病毒誘導基因沉默技術引入普通生物學實驗教學實踐

朱 峰, 紀兆林, 錢 坤

(揚州大學 園藝與植物保護學院， 揚州 225009)

普通生物學課程是生命科學領域的一門重要的專業(yè)基礎課程，是多數(shù)高等院校生物類專業(yè)的入門課程和必修課程。普通生物學也是一門以拓寬學生知識層面，培養(yǎng)學生綜合素質能力為目標的、綜合性非常強的基礎課程，涉及多方面的領域，包括植物學、動物學、微生物學、生態(tài)學、細胞學、遺傳學、分子生物學和進化生物學等，具有實踐性強和操作性強的特點[1]。它是后續(xù)專業(yè)課程的基礎，因此該課程的教學質量的好壞將直接影響到學生對后續(xù)專業(yè)課程的學習。相對應的生物學實驗是教學過程的重要組成部分，同時也是生物學學科生存和發(fā)展的基礎。如何通過實驗教學培養(yǎng)出理論與實踐能力相結合的高素質人才，成為眾多高校教育管理者和一線教師所關注和研究的問題[2]。當前普通生物學教學過程中，仍然有很多問題需要進一步解決，尤其是實驗教學存在的問題還需要去探討[3]。為此，筆者對此進行了積極的實踐和探索。

1 傳統(tǒng)教學中存在的問題

在實驗教學過程中獲得知識以及從實驗教學中培養(yǎng)學生的實踐能力無疑是非常重要的。由于很多高校存在經費預算緊張、實驗條件落后等客觀問題，并且普通生物學實驗課程遵循動物、植物的系統(tǒng)發(fā)展而設定，多數(shù)實驗是以驗證性的、單個獨立的小實驗、演示實驗為主開展的，缺乏系統(tǒng)性和連續(xù)性。雖然花費了大量時間與精力，但是學生缺乏興趣、主動性差,并且參與程度不夠，教學效果差。對學生的實驗操作技能、獨立工作能力和創(chuàng)新思維能力等的培養(yǎng)都不甚理想。

因此，為了能在實驗教學中提高學生的學習興趣和實驗操作技能、培養(yǎng)學生的獨立工作能力和創(chuàng)新思維能力，切實增強教學質量，筆者首次嘗試將當前生物學研究前沿技術——病毒誘導的基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)技術引入到普通生物學實驗教學過程中，讓學生成為實驗的主導者，親自參與到實驗過程的具體步驟中，激發(fā)學習興趣，提高實驗操作技能，培養(yǎng)學生獨立工作能力和創(chuàng)新思維能力。

2 VIGS的實驗教學方案

2.1 實驗原理

VIGS是在植物中發(fā)現(xiàn)的一種轉錄后基因沉默現(xiàn)象。當攜帶植物目標基因cDNA的病毒感染植物后，在RNA聚合酶的作用下，合成大量的雙鏈 RNA，然后宿主體內具有核酸內切酶活性的Dicer酶將dsRNA切割為21 ～ 24 nt 的小分子干擾RNA。siRNA與一系列AGO家族蛋白結合形成沉默復合體，該復合體可以特異地與細胞質中的同源 RNA相互作用，切割降解目標mRNA，阻斷翻譯過程，從而抑制目標基因的表達[4-7]。當基因表達被抑制后，植物的表型或生理指標發(fā)生相應的變化，可對該基因的功能進行研究[8-11]。與其他植物基因功能研究方法如基因敲除、轉基因技術等相比，VIGS技術具有周期短、低成本、構建簡易、不需要遺傳轉化、當代可觀察表型、克服基因家族功能冗余以及快速比較不同物種之間的基因功能的優(yōu)勢[11-12]。因此，VIGS技術是植物基因功能研究領域中最快速簡便的手段之一[6]。

