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    牡荊素對(duì)Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的緩解作用及對(duì)血漿Th17、Th23和MMPs蛋白水平的影響

    2020-06-12 02:14:20亓洪德亓?xí)?/span>高圣龍
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2020年10期
    關(guān)鍵詞:牡荊藥組膠原蛋白

    亓洪德 盧 程 李 庭 亓?xí)?高圣龍

    (山東省濟(jì)南市人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科,濟(jì)南 271100)

    類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA) 是一種以晨僵、關(guān)節(jié)腫痛、活動(dòng)受限為主要臨床癥狀的慢性炎癥性自身免疫性疾病,最終會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能喪失,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1-3]。RA的發(fā)病原因和機(jī)制復(fù)雜,難以根治,新藥物的開發(fā)是治療RA的新希望。牡荊素是從中藥材牡荊葉和牡荊子中提取的天然黃酮類化合物,具有抑菌、抗炎、抗腫瘤、保護(hù)心臟、保護(hù)神經(jīng)等多種生理作用[4-8],但對(duì)Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的大鼠RA作用機(jī)制尚未明確。輔助性T細(xì)胞17(T helper 17 cell,Th17)是能夠分泌IL-17的T細(xì)胞亞群,輔助性T細(xì)胞23(T helper 23 cell,Th23)是能夠分泌IL-23的T細(xì)胞亞群,在RA患者病灶部位高表達(dá),并與RA的嚴(yán)重程度有關(guān)[9]?;|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一類依賴鈣鋅等金屬離子的內(nèi)肽酶家族,在RA中參與細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)[10]。本文研究牡荊素對(duì)Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的大鼠RA的作用及對(duì)血漿Th17、Th23和MMPs蛋白水平的影響。

    1 材料與方法

    1.1材料 SD大鼠購(gòu)自四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,牛Ⅱ型膠原和弗氏完全佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,牡荊素購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司,HE染色試劑盒購(gòu)自舜百生物科技有限公司,BCA試劑盒購(gòu)自上海晶康生物工程有限公司,IL-17和 IL-23 ELISA試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)科技生物有限公司。

    1.2方法

    1.2.1造模 無菌條件下配制1 mg/ml的牛Ⅱ型膠原乳液(0.1 mol/L醋酸溶解的2 mg/ml的牛Ⅱ型膠原與等體積的弗氏完全佐劑混合)。造模方法參考文獻(xiàn)[11]:模型組每只大鼠尾根部分皮內(nèi)注射0.3 ml 牛Ⅱ型膠原乳液,第15天,同等方法同劑量再次注射牛Ⅱ型膠原乳液;對(duì)照組注射等體積生理鹽水。

    1.2.2分組及給藥方式 將SD大鼠隨機(jī)分為健康對(duì)照組(Control組)、模型組(Model組)和給藥組[Vitexin(1.5 mg)組、Vitexin(3 mg)組、Vitexin(6 mg)組]5組,每組10只。造模52 d后,給藥組每天分別腹腔注射牡荊素1.5、3、6 mg/kg,連續(xù)3周;健康對(duì)照組和模型組注射等體積生理鹽水。

    1.2.3HE染色 將大鼠軟骨組織分離,甲醛固定、酒精脫水、石蠟包埋切片,二甲苯脫蠟、酒精至水,蘇木精水溶液和伊紅染色液染色,酒精脫水、二甲苯透明,封片觀察。

    1.2.4Western blot檢測(cè)蛋白含量 提取總蛋白后用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,將待測(cè)蛋白用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜,封閉液中封閉;加入對(duì)應(yīng)的一抗,4℃過夜;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育,暗室中化學(xué)發(fā)光劑顯色成像。

    1.2.5ELISA及檢測(cè)IL-17和IL-23表達(dá) 將樣品加入用純化的抗體包被的微孔板,并加入生物素化抗體和 HRP 標(biāo)記的親和素,底物 TMB 顯色,酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度,計(jì)算樣品濃度。

    1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+IL-17+、CD4+IL-23+數(shù)量 分別取抗凝血100 μl加入不同測(cè)定管,加入CD4+IL-17+、CD4+IL-23+抗體混勻,室溫避光孵育30 min,加入紅細(xì)胞裂解液混勻,室溫避光孵育10 min,冰PBS洗滌3次,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

    1.2.7RT-PCR檢測(cè)MMP-1、MMP-3、MMP-13表達(dá)水平 Trizol試劑提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。96℃預(yù)變性30 s,96℃變性10 s,56℃退火30 s,72℃延伸10 s,共30個(gè)循環(huán);4℃保存。以β-actin為內(nèi)參。

    2 結(jié)果

    2.1牡荊素減輕RA大鼠軟骨損傷 通過HE染色病理切片鏡檢發(fā)現(xiàn):Control組大鼠關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)完整,腔內(nèi)無滲出液,滑膜組織正常;Model組關(guān)節(jié)間隙狹窄,可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),并伴有血管翳形成;給藥組病理癥狀明顯減輕,且呈劑量依賴性減輕,見圖1。

