松嫩平原異質(zhì)生境蘆葦?shù)谋碛^遺傳多樣性和結(jié)構(gòu)

邱 天

(1. 長春師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 長春 130032； 2. 東北師范大學(xué) 植被生態(tài)科學(xué)教育部重點實驗室， 長春 130024；3. 東北師范大學(xué) 分子表觀遺傳學(xué)教育部重點實驗室， 長春 130024)

蘆葦(Phragmitesaustralis(Cav.) Trin. ex Steud.)是一種分布廣泛的濕地禾草，營養(yǎng)繁殖能力強(qiáng)，經(jīng)常出現(xiàn)在河湖岸邊的沼澤，也分布在旱地生境和其他承受著非生物脅迫的地區(qū)[1-2]。它豐富的表型變異、遺傳上高度的變異性以及靈活的繁殖對策使其成為世界性物種，在中國東北的松嫩平原上也廣泛分布。在堿化草甸上經(jīng)常作為伴生種生長，但在局域低洼地或堿斑上能形成單優(yōu)種群落[3]。由于高產(chǎn)和高蛋白含量，它是松嫩平原主要的飼草之一。蘆葦具有多年生根莖系統(tǒng)和對天然脅迫環(huán)境較強(qiáng)的適應(yīng)性，因此能保留土壤養(yǎng)分，在生態(tài)修復(fù)方面具有重要的應(yīng)用價值[4]。

在研究多年生物種的分子生態(tài)學(xué)問題時，常采用基因組掃描方法，應(yīng)用擴(kuò)增片段長度多態(tài) (Amplified fragment length polymorphisms, AFLPs)研究種群遺傳多樣性是眾多方法中最有效的方法之一[5-7]。這種分子標(biāo)記已經(jīng)用于短芒野大麥(Hordeumbrevisubulatum)[8]、羊草(Leymuschinensis)[5]、虎杖(Fallopiajaponica)[9]、空心蓮子草(Alternantheraphiloxeroides)[10]、藏菠蘿花(Incarvilleayounghusbandii)[11]和堇菜屬植物(Violacazorlensis)[12]等物種的研究中。在最初AFLP技術(shù)基礎(chǔ)上加以改良，即應(yīng)用毛細(xì)管電泳的熒光AFLP標(biāo)記方法，由于其分辨率高、敏感性高以及所需樣本量少而成為一種有效、可靠的技術(shù)手段[13]。

在松嫩平原多種生境上生長的蘆葦表現(xiàn)出容易辨別的不同表型特征，包括葉片、根莖、苗的形態(tài)和生物量等方面[4,14]。我們關(guān)注于多種生境中的兩種。生境1(記為H1)是有季節(jié)性積水的低洼地，土壤為堿化草甸土，pH 8～8.5；生境2(記為H2)是沒有季節(jié)性積水的光堿斑，pH大于10。近50年來松嫩平原嚴(yán)重的土壤鹽堿化和植被退化導(dǎo)致草地上多種生境呈鑲嵌體形式存在，而H1和H2是其中的兩種。

關(guān)于松嫩平原蘆葦遺傳多樣性的初步調(diào)查表明，跨越一定地理范圍的蘆葦存在廣泛的遺傳變異[3]。除了序列變異，表觀遺傳機(jī)制能夠引起生態(tài)上相關(guān)的形態(tài)特征變異，其能被環(huán)境直接干擾而且遺傳給下一代，因此它是生物個體對環(huán)境響應(yīng)的一種重要的機(jī)制。DNA甲基化變異是迄今研究最多的表觀遺傳機(jī)制，在植物中可遺傳。然而迄今為止，只有少量實驗應(yīng)用MSAPs(Methylation-sensitive amplified polymorphisms，即甲基化敏感的AFLPs)研究天然植物種群的甲基化變異[6]，在小空間尺度上的研究更少[15-16]。鑒于此，作者在大致10 km×5 km范圍內(nèi)對兩種生境的蘆葦植株進(jìn)行DNA水平的研究，分析了其表觀遺傳多樣性和結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 研究生境的自然概況和材料取樣