當前越來越多的植物病毒被研究和開發(fā)成病毒誘導的基因沉默載體，應用到不同的植物功能研究中。而目前煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)作為VIGS載體，已在多種不同植物物種如茄科植物煙草、番茄、馬鈴薯、辣椒、矮牽牛，十字花科擬南芥、錦葵科棉花等中成功應用，并表現(xiàn)出獨特的優(yōu)越性[13]。它具有多重優(yōu)點：感染癥狀輕、構建載體簡單、方便外源序列的插入、快速侵染整個植物體包括分生組織和花、沉默效率高、持續(xù)時間長。八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase,PDS)是植物體類胡蘿卜素合成過程中的一種的關鍵酶，當PDS基因的表達被抑制時，植物失去了類胡蘿卜素的光保護作用，植物葉片就會出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，葉片表現(xiàn)白化。和對照比較，具有明顯的表型差異。因此很多研究者在開發(fā)VIGS載體時常常選擇沉默PDS基因作為參照，監(jiān)控病毒載體的侵染效率[14-15]。

2.2 實驗目的

本實驗以本生煙PDS基因為研究對象，實驗設計包括本生煙RNA提取、反轉錄cDNA、基因克隆、載體構建、農桿菌轉化、侵染植物等內容。PDS基因沉默后的表型直觀并且快速，非常適合學生理解和掌握VIGS這一前沿技術方法。該實驗具有綜合性、設計性、探究性的特點，讓學生成為實驗的主導者，親自參與到實驗過程的具體步驟中，激發(fā)學習興趣，提高實驗操作技能，培養(yǎng)學生獨立工作能力和創(chuàng)新思維能力。

2.3 實驗材料

1)生物材料與試劑。本生煙幼苗、大腸桿菌DH5α、農桿菌GV2260、TRIzolTMReagent (Invitrogen)、SuperScript III Reverse Transcriptase反轉錄試劑盒(Invitrogen)、pCR?8/GW?/TOPO?定向TOPO?中間載體試劑盒(Invitrogen)、Gateway?LR ClonaseTMII Enzyme Mix試劑盒(Invitrogen)、質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、pTRV1質粒、pTRV2質粒、瓊脂糖、卡那霉素、氨芐青霉素、利福平、鏈霉素、農桿菌侵染緩沖液(10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES、200 μmol/L 乙酰丁香酮)、LB培養(yǎng)基等。

2)實驗儀器。PCR儀、電泳儀及水平電泳槽、凝膠成像儀、離心機、搖床、移液器、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、電子天平等。

2.4 方法與步驟

1)提取本生煙植株的總RNA和cDNA的獲得。按照TRIzolTMReagent試劑盒操作說明書的步驟提取本生煙植株的總RNA。cDNA的獲得可以依據(jù)SuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)試劑盒操作說明書的方法進行反轉錄反應。

2)重組pTRV2-NbPDS載體構建及農桿菌轉化。從NCBI數(shù)據(jù)庫中查找到NbPDS基因序列，登錄號為EU165355。根據(jù)NbPDS基因的全長cDNA序列，用Primer 5軟件設計特異性引物：F：5′-ATCGAGCTGAATGAGGATGG-3′，R：5′-CCGAAATTTCATCAGGGAAA-3′。通過PCR擴增得到424 bp大小的NbPDS基因片段。按照pCR?8/GW?/TOPO?定向TOPO?中間載體試劑盒(Invitrogen)操作說明書將NbPDS基因部分序列克隆到pCR?8/GW?/TOPO?載體上，將該連接產物轉化到DH5α感受態(tài)細胞中，然后利用質粒提取試劑盒提取質粒。通過PCR及測序驗證。從保存的TRV2 DH5α菌液中提取pTRV2質粒。將上述的NbPDS片段基因按照Gateway?LR Clonase? ⅡEnzyme Mix操作說明書克隆到pTRV2載體上。轉入DH5α感受態(tài)細胞中，提取質粒。通過PCR及測序驗證。重組質粒命名為pTRV2-NbPDS，再通過凍融法將pTRV2-NbPDS重組質粒轉入農桿菌GV2260感受態(tài)細胞。

