柱前衍生化-HPCE法測定霍山石斛中游離氨基酸

陳乃東， 朱 賽， 王榮花， 徐文冬， 石敏珠

(1. 皖西學院 生物與制藥工程學院， 六安 237012; 2. 安徽省中藥資源保護與持續(xù)利用工程實驗室院， 六安 237012)

游離氨基酸作為中藥炮制或食品加工過程中參與米拉德反應(yīng)的底物，是影響中藥炮制中組分變化和食品風味的關(guān)鍵物質(zhì)[1-2]?；羯绞?DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)，是蘭科石斛屬的草本植物[3-5]，含多糖、多酚、皂苷、生物堿等成分[6-10]，具有抗氧化、增強免疫、明目、預防治療心血管疾病、延緩衰老等功效[11-12]。由于霍山石斛鮮品難以保存，傳統(tǒng)用藥方式以其加熱炮制成干燥品的莖入藥，開展霍山石斛游離氨基酸研究對于揭示霍山石斛炮制機制、霍山石斛資源綜合利用具有重要意義。

毛細管電泳(capillary electrophoresis，CE)具有儀器簡單、樣品用量少、應(yīng)用范圍廣、分離效率高、污染小、成本低等優(yōu)點，已在中藥的指標成分含量分析研究中應(yīng)用廣泛[13-17]。在本課題組的前期研究中，采用柱前衍生化HPLC對霍山石斛總游離氨基酸進行分析[18]，本文構(gòu)建一種異硫氰酸苯脂柱前衍生化-HPCE分離和測定多種游離氨基酸方法，對霍山石斛中游離氨基酸進行定性定量分析，為深入研究霍山石斛在炮制過程中所發(fā)生的化學變化、揭示其炮制機制及其資源開發(fā)利用提供候選方法。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料2018年4月采自皖西學院植物園，品種經(jīng)皖西學院陳乃東教授鑒定為霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)，洗凈，取其根，莖，葉，-50 ℃冷凍干燥至恒重，粉碎以備用。

十水合四硼酸鈉，磷酸氫二鉀，氫氧化鈉(純度≥99.7%，均購自西隴化工股份有限公司)，鹽酸(含量36%～38%，中國宿州化學試劑有限公司)，正己烷(純度≥95%，美國Tedia有限公司)，三乙胺(純度≥98%，阿拉丁公司)，乙腈(純度≥99.9%，阿拉丁公司)，甲醇(純度≥99.9%，阿拉丁公司)，異硫氰酸苯酯(PITC)(純度≥99.9%，Sigma-Aldrich公司)。氨基酸標準品:D-脯氨酸(Pro)、L-組氨酸(His)、DL-異亮氨酸(Ile)、L-精氨酸(Arg)、DL-苯丙氨酸(Phe)、DL-色氨酸 (Trp)、D-絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、L-蘇氨酸(Thr)、β-丙氨酸(Ala)、D-亮氨酸(Leu)、L-賴氨酸(Lys)均購自Sigma-Aldrich公司，純度≥98%。

K1060型高效毛細管電泳儀(凱奧科技發(fā)展有限公司，北京)，熔融石英毛細管(永年瑞灃光導纖維廠，50 μm，河北)，SZ-97雙重蒸餾水器(上海精密儀器儀表有限公司，上海)，F(xiàn)A1204B電子天平(越平科學儀器有限公司，上海)，KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(超聲儀器有限公司，浙江昆山)，VORTEX-5 渦旋振蕩器( 海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，BenchTop Pro臺式凍干機(美國VirTis)，RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA公司)。

1.2 方法

1.2.1 標準品的衍生化

精密稱取12種氨基酸對照品Trp 2.78 mg，Arg 4.90 mg，Ala 2.21 mg，Ile 2.53 mg，Lys 1.61 mg，Leu 2.61 mg，Phe 3.23 mg，His 3.64 mg，Ser 2.53 mg，Gly 1.79 mg，Pro 3.00 mg，Thr 4.21 mg，置于容量瓶(25.0 mL)中，加0.1 mol/L鹽酸定容至容量瓶刻度。精密量取1.0 mL樣液于具塞試管(10.0 mL)中，加入14%三乙胺(溶于乙腈)，1.2%異硫氰酸苯酯(溶于乙腈)各0.5 mL混勻，室溫避光放置30 min，加入2.0 mL正己烷，用渦旋儀振蕩助溶，靜置10 min，5000 r/min離心10 min，取下層溶液，制得衍生化溶液，并逐級稀釋，配制成不同濃度的衍生化溶液。

