降糖增效方對(duì)糖尿病大鼠肝臟胰島素信號(hào)通路IRS1位點(diǎn)磷酸化的影響

許光遠(yuǎn) 張曉明

〔摘要〕 目的 通過(guò)觀察降糖增效方對(duì)糖尿病大鼠肝臟胰島素受體底物1（insulin receptor substrates 1，IRS1）磷酸化的影響來(lái)探討該方發(fā)揮降糖增效作用的機(jī)制。方法 將40只6～8周齡雄性ZDF（fa/fa）大鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組（0.134 g/kg）、降糖增效方組（0.64 g/kg）、聯(lián)合組（降糖增效方0.64 g/kg+二甲雙胍0.134 g/kg），另選ZDF（fa/+）大鼠10只為正常組，連續(xù)干預(yù)6周;實(shí)驗(yàn)結(jié)束檢測(cè)體空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、血清胰島素水平（fasting insulin，F(xiàn)INS）、胰島素抵抗指數(shù)（homeostatic model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）;蛋白免疫印跡法（Western bloting）檢測(cè)IRS1絲氨酸磷酸化位點(diǎn)ser307、ser612、ser1101表達(dá)。結(jié)果 與模型組相比較，各治療組大鼠FBG、FIns、HOMA-IR、OGTT 2 h血糖水平、AUC、SCr、BUN顯著降低（P<0.05，P<0.01）;肝組織p-IRS1 Ser307、p-IRS1 ser612、p-IRS1 ser1101蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01）;與二甲雙胍、降糖增效方組比較，聯(lián)合組大鼠FBG、FIns、HOMA-IR顯著降低（P<0.05，P<0.01）;OGTT2 h血糖水平以及AUC顯著降低（P<0.05，P<0.01）;肝組織p-IRS1 Ser307、p-IRS1 ser612、p-IRS1 Ser1101蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 降糖增效方降低糖尿病大鼠肝臟IRS1 ser307/612/1101位點(diǎn)磷酸化水平，這可能是其增加降糖療效的機(jī)制。

〔Abstract〕 Objective To observe effects of Jiangtang Zengxiao Fang （JZF） on phosphorylation of insulin receptor substrates 1 （IRS1） in diabetic rats， and to investigate the mechanism of synergism of reducing blood glucose. Methods A total of 40 6-8 week male ZDF （fa/fa） rats were randomly divided into a model group， a metformin group （0.134 g/kg）， a JZF group （0.64 g/kg）， and a combination group （JZF 064 g/kg + metformin 0.134 g/kg）. Another 10 ZDF （fa/+） rats were set as a normal group. The rats were continuously intervened for 6 weeks. Fasting blood glucose （FBG）， fasting insulin （Fins）， homeostasis model assessment-Insulin resistance （HOMA-IR）， aspartate aminotransferase （AST）， serum creatinine （Scr）， blood urea nitrogen （BUN） and oral glucose tolerance test （OGTT） were detected after experiment. Western blot was used to detect the expression of ser307， ser612， ser1101 in phosphorylation of IRS1 in liver. Results Compared with the model group， FBG， Fins， HOMA-IR， Blood glucose level of 2 h in OGTT， AUC， AST， Scr and BUN in each group were decreased significantly （P<0.05， P<0.01）. p-IRS1 ser307， p-IRS1 ser612， p-IRS1 ser1101 protein expression level in the liver tissue were decreased significantly （P<0.05， P<0.01）. Compared with JZF group and metformin group， FBG， Fins and HOMA-IR of the combination group were decreased significantly （P<0.05， P<0.01）. Blood glucose level and AUC were significantly decreased at 2 h in OGTT （P<0.05， P<0.01）. p-IRS1 ser307， p-IRS1 ser612， p-IRS1 ser1101 protein expression level in the liver tissue were significantly decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion JZF can regulate p-IRS1 ser307， p-IRS1 ser612， p-IRS1 ser1101 expression in liver tissue of diabetic rats， which might be the mechanism of improving the efficacy of reducing blood glucose.

