川續(xù)斷根蛋白提取工藝的優(yōu)化及分析

晉海軍， 蔣廷紅， 王海霞， 申旭峰， 于 花， 朱 姍， 張 嘉

(貴州中醫(yī)藥大學實驗中心， 貴陽 550025)

川續(xù)斷(DipsacusasperoidesC. Y. Cheng et T. M. Ai)為川續(xù)斷科川續(xù)斷屬植物，藥用部位為干燥根，具有補肝腎、強筋骨、續(xù)折傷、止崩漏等功效[1]。但不同產(chǎn)地的川續(xù)斷受不同生態(tài)因子影響，導致其藥材質(zhì)量存在一定差異[2-3]。在不同生長環(huán)境下，不同產(chǎn)地中藥材細胞里面的基因可能是穩(wěn)定不變的，但是其蛋白質(zhì)的表達卻在時刻發(fā)生改變。因此，蛋白質(zhì)層面的分析有助于我們對不同產(chǎn)地中藥材質(zhì)量差異形成的機制展開研究[4-5]。進行蛋白質(zhì)組學研究時，蛋白提取過程易造成樣品蛋白損失，需要對蛋白的提取過程進行優(yōu)化，以獲得盡可能多的蛋白[6]。目前，在蛋白組層面對不同產(chǎn)地川續(xù)斷展開研究的報道較少。本研究擬通過對川續(xù)斷根蛋白提取工藝的響應面優(yōu)化及對不同產(chǎn)地間川續(xù)斷根蛋白的SDS-PAGE電泳條帶分析，為今后在蛋白質(zhì)組層面進一步揭示不同產(chǎn)地川續(xù)斷質(zhì)量差異形成的分子機制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料川續(xù)斷根采自湖北鶴峰、貴州息烽和云南劍川的川續(xù)斷種植基地，每產(chǎn)地多點隨機取樣，各采30株，洗凈液氮速凍，-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 蛋白提取

取3種不同產(chǎn)地川續(xù)斷的塊根各4.0 g 分別剪碎放入研缽中，不斷加入液氮，迅速研磨，待研磨成粉末時，用潔凈的小勺將其裝入離心管中；加入3倍體積蛋白質(zhì)提取緩沖液(0.5% SDS，65 mmol/L Tris-HCl pH 6.8， 5% β-巰基乙醇，10%甘油)混勻；離心管置于冰上10 min左右，每2 min震蕩1次；置于4 ℃冰箱，浸提1 h；4 ℃，15 000 r/min離心15 min；取上清液，加入3倍體積-20 ℃預冷的10%TCA丙酮溶液，混勻后置于-20 ℃冰箱1 h，使蛋白質(zhì)沉降；4 ℃，15 000 r/min離心15 min，棄上清液；沉淀先用預冷丙酮洗滌1次，再用預冷80%丙酮洗滌2次；4 ℃，15 000 r/min離心15 min，沉淀于冰上自然揮干丙酮，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛋白含量測定

將上一步制得的1 mg 蛋白干粉加入至200 μL 水化液(2 mol/L硫脲，7 mol/L尿素，4%CHAPS， 65 mmol/L DTT 和0.2% Bio-Lyte)中， 4 ℃搖床裂解4 h；15 000 r/min， 離心10 min，上清液即為蛋白樣品液。采用 Bradford 法蛋白定量。選用牛血清白蛋白(BSA) 作為標準蛋白，測其在595 nm 處的吸光值，繪制標準曲線，測樣品蛋白的吸光度值，計算其蛋白濃度。

1.2.3 蛋白質(zhì)的SDS-PAGE檢測分析

將1.2.2中制備的蛋白樣品液分裝至離心管(每管含蛋白20 μg)，加兩倍上樣緩沖液(0.5 mol/L pH 6.8 Tris-HCl 2 mL，甘油2 mL，20% SDS (W/V) 2 mL，0.1% 溴酚藍0.5 mL，2-β-巰基乙醇1 mL，雙蒸水2.5 mL，配制成總體積10 mL pH 8.0的溶液) 20 μL，置沸水中水浴5 min，瞬時離心取上清，進行SDS-PAGE電泳。蛋白電泳、染色和脫色方法采用胡朝敦等[7]的方法。用Image-Pro Plus軟件對獲得的蛋白電泳條帶進行灰度值差異顯著性分析(P<0.05)。

