物質(zhì)抑制藻類的機理,然而,現(xiàn)有的大部分研究大多著重于測定微藻生物量等基礎(chǔ)指標,對逆境指標測定甚少。

    葉綠素是藻類光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[22]。在本研究中,與沉水植物共培養(yǎng)時藻類葉綠素濃度降低,葉綠素自發(fā)熒光變?nèi)?,可能是因為化感物質(zhì)導致微藻葉綠素的降解,這證明柵藻光合系統(tǒng)的損傷。

    抗氧化酶活性通常用來衡量活性氧積累和細胞的抗氧化能力。通常情況下,ROS在以POD、CAT和SOD等酶組成的抗氧化系統(tǒng)作用下穩(wěn)定代謝[23]。在本研究中,POD、CAT等抗氧化酶含量升高,以緩解化感抑制下的ROS積累;SOD的含量變化不明顯,可能是因為SOD的合成結(jié)構(gòu)遭到破壞,導致SOD的活力下降,因此CAT和POD的含量維持高水平用以對抗活性氧迸發(fā),植物細胞的抗氧化防御系統(tǒng)具有多種抗氧化酶,其中各個酶的關(guān)系和反應(yīng)先后仍需進一步研究。膜脂過氧化程度通常用MDA衡量,本實驗中,SOD的活性下降,抗氧化防御效率降低,自由基紊亂,膜脂過氧化加劇,因而MDA含量增加[24]。

    不同處理的可溶性蛋白含量下降,可能是在化感物質(zhì)脅迫下,藻細胞蛋白質(zhì)合成機制被破壞,另一方面,隨著抗氧化系統(tǒng)效率變低,過量的ROS阻礙了酶的合成機制,因此導致了總蛋白的缺失[25]。相反,可溶性總糖含量顯著增加,猜測是藻細胞為了去除過量的ROS而產(chǎn)生具有抗氧化功能的糖,Li等[26]的研究證明一種念珠藻可以分泌具有抗氧化功能的糖,可以增強抗氧化活性。總之,沉水植物可以通過產(chǎn)生特異性的抑制微藻生長、光合作用及抗氧化酶系統(tǒng)的化學物質(zhì),從而在競爭中取得優(yōu)勢。

    4 結(jié)論

    現(xiàn)階段微藻雖已在實際生產(chǎn)中大規(guī)模引用,例如生物質(zhì)生產(chǎn)、污水處理等生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)[27],但是自然水體中微藻的暴發(fā)往往會導致水生態(tài)系統(tǒng)的崩潰。生物控藻、殺藻等技術(shù)愈來愈重要,與傳統(tǒng)化學殺藻劑相比也更符合綠色生態(tài)平衡的理念,因此基于化感作用的控藻技術(shù)得到了較多生態(tài)學工作者的關(guān)注。在本研究中,發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)沉水植物在共培條件下均可抑制斜生柵藻的生長,并對其抗氧化系統(tǒng)和光合系統(tǒng)造成較大損害,為后續(xù)化感作用抑制微藻的分子機理奠定了生理學基礎(chǔ)。

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