1.2.2 分離方法的優(yōu)化

在預實驗的基礎(chǔ)上，采用檢測波長為254 nm、硼砂-磷酸氫二鉀緩沖液，從緩沖液離子濃度、緩沖液pH值、分離電壓和毛細管有效長度4個方面對HPCE法分離游離氨基酸的條件進行優(yōu)化，確定最佳分離條件。

1.2.3 游離氨基酸定量分析

1)氨基酸標準曲線方程的測定

按1.2.2構(gòu)建的分離方法，檢測1.2.1配制的不同濃度的標準品，以峰面積為因變量、濃度為應(yīng)變量，獲得各氨基酸標準曲線。

2)供試品中游離氨基酸含量測定

將霍山石斛根、莖、葉樣品，以60%甲醇為提取劑、60 ℃超聲輔助提取，固液比=1∶40(g/mL)、超聲提取30 min、超聲功率240 W、提取4次,合并濾液，按1.2.1所述方法衍生化、采用1.2.2構(gòu)建的柱前衍生化-HPCE方法與1.2.3中1)構(gòu)建的標準曲線測定霍山石斛根、莖、葉中游離氨基酸種類及其含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 總游離氨基酸毛細管電色譜分離條件的確定

2.1.1 緩沖液離子濃度

緩沖液的離子濃度很大程度上影響了最終分離的效果，實驗考察了緩沖液濃度對氨基酸分離的影響(表1)。

表1 緩沖液離子濃度

各組分的分離度和保留時間隨著緩沖液離子濃度的增加而增加，當緩沖液中硼砂的離子濃度為60 mmol/L，磷酸氫二鉀的濃度為20 mmol/L時，分離時間相對較短、各氨基酸的峰形和分離度也相對較好(圖1)。

A～E分別對應(yīng)表1中第1組到第5組實驗的毛細管電泳結(jié)果

圖1緩沖液離子濃度對氨基酸分離的影響

Figure 1 The results of the mixed amino acids separated by different ion concentrations of the buffer

2.1.2 緩沖液pH值

考察了pH 8、9、10、11和12的硼砂(60 mmol/L)-磷酸氫二鉀(20 mmol/L) 緩沖溶液對氨基酸分離的影響，發(fā)現(xiàn)隨著緩沖液中pH值的增大，各標準氨基酸的保留時間和分離度也隨之增大，當pH 為11 時分離時間相對較短，12種氨基酸7個可基線分離，另5個接近基線分離(圖2)。

2.1.3 分離電壓

采用pH 11硼砂(60 mmol/L)-磷酸氫二鉀(20 mmol/L)緩沖溶液，考察了分離電壓為3、5、10、15和20 kV時的分離情況。結(jié)果表明，當分離電壓為10 kV 時12種混合氨基酸可實現(xiàn)較好的分離(圖3)。

A～E分別為pH 8、9、10、11和12的緩沖液電泳結(jié)果

圖2緩沖液pH值對氨基酸分離的影響

Figure 2 The results of the mixed amino acids separated by different pH values of buffer

A～E分別表示分離電壓為3、5、10、15和20 kV時的分離圖譜

圖3分離電壓對氨基酸分離的影響

Figure 3 The results of the mixed amino acids separated by different separation voltages

2.1.4 毛細管有效長度

考察了有效長度分別為35、45、55、65和75 cm時的分離效果。結(jié)果表明，隨著毛細管有效長度的增加，混合氨基酸各組分的保留時間相應(yīng)增加。當毛細管有效長度為55 cm的時候，在保證較好的分離度情況下，分離時間較短(圖4)。

2.1.5 分離條件的確定

綜合上述優(yōu)化實驗結(jié)果，異硫氰酸苯脂衍生化的12種混合氨基酸最佳分離條件為：pH 11的硼砂(60 mmol/L)-磷酸氫二鉀(20 mmol/L)緩沖溶液，分離電壓10 kV、毛細管有效長度55 cm，在此條件下12種游離氨基酸的全部實現(xiàn)基線分離(圖5，表2)。

A～E分別表示毛細管有效長度為35、45、55、65和75 cm時的圖譜

圖4毛細管有效長度對氨基酸分離的影響

Figure 4 The results of the mixed amino acids separated by different effective length of capillary