材料來自于松嫩平原吉林省長嶺縣東北師范大學(xué)草地科學(xué)研究站內(nèi)(123°45′E, 44°45′N)。該區(qū)域?qū)儆跍貛О敫珊怠霛駶櫦撅L(fēng)氣候。兩種蘆葦分布在土壤含水量和pH值不同的生境里。在H1中，土壤是堿化草甸土，pH 8～8.5，在雨季有季節(jié)性積水。單優(yōu)種蘆葦群落由于有充分的水分供應(yīng)而高大茂盛，群落蓋度85%以上。在H2中，堿斑土壤板結(jié)，表層土完全喪失，pH值大于10。植株矮小，零星地呈叢分布，形成單優(yōu)種群落，群落蓋度小于20%。每種生境的蘆葦由于多種生境呈鑲嵌體形式存在而分布廣泛。在大致10 km×5 km研究范圍內(nèi)，隨機(jī)采集每種生境20個個體，它們位于研究站的西部、中部和東部，即每種生境3個種群。所有個體至少間隔30 m，以避免采集同一基株。H1和H2每個采樣地點的個體數(shù)分別是6、7、7和7、6、7，最小化蘆葦采集量對局域土壤的影響是一個考慮因素。葉片用充足的硅膠干燥后儲存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 MSAP表觀遺傳印記

應(yīng)用改良的CTAB法提取基因組DNA[17-19]。在標(biāo)準(zhǔn)的AFLP基礎(chǔ)上，有少量技術(shù)改進(jìn)[17-19]，包括應(yīng)用熒光標(biāo)記選擇性引物和96道毛細(xì)管的ABI-automated 3730XL基因分析儀。通過篩選得到能提供最可靠譜帶的引物，引物序列參見文獻(xiàn)[20]。MSAP和AFLP的操作一致，只是MspⅠ或HpaⅡ取代了MseⅠ，MspⅠ和HpaⅡ能夠識別相同的5′-CCGG位點但對甲基化的敏感性不同。ROX500 Marker (Applied Biosystems) 用于每一個樣本。應(yīng)用軟件GeneMapper v.4.1收集、記錄原始數(shù)據(jù)。通過兩次獨(dú)立的AFLP分析，只記錄重復(fù)性好的譜帶，并用二進(jìn)制數(shù)記錄，即“0”代表無帶而“1”代表有帶。所有樣本只有一條不一致譜帶的情況不記。只記錄大于等于100 bp的譜帶。MSAP譜帶有3種不同的類型：1)EcoR I/HpaII和EcoR I/MspI酶切擴(kuò)增產(chǎn)物中均有帶；2)EcoR I/HpaII和EcoR I/MspI酶切擴(kuò)增產(chǎn)物中均無帶；3)僅EcoR I/HpaII 或EcoR I/MspI酶切擴(kuò)增產(chǎn)物中有帶。類型(1)代表非甲基化狀態(tài)，類型(3)代表甲基化狀態(tài)，類型(2)代表序列突變或甲基化增加，記為缺省值。根據(jù)MspI和HpaII不一致情況的比率是否超過誤差引起不一致的比率，將每個位點分為“甲基化敏感的位點”(Methylation susceptible loci, MSL)或“甲基化不敏感的位點”(Non-methylated loci, NML)[21]。在樣本情況未知的情況下進(jìn)行記帶和統(tǒng)計。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用R軟件中的msap軟件包分析MSAP結(jié)果[22]。應(yīng)用Popgene 1.32軟件得到生境的多態(tài)位點百分比(P)和香濃維納信息指數(shù)(I)數(shù)據(jù)[23]。應(yīng)用GENALEX 6.5(999 random permutations)進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)，將方差分解為生境間、種群間以及種群內(nèi)成分用以評價表觀遺傳結(jié)構(gòu)[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 表觀遺傳多樣性

在938個MSAP位點中，633個是甲基化敏感位點(MSL)，其中71.09%～88.38%是多態(tài)位點；305個位點是甲基化不敏感位點(NML)，81.82%～88.12%是多態(tài)位點。記帶誤差率較低，在2.9%以下(表1)。在生境內(nèi)水平，H1和H2中分別有12.33%、11.31%的甲基化敏感位點(MSL)是外側(cè)胞嘧啶半甲基化的，14.14%、14.69%的位點是內(nèi)側(cè)胞嘧啶甲基化的，18.6%、19.38%是未甲基化的，以及其余的54.93%、54.63%是全甲基化或由于序列突變而缺乏限制性酶切位點的。由此可見兩種生境內(nèi)側(cè)胞嘧啶甲基化的比率均高于外側(cè)胞嘧啶半甲基化的比率。H1外側(cè)胞嘧啶半甲基化的水平比H2的高約1%，H2的內(nèi)側(cè)胞嘧啶甲基化水平比H1的高約0.5%，可以確定總甲基化水平H1比H2略高。而H2的未甲基化情況的比率高于H1的。所有位點中，H1和H2分別有82.75%和79.93%位點是多態(tài)的，香濃維納信息指數(shù)(I)分別是0.3712和0.358，可見H1高于H2(表2)。