〔Keywords〕 Jiangtang Zengxiao Fang; diabetic model rats; metformin; insulin receptor substance; phosphorylation; insulin signaling pathway

根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（international diabetes federation，IDF）2017年統(tǒng)計(jì)，目前全球有糖尿病患者4.25億，其中90%為2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM），預(yù)計(jì)到2045年，糖尿病患者可能達(dá)到6.29億[1]。我國(guó)近30年來(lái)糖尿病患病率顯著增加，2013年我國(guó)糖尿病及糖尿病前期最新流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，20歲以上成年人糖尿病患病率為10.9%，糖尿病人數(shù)已超1億，而且，還有35.7%的糖尿病前期高危人群[2]，糖尿病已成為非常嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題。

降糖增效方是在臨床經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代藥理研究組方而成的中藥降糖復(fù)方，由黃芪、苦瓜、桑葉、玉竹、石斛、三七、神曲、肉桂組成，前期已獲保健食品批準(zhǔn)文號(hào)（國(guó)食健字G20130302）以及國(guó)家專(zhuān)利（專(zhuān)利號(hào)：ZL2007101060118）。前期實(shí)驗(yàn)表明本品對(duì)糖尿病大鼠具有降低血糖、改善胰島素抵抗、保護(hù)β細(xì)胞、降低血脂作用[3];其主要成分如苦瓜總皂苷、桑葉總黃酮、桂皮醛、三七總皂苷等也有明確降糖、改善胰島素抵抗作用[4-5]。為了進(jìn)一步探索降糖增效方治療2 型糖尿病的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)選用降糖增效方干預(yù)自發(fā)性糖尿病肥胖（zucker diabetes fatty， ZDF）大鼠，觀察其降糖、改善胰島素抵抗的作用，探討其降糖增效作用的機(jī)制。

1 材料

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性自發(fā)性2型糖尿病模型ZDF（fa/fa）大鼠40只，6～7周齡，體質(zhì)量（200±20） g，同周齡正常雄性ZDF（fa/+）大鼠10只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：SCXK（京）2012-0001。大鼠飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK 京2010-0032），溫度（23±2） ℃、濕度（55±10）%，12/12 h光照黑暗循環(huán)，自由攝食飲水。ZDF（fa/fa）大鼠飼料（蛋白質(zhì)26.85%，脂肪16.71%，碳水化合物56.44%）喂養(yǎng)，ZDF（fa/+）大鼠普通飼料喂養(yǎng)。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查（編號(hào)2016-006）。

1.2? 藥物與試劑

降糖增效方（10 g/袋，北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院顆粒藥房，批號(hào)160708）;鹽酸二甲雙胍片（0.5 g/片，中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)20150109）;血肌酐（serum creatinine，SCr）試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào)20180602）;血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào)20180304）;天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào)20180306）;胰島素（fasting insulin，F(xiàn)Ins）試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所，批號(hào)20162400316）;RIPA裂解緩沖液（批號(hào)20180404）、BCA蛋白定量試劑盒（均來(lái)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號(hào)20180114）;磷酸化胰島素受體底物蛋白1絲氨酸1101/612/307（phospho-insulin receptor substrate 1 Ser1101/Ser612/Ser307，p-IRS1 ser1101/ser612/ser307）、β-actin 抗體（CST公司，批號(hào)0005，0003，0005，0021）;羊抗兔二抗（CST公司，批號(hào)0026）;Block one/Block one-P（日本京都Nacalai Tesque 公司，批號(hào)分別L4E0085，L5G4440）;ECL發(fā)光液（美國(guó)BIO-RAD公司，批號(hào)20170708）。

1.3? 儀器

7160型全自動(dòng)生化儀（日本日立公司）;r-911型全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀（中國(guó)科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司）;E9032型酶標(biāo)儀（美國(guó)Promega公司）;7500型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI 公司）;Mini-PROTEAN型垂直電泳儀、轉(zhuǎn)移槽、ChemiDocTM XRS+型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司）。

2 方法

2.1? 分組與干預(yù)

檢測(cè)適應(yīng)性喂養(yǎng)后ZDF（fa/fa）大鼠尾靜脈血糖，不同次隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L為成模標(biāo)準(zhǔn)[6]，按血糖隨機(jī)分層分為：模型組、二甲雙胍組（0.134 g/kg）、降糖增效方組（0.64 g/kg）、聯(lián)合組（二甲雙胍0.134 g/kg+降糖增效方0.64 g/kg），10只/組;10只雄性ZDF（fa/+）大鼠為正常組;按體表面積法折算大鼠給藥劑量[7]，正常組、模型組給等容量生理鹽水，1次/日，連續(xù)6周。