1.2.4 蛋白提取工藝的響應面優(yōu)化

以提取溫度、提取時間、pH值和料液比4個因素進行試驗，每因素設(shè)計3個水平，用Design Expert V8.06 軟件的Box-Benhnken 實驗方案進行響應面優(yōu)化(表1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地川續(xù)斷根蛋白質(zhì)含量

以Tris-HCl法提取不同產(chǎn)地川續(xù)斷根蛋白。由表2可知，湖北產(chǎn)的川續(xù)斷根中蛋白含量較高，貴州次之，云南較低。

表1 Box-Benhnken試驗因素水平

表2 不同產(chǎn)地川續(xù)斷根蛋白含量

1：云南產(chǎn)川續(xù)斷；2：湖北產(chǎn)川續(xù)斷；3：貴州產(chǎn)川續(xù)斷(圖中箭頭指示處為篩選的差異蛋白條帶)

圖1不同產(chǎn)地川續(xù)斷根蛋白SDS-PAGE圖

Figure 1 SDS-PAGE ofDipsacuasperidesroot protein from different habitats

2.2 不同產(chǎn)地川續(xù)斷根蛋白的SDS-PAGE檢測分析

由圖1可知，川續(xù)斷根蛋白的分子量大致分布在15～65 ku之間，不同產(chǎn)地川續(xù)斷根蛋白條帶分布有一定差異。經(jīng)Image-Pro Plus軟件的灰度值差異分析(表3)，發(fā)現(xiàn)在24 ku和34 ku處有兩條顯著差異蛋白條帶(P<0.05，圖1)，24 ku處不同產(chǎn)地間蛋白表達灰度值為：湖北>云南>貴州，34 ku處不同產(chǎn)地間蛋白表達灰度值為：云南>湖北>貴州，可能這兩處的差異蛋白與不同產(chǎn)地間川續(xù)斷藥材質(zhì)量差異的形成有關(guān)。

表3 差異蛋白灰度值

注：差異顯著性分析取 α=0.05水平，同一列中含不同字母者為差異顯著

2.3 川續(xù)斷根蛋白提取工藝的響應面優(yōu)化

2.3.1 響應面試驗設(shè)計及結(jié)果

目前，尚無川續(xù)斷根蛋白提取工藝的相關(guān)報道。研究依據(jù)Box-Benhnken實驗原理對Tris-HCl法提取川續(xù)斷根蛋白的工藝進行響應面優(yōu)化，考察提取溫度、提取時間、pH值和料液比四因素對蛋白質(zhì)定量的吸光度值(OD值)的影響，響應值為蛋白質(zhì)定量的吸光度值(OD值)，試驗方法為四因素三水平的響應面分析法，24個分析因子(1-24)，3個中心試驗點(25-27)，共有27個試驗點(表4)。

2.3.2 響應面試驗模型的建立與顯著性檢驗

利用Design Expert V 8.0.6 軟件對表4的數(shù)據(jù)回歸擬合以蛋白含量檢測的OD值為響應值，提取溫度(A)、提取時間(B)、pH值(C)及料液比(D)為自變量，建立回歸方程：

OD值=1.68+0.4A-0.05B+8.742×10-3C-0.15D-0.028AB+0.16AC-0.14AD+4.05×10-3BC-0.13BD-0.056CD-0.80A2-0.09B2-0.28C2-0.25D2

對二次回歸方程預測模型進行顯著性檢驗，結(jié)果見表5。該模型的顯著性水平P<0.0001，說明此模型高度顯著；R2=0.9607，且失擬項不顯著(P=0.0686>0.05)，說明此模型與實際試驗擬合較好。因此，該二次回歸方程預測的模型具備較高的可信度與擬合度，可用該方程代替實驗真實點對實驗的結(jié)果展開預測與分析。結(jié)果還表明，A、D、A2、C2、D2對蛋白含量OD值的影響高度顯著，各因素的交互作用均不顯著，所以實驗中不同因素對OD值的影響并非簡單線性關(guān)系。各因素對蛋白含量OD值的影響因素大小為：提取溫度>料液比>提取時間>pH值。