表1 MSAP各引物組合下擴(kuò)增位點的表觀遺傳多樣性信息

注：①記帶誤差率=(100×兩次獨(dú)立分析中不一致的標(biāo)記數(shù))/(標(biāo)記數(shù)×個體數(shù))。②不一致的EcoR I-HpaII 和EcoR I-MspI標(biāo)記的平均可能性=eHpa+eMsp-2×eHpa×eMsp，其中eHpa和eMsp為記帶誤差率

Note: 1)The scoring error rates were calculated as 100×(number of inconsistent scores in two independent analyses)/(number of markers×number of individuals).2) Estimated average probability of receiving inconsistentEcoR I-HpaII andEcoR I-MspI scores was calculated as eHpa+eMsp-2eHpaeMspfrom the scoring error rates eHpaand eMsp

表2 2種生境蘆葦?shù)谋碛^遺傳多樣性參數(shù)和甲基化水平

2.2 表觀遺傳結(jié)構(gòu)

Hierarchical AMOVA表明生境間表觀遺傳分化達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，它解釋了1.75%的總體分子方差，2.67%歸因于生境內(nèi)種群間的極顯著分化(P<0.01)，95.57%歸因于種群內(nèi)極顯著分化(P<0.001)。種群表觀遺傳分化的量度PhiPT，與FST類似，值為0.044(表3)。

3 討論與結(jié)論

迄今為止，有關(guān)評價野生植物種群的表觀遺傳變異的范圍和結(jié)構(gòu)的報道還很少。DNA甲基化變異可以遺傳，影響植物表型甚至進(jìn)化。本文研究分析了蘆葦在兩種生境DNA甲基化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)植株存在廣泛的DNA甲基化，約2/3的MSAP位點是甲基化敏感位點(MSL)，約1/3的位點是甲基化不敏感位點(NML)。MSL中多態(tài)位點所占的百分比較高，這與紫羅蘭Violacazorlensis的研究報道相一致[21]。高水平的表觀遺傳基因型變異可能會帶來更多的表型和進(jìn)化靈活性，甚至影響物種的分布。在美國緬因州，入侵種蘆葦比本地種的表觀遺傳變異更多就例證了這一點[16]。本文發(fā)現(xiàn)了廣泛的生境內(nèi)方差，這是由個體變異所致，單獨(dú)個體的表觀遺傳變異是植物發(fā)生微進(jìn)化的先決條件[21]。

表3 基于MSAP譜帶的蘆葦不同生境間和生境內(nèi)的AMOVA結(jié)果(生境內(nèi)按地理位置分3個種群)

本文還發(fā)現(xiàn)了兩種生境之間明顯的表觀遺傳分化。由于表觀遺傳修飾能在變化的環(huán)境中改變基因表達(dá)，進(jìn)而改變表型，而又不依賴遺傳變異，這可能解釋了不同生境蘆葦表型不同的原因。此外，分子方差結(jié)果表明,天然蘆葦?shù)谋碛^遺傳變異能夠分成生境間和生境內(nèi)不同的組分。

H1的表觀遺傳多樣性參數(shù)的值均高于H2的值，這與生境幅度變異假說一致[25]。即如果種群所在的生境范圍更廣闊、更加多樣，如H1，會比生境范圍狹窄的種群如H2的變異更多。

關(guān)于特定表觀遺傳位點類型是僅僅作為遺傳變異的下游產(chǎn)物，還是獨(dú)立于遺傳變異，仍然是一個亟待解決的問題。本文中表觀遺傳變異的類型可能是遺傳變異導(dǎo)致的，也可能與生物體應(yīng)對異質(zhì)生境發(fā)生分化有關(guān)。盡管基因組重組和遺傳突變推動著生物體長期的進(jìn)化，而表觀遺傳修飾也能使局域環(huán)境中的生物更快、更靈敏地適應(yīng)變化的環(huán)境[26]。

總之，本研究結(jié)果有助于人們對小空間尺度上局域生境蘆葦?shù)谋碛^遺傳基礎(chǔ)的深入理解。蘆葦基因組MSAP標(biāo)記的數(shù)據(jù)將為生態(tài)適應(yīng)性理論研究和包括生態(tài)修復(fù)、遺傳改良在內(nèi)的保護(hù)和應(yīng)用研究，提供有價值的參考。