表2 12種游離氨基酸分離度

2.2 標準曲線的測定及方法學考察

2.2.1 標準曲線及其方法學考察結(jié)果

精密量取1.2.1配制的12種氨基酸對照品溶液，用蒸餾水依次稀釋成不同的濃度，在優(yōu)化的電泳條件下依次進行測定，以峰面積(Y)對各標準品的質(zhì)量濃度X(mg/mL)繪制標準曲線，分析各標準氨基酸的檢測限(LOD)、定量限(LOQ)以及線性范圍(表3)。

2.2.2 精密度

取一定量1.2.1所述方法配制的12種氨基酸對照品溶液，在優(yōu)化的電泳條件下，日內(nèi)、日間分別連續(xù)進樣 3 次，記錄各物質(zhì)對應(yīng)的遷移時間和峰面積，以此求得對應(yīng)的精密度，得到日內(nèi)精密度RSD≤3.1%，日間精密度RSD≤4.6%，說明構(gòu)建的方法精密度良好。

2.2.3 實際樣品分析

1)定性分析

按1.2.3中2)所述方法制備的石斛樣品，在優(yōu)化的最佳電泳條件下測定，測得霍山石斛根、莖、葉總游離氨基酸提取物HPCE圖譜(圖6)。

1:精氨酸(Arg); 2:賴氨酸(Lys); 3:色氨酸 (Trp); 4:苯丙氨酸(Phe); 5:異亮氨酸(Ile); 6:亮氨酸(Leu); 7:組氨酸(His); 8:脯氨酸(Pro); 9:蘇氨酸(Thr); 10:絲氨酸(Ser); 11:丙氨酸(Ala); 12:甘氨酸(Gly)

圖5最優(yōu)分離條件下HPCE圖譜

Figure 5 The HPCE map of the 12 amino acids analyzed in the optimal separating conditions

通過與氨基酸標準品對比保留時間及內(nèi)標，共從霍山石斛根莖葉總游離氨基酸中鑒定出12種游離氨基酸(表5)。

A～C分別表示霍山石斛莖、葉、根總游離氨基酸HPCE圖譜

圖6霍山石斛莖、葉、根總游離氨基高效毛細管電泳色譜圖

Figure 6 The HPCE chromatography of the total free amino acids from the stem, leaf and root ofD.huoshanense

表3 12種氨基酸的回歸方程及其相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限與定量限

2)定量分析

按1.2.3中2)制備的石斛樣品，在優(yōu)化的最佳電泳條件下測定，根據(jù)標準曲線，計算出各氨基酸在霍山石斛樣品中的含量(表4)。所測霍山石斛樣品中，葉中的總游離氨基酸含量最高，根中最低。霍山石斛根中精氨酸含量最高，莖中甘氨酸含量最高，葉中異亮氨酸含量最高。

表4 霍山石斛根、莖、葉游離氨基酸含量測定結(jié)果

2.3 加樣回收實驗

取氨基酸標準品，按表4所示含量，精密稱定，加入0.5 g的霍山石斛樣品中，根據(jù)1.2.3中2)方法所述，制備加樣回收所需供試品溶液，并按照最佳毛細管電泳方法進行測定，計算回收率。結(jié)果表明(表5)，各氨基酸加樣回收率在90.17%～110.25%之間，RSD≤5%(n=3)。

表5 加樣回收率(n=3)

3 結(jié)論

研究了異硫氰酸苯脂衍生化-毛細管電泳法同時測定霍山石斛中12 種游離氨基酸的方法。通過優(yōu)化實驗條件，確定霍山石斛游離氨基酸異硫氰酸苯脂衍生化-毛細管電泳分離條件為：檢測波長254 nm，毛細管有效長度55 cm，pH 11的硼砂 (60 mmol/L) -磷酸氫二鉀 (20 mmol/L) 緩沖溶液，分離電壓10 kV。在該條件下，12種游離氨基酸可在60 min內(nèi)實現(xiàn)基線分離，各氨基酸線性相關(guān)系數(shù)R2的數(shù)值均大于0.99，日內(nèi)精密度RSD≤3.1%，日間精密度RSD≤4.6%，加樣回收率在91.2% ～110.25%，RSD均小于5%(n=3)。該方法操作簡便，檢測成本低，重現(xiàn)性較好，可用于霍山石斛中游離氨基酸的分析檢測。