2.2? 標(biāo)本采集

干預(yù)6周后，各組小鼠未出現(xiàn)死亡，禁食過(guò)夜后，麻醉后腹主動(dòng)脈取血，離心抽取血清凍存;剖取肝臟，-80 ℃凍存待用。

2.3? 生化指標(biāo)檢測(cè)

取大鼠血清，全自動(dòng)生化儀檢測(cè)空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、BUN、SCr、AST;全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀檢測(cè)FIns，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（homeostaticmodel assessment of insulin resistance，HOMA-IR）。

2.4? 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）實(shí)驗(yàn)第6周，大鼠禁食12 h，葡萄糖2 g/kg灌胃，尾靜脈取血，分別檢測(cè)0、30、60、120 min血糖（blood glucose，BG）并計(jì)算曲線下面積（AUC）。

2.5? Western Blot檢測(cè)P-IRS1 ser 307、612、1101蛋白表達(dá) 每組取6只大鼠肝組織，RIPA裂解提取總蛋白，高溫蛋白變性，檢測(cè)蛋白濃度;12% SDS-PAGE 凝膠電泳100 V 1.5 h，半干法轉(zhuǎn)膜后TBS溶液洗10 min;Blocking one/Blocking one-P封閉30 min，一抗（1∶1 000稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜;洗膜，二抗（1∶10 000）室溫1 h。洗膜后ECL發(fā)光液避光孵育2 min，凝膠成像系統(tǒng)顯影，Image J 7.0軟件進(jìn)行圖像分析，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白灰度值計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

2.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用“x±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）方法;兩組間比較，滿足方差齊性時(shí)用 LSD 檢驗(yàn)，不滿足方差齊性時(shí)用非參數(shù)檢驗(yàn);P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 各組大鼠FBG比較

與正常組比較，模型組大鼠FBG水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各治療組大鼠FBG顯著降低（P<0.05，P<0.01）。聯(lián)合組大鼠FBG較二甲雙胍組、降糖增效方組顯著降低（P<0.05，P<0.01）。見(jiàn)表1。

3.2? 各組大鼠FIns、HOMA-IR比較

實(shí)驗(yàn)6周后，與正常組比較，模型組大鼠FIns、HOMA-IR水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各治療組大鼠FIns、HOMA-IR顯著降低（P<0.05，P<0.01）。聯(lián)合組大鼠FIns、HOMA-IR較二甲雙胍組、降糖增效方組顯著降低（P<0.01），說(shuō)明聯(lián)合用藥在改善大鼠胰島素抵抗方面效果優(yōu)于單獨(dú)用藥。見(jiàn)表2。

3.3? 各組大鼠OGTT比較

實(shí)驗(yàn)6周后，與正常組比較，模型組大鼠0、30、60、120 min血糖及AUC顯著升高（P<0.01），且血糖最高峰值延后;與模型組比較，各治療組大鼠0、60、120 min血糖及AUC顯著降低（P<0.05，P<0.01）;二甲雙胍組大鼠0、120 min血糖及AUC結(jié)果顯著高于聯(lián)合組（P<0.05，P<0.01），降糖增效方組0、30、60、120 min血糖及AUC結(jié)果顯著高于聯(lián)合組（P<0.05，P<0.01）。見(jiàn)表3。

3.4? 各組大鼠肝腎功能比較

實(shí)驗(yàn)6周后，與正常組比較，模型組大鼠血清AST無(wú)差異（P>0.05），SCr、BUN顯著增高（P<0.01）;與模型組比較，二甲雙胍組、降糖增效方組、聯(lián)合組大鼠血清AST無(wú)差異（P>0.05），SCr、BUN降低（P<0.05，P<0.01）。見(jiàn)表4。

3.5? 各組大鼠肝臟p-IRS1 Ser 307、p-IRS1 Ser 612、p-IRS1 Ser 1101蛋白表達(dá)比較

與正常組比較，模型組大鼠p-IRS1 Ser 307/612/1101表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各治療組大鼠p-IRS1 Ser 307/612/1101顯著降低（P<0.05，P<0.01）;聯(lián)合組大鼠p-IRS1 Ser 307/612/1101表達(dá)水平較二甲雙胍組、降糖增效方組顯著降低（P<0.01）。見(jiàn)表5。