表4 Box-Benhnken 試驗設(shè)計與結(jié)果

表5 二次回歸方程模型的方差分析

注：“**”高度顯著差異，P<0.01；“*”顯著差異，P<0.05

2.3.3 響應面分析

響應面的等高線圖和曲面圖可直觀反映兩個影響因素的交互作用對響應值的影響，等高線圖越近橢圓形則兩因素交互作用對OD值的影響越顯著。由圖2可知，兩因素交互作用對蛋白含量OD值的影響大小依次為：提取溫度與pH值、提取溫度與料液比、料液比與提取時間、料液比與pH值、提取溫度與提取時間、pH值與提取時間。

2.3.4 驗證性實驗

經(jīng)對回歸方程預測模型計算得出川續(xù)斷根蛋白提取的最佳工藝參數(shù)：提取溫度16.84 ℃，提取時間0.84 h，pH值6.58，料液比1∶1.64。此最佳條件下預測出的OD值預測值為1.7156。此最佳提取條件下提取蛋白，測量OD值，重復3次，蛋白提取的平均OD值為1.7075(表6)，此OD值與預測值間的相對誤差為0.47%，說明此響應面優(yōu)化實驗得出的最佳蛋白提取條件準確可靠。

圖2 兩因素交互作用的響應面和等高線圖

3 討論與結(jié)論

目前，有關(guān)不同產(chǎn)地川續(xù)斷質(zhì)量差異的報道較多，但大多集中在生理、藥理及核酸層面[8-10]，尚無在蛋白組層面揭示不同產(chǎn)地質(zhì)量差異的報道。

表6 驗證實驗

本研究運用紫外分光光度法，對不同產(chǎn)區(qū)的川續(xù)斷進行蛋白定量及SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示，湖北產(chǎn)的川續(xù)斷根中蛋白含量較高，貴州次之，云南較低；經(jīng)SDS-PAGE分析，不同產(chǎn)地川續(xù)斷根蛋白條帶分布存在一定差異，在24 ku和34 ku處有兩條較明顯的差異蛋白條帶在云南及湖北產(chǎn)的川續(xù)斷根蛋白中有表達，而在貴州產(chǎn)的川續(xù)斷根蛋白中則沒有表達，34 ku處的蛋白條帶在云南產(chǎn)川續(xù)斷根中表達量遠高于湖北，可能這兩處的差異蛋白與不同產(chǎn)地間川續(xù)斷藥材質(zhì)量差異的形成有關(guān)，34 ku處的差異蛋白條帶可作為鑒別湖北、云南、貴州不同產(chǎn)地川續(xù)斷的特征蛋白條帶。李曉琳等[11]用SDS-PAGE方法揭示出不同產(chǎn)地刺五加種子蛋白電泳圖譜具有一定種內(nèi)差異。俞樂等[12]經(jīng)蛋白電泳分析，指出不同產(chǎn)地芡實在45.0～66.2 ku處均有一條明顯的蛋白譜帶。張延紅等[13]的甘草種子蛋白提取及SDS-PAGE電泳技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)烏拉爾甘草和脹果甘草種子間存在差異蛋白質(zhì)條帶。因而，可通過蛋白電泳技術(shù)，在蛋白組層面尋找同一物種在不同產(chǎn)地間的差異，也可將此差異作為不同產(chǎn)地間物種鑒定的依據(jù)。

本研究首次利用響應面優(yōu)化法得到了川續(xù)斷根蛋白最佳的提取工藝條件：提取溫度16.84 ℃，提取時間0.84 h，pH值6.58，料液比1∶1.64。