3)農桿菌侵染。分別將pTRV1、pTRV2-NbPDS的農桿菌單菌落接種到5 mL LB 液體培養(yǎng)基(含50 mg/L Kan，50 mg/L Amp，50 mg/L Strep，25 mg/L Rif)，28 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。離心10 min(3000 r/min)，收集農桿菌菌體，倒上清后，利用侵染緩沖液將農桿菌菌體懸浮，通過分光光度計調節(jié)OD600值至1.0左右，室溫靜置 3 h后，將 pTRV1 的農桿菌懸浮液和pTRV2-NbPDS農桿菌懸浮液按照 1∶1 的比例均勻混合后，準備注射本生煙幼苗。用無針頭的1 mL 無菌注射器通過壓迫注射法將已混合的農桿菌懸浮液注入本生煙幼苗的下位葉片中，每株注射2片葉。對照組：注射pTRV2空載體的農桿菌。注射后的本生煙幼苗在溫室里繼續(xù)培養(yǎng)，大約1周后，NbPDS基因沉默的表型開始慢慢出現(xiàn)，注意觀察和拍照。

2.5 實驗結果

在注射pTRV2-NbPDS的植株后，大約8 d后，本生煙植株的上位葉片出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象。白化首先出現(xiàn)在靠近葉柄處，然后從葉脈向邊緣周圍擴展，2周后部分葉片和植株莖段幾乎完全白化，而對照植株中葉片沒有變化。pTRV2-NbPDS的農桿菌注射本生煙15 d后的表型如圖1-B所示，葉片完全白化，但是TRV空載體注射的本生煙沒有出現(xiàn)明顯差異(圖1-A)。因此實驗結果說明NbPDS基因的表達被抑制，已被成功沉默，VIGS實驗體系已成功被建立。

TRV:00為帶有空載體pTRV2的農桿菌注射本生煙15 d后的表型;TRV:NbPDS為帶有pTRV2-NbPDS的農桿菌注射本生煙15 d后的表型

圖1VIGS沉默NbPDS基因的表型

Figure 1 The phenotype ofNbPDS-silenced by VIGS inN.benthamiana

2.6 注意事項

1)提取煙草總RNA時，研磨要迅速，保持低溫環(huán)境，避免RNA降解。2)選擇本生煙幼苗(具有4～6片真葉的植株)來注射農桿菌懸浮液，不能選擇生長周期過長的植株。3)調節(jié)農桿菌懸浮液的OD600值到1.0左右，不宜過高。4)侵染緩沖液要現(xiàn)配現(xiàn)用，有利于農桿菌的滲透性。5)注射不同VIGS載體時，應記得及時更換注射器和一次性手套，防止交叉污染。

2.7 思考題

1)為什么要將OD600值調節(jié)至1.0左右，而不能過高？2)VIGS的原理是什么？3)如何進一步通過實驗證明本實驗中NbPDS基因的表達被沉默？

3 教學效果

與傳統(tǒng)的小實驗相比，引入的VIGS實驗具有明顯的綜合性、設計性和探究性的特點，是一個系統(tǒng)、連續(xù)的過程，類似于一個比較完整的科研過程。在實驗過程中，學生成為實驗的主導者，主動參與到實驗過程的具體步驟中，學生非常認真地完成每個實驗。因為前一實驗結果直接決定了后一實驗能否成功，相輔相成，環(huán)環(huán)相扣。當學生最終發(fā)現(xiàn)自己將NbPDS基因沉默后，葉片出現(xiàn)白化現(xiàn)象，學生非常激動和興奮，覺得非常神奇，學生彼此之間的交流、溝通、討論也非常激烈，成就感和滿足感油然而生，學生的興趣顯著提高。不過也有部分學生最終沒有觀察到葉片白化現(xiàn)象，出現(xiàn)一定的失望情緒，這時需要鼓勵他們耐心去思考實驗的每個環(huán)節(jié)，在哪些地方有問題。結合注意事項和思考題反復推敲，最終找到問題的根源，可以嘗試再做一次。從學生的反饋情況來看，學生們普遍喜歡該實驗，許多學生認為從該實驗中得到了多方面的鍛煉，既開闊了眼界，拓展了思路，更進一步理解和鞏固了所學的理論知識。

4 結語

由于利用VIGS技術將PDS基因沉默后的表型具有直觀性、顯著差異性和快速性等特點，因此非常適合將該實驗技術引入到本科實驗教學中，生物學的基本原理可以在實驗過程輕松的被理解和掌握，實現(xiàn)理論與實踐能力相結合的培養(yǎng)，對拓展學生的創(chuàng)新思維，提高科研能力有很好的幫助。也為他們今后繼續(xù)深造和工作打下堅實基礎。