4 討論

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是糖尿病發(fā)病的主要機(jī)制之一，常伴隨著機(jī)體高血糖、高胰島素血癥、高脂血癥等發(fā)生，同時(shí)也是糖尿病血管、神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥發(fā)生的原因之一[8]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，改善糖尿病大鼠胰島素抵抗，能夠降低大鼠血糖、血脂水平，甚至炎癥、氧化應(yīng)激等狀態(tài)[9-10]。中醫(yī)藥在治療糖尿病方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，能夠聯(lián)合西藥，發(fā)揮協(xié)同作用來(lái)增強(qiáng)療效，減緩不良反應(yīng)。中藥降糖增效方是由苦瓜、桑葉、玉竹、三七、肉桂等藥物組成，本方以苦瓜為君藥清虛熱，桑葉、玉竹為臣藥，助苦瓜清虛熱，同時(shí)補(bǔ)陰津;三七行血，佐助行散藥力，少量肉桂反佐以防清熱太過(guò)、寒涼傷及脾胃。方中藥物配伍得當(dāng)，益氣與滋陰清熱并重、補(bǔ)瀉同用、寒熱并治，做到滋補(bǔ)而不壅滯、清熱而寒涼，清熱滋陰益氣。前期研究發(fā)現(xiàn)，本方能夠作用于糖尿病大鼠骨骼肌胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路的胰島素受體、蛋白激酶B、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4等靶點(diǎn)，具有降糖、降脂、改善胰島素抵抗的作用[3]。此外，二甲雙胍作為2型糖尿病的一線用藥[11]，單獨(dú)應(yīng)用往往不能有效控制血糖水平，且易出現(xiàn)胃腸道不良反應(yīng)及高乳酸血癥等[12]。在本研究發(fā)現(xiàn)，降糖增效方能夠改善ZDF大鼠FBG、FIns、HOMA-IR，發(fā)揮降糖、改善IR的作用，與二甲雙胍聯(lián)合應(yīng)用降糖效果更佳。

胰島素受體底物1（insulin receptor substance 1，IRS1）是胰島素信號(hào)通路連接細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)蛋白，其活化水平影響胰島素生理效應(yīng)的產(chǎn)生[13]。研究發(fā)現(xiàn)，IRS1不同位點(diǎn)的磷酸化受蛋白激酶影響從而正性或負(fù)性調(diào)控胰島素信號(hào)傳導(dǎo)[14]，如絲氨酸位點(diǎn) Ser 307、Ser 612、Ser 1101活化抑制信號(hào)傳導(dǎo)，酪氨酸位點(diǎn)Tyr 989活化促進(jìn)信號(hào)傳導(dǎo)。正常情況下胰島素與受體結(jié)合前，IRS1以絲氨酸磷酸化為主，關(guān)閉向下游傳導(dǎo)信號(hào)通路;當(dāng)胰島素結(jié)合細(xì)胞表面受體后，IRS1大多數(shù)酪氨酸位點(diǎn)磷酸化，競(jìng)爭(zhēng)性抑制絲氨酸位點(diǎn)磷酸化發(fā)生，同時(shí)啟動(dòng)下游信號(hào)通路發(fā)揮生理效應(yīng)[15];IR發(fā)生的時(shí)候，由于長(zhǎng)期高胰島素血癥、炎癥、氧化、高糖等狀態(tài)存在，導(dǎo)致胰島素與受體結(jié)合后，IRS1酪氨酸位點(diǎn)磷酸化減弱，絲氨酸磷酸化作用增強(qiáng)，抑制了胰島素信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)一步加重IR、高糖狀態(tài)[16-17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，降糖增效方能夠顯著降低大鼠肝臟IRS1 Ser 307、Ser 612、Ser 1101位點(diǎn)的磷酸化，其與二甲雙胍聯(lián)合應(yīng)用效果顯著優(yōu)于單獨(dú)藥物治療組。

綜上所述，降糖增效方能夠降糖、改善IR，其聯(lián)合二甲雙胍效果更優(yōu)，二者聯(lián)合應(yīng)用增加降糖療效，優(yōu)于兩藥單獨(dú)應(yīng)用;聯(lián)合用藥能夠更顯著抑制IRS1絲氨酸磷酸化，因此，可以推斷出聯(lián)合用藥發(fā)揮降糖增效作用的原因可能是抑制IRS1絲氨酸磷酸化，從而加快胰島素信號(hào)傳導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。但中西藥聯(lián)合應(yīng)用改善IR的相關(guān)報(bào)道較少，仍需進(jìn)一步探討降糖增效方及中西藥聯(lián)合應(yīng)用的作用機(jī)制。

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