    2.2牡荊素誘導(dǎo)RA大鼠的軟骨細(xì)胞增殖 通過Western blot檢測(cè)Ki67和PCNA蛋白表達(dá),與Control組相比,Model組Ki67和PCNA蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05,圖2A),說明牡荊素可抑制Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的RA大鼠細(xì)胞增殖;與Model組相比,給藥組Ki67和PCNA蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05,圖2A),且效果呈劑量依賴性增強(qiáng),說明牡荊素呈劑量依賴性誘導(dǎo)RA大鼠的細(xì)胞增殖。

    2.3牡荊素抑制RA大鼠的軟骨細(xì)胞凋亡 Western blot檢測(cè)Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá),與Control組相比,Model組Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05,圖2B),與Model組相比,給藥組Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05,圖2B),且效果隨給藥劑量增加而增強(qiáng),說明牡荊素呈劑量依賴性抑制RA大鼠的細(xì)胞凋亡。

    2.4牡荊素減輕RA大鼠炎癥 ELISA檢測(cè)大鼠外周血IL-17和IL-23含量,與Control組相比,Model組IL-17和IL-23含量顯著升高(P<0.05,圖3A),說明牡荊素可抑制RA大鼠的炎癥反應(yīng);與Model組相比,給藥組IL-17和IL-23含量顯著降低(P<0.05,圖3A),且效果隨給藥劑量增加而增強(qiáng),說明牡荊素呈劑量依賴性抑制RA大鼠的炎癥反應(yīng)。

    圖1 HE染色(×400)Fig.1 HE staining (×400)

    流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+IL-17+和CD4+IL-23+水平,與Control組相比,Model組CD4+IL-17+和CD4+IL-23+所占百分比顯著升高(P<0.05, 圖3B),說明牡荊素可抑制Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的RA大鼠的炎癥反應(yīng);與Model組相比,給藥組CD4+IL-17+和CD4+IL-23+百分比顯著降低(P<0.05,圖3B),且效果隨給藥劑量的增加而增強(qiáng),說明牡荊素呈劑量依賴性抑制RA大鼠的炎癥反應(yīng)。

    圖2 Western blot檢測(cè)Ki67、PCNA、Caspase-3和Caspase-9表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of Ki67,PCNA,Caspase-3 and Caspase-9 were detected by Western blotNote: Compared with Control,*.P<0.05;compared with Model,#.P<0.05.

    圖3 各組大鼠IL-17、IL-23、CD4+IL-17+和CD4+IL-23+水平Fig.3 IL-17,IL-23,CD4+IL-17+and CD4+IL-23+ levels in each group of ratsNote: A.IL-17 and IL-23 levels were detected by ELISA;B.CD4+IL-17+and CD4+IL-23+levels were detected by flow cytometry.Compared with Control,*.P<0.05;compared with Model,#.P<0.05.

    2.5牡荊素抑制RA大鼠MMP mRNA相關(guān)的表達(dá) RT-PCR檢測(cè)大鼠MMP-1、MMP-3和MMP-13 RNA表達(dá),與Control組相比,Model組MMP-1、MMP-3和MMP-13相關(guān)mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05,圖4A),說明牡荊素可抑制Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的RA能誘導(dǎo)大鼠MMP相關(guān)RNA表達(dá);與Model組相比,給藥組MMP-1、MMP-3和MMP-13 RNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05,圖4A),且效果隨給藥劑量增加而增強(qiáng),說明牡荊素呈劑量依賴性抑制RA大鼠的MMP相關(guān)mRNA表達(dá)。

    Western blot檢測(cè)MMP-1、MMP-3和MMP-13蛋白表達(dá),與Control組相比,Model組MMP-1、MMP-3和MMP-13蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05,圖4B),說明牡荊素可抑制Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的RA大鼠MMP相關(guān)蛋白表達(dá);與Model組相比,給藥組MMP-1、MMP-3和MMP-13蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05,圖4B),且效果隨給藥劑量增加而增強(qiáng),說明牡荊素呈劑量依賴性抑制RA大鼠的MMP相關(guān)蛋白表達(dá)。

    2.6牡荊素抑制RA大鼠的TGF-β1/Smad2通路 Western blot檢測(cè)TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá),與Control組相比,Model組TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),說明牡荊素可抑制Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的RA大鼠TGF-β1/Smad2通路激活;與Model組相比,給藥組TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05),且效果隨給藥劑量增加而增強(qiáng),說明牡荊素呈劑量依賴性抑制RA大鼠的TGF-β1/Smad2通路激活。見圖5。

    圖4 各組大鼠的MMP-1、MMP-3和MMP-13表達(dá)水平Fig.4 MMP-1,MMP-3 and MMP-13 expression levels in each group of ratsNote: A.RT-PCR was used to detect expression levels of MMP-1,MMP-3 and MMP-13 rekatuve mRNA;B.Western blot was used to detect expression levels of MMP-1,MMP-3 and MMP-13.Compared with Control,*.P<0.05;compared with Model,#.P<0.05.

    圖5 Western blot檢測(cè)TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá)Fig.5 Detection of TGF-β1 and p-Smad2 protein expression by Western blotNote: Compared with Control,*.P<0.05;compared with Model,#.P<0.05.

    3 討論

    RA發(fā)病可能與遺傳、感染和性激素等有關(guān),病理主要是滑膜襯里細(xì)胞增生、間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及微血管的新生、血管翳的形成及軟骨和骨組織的破壞等[12]。本研究通過HE染色發(fā)現(xiàn)RA大鼠的關(guān)節(jié)間隙狹窄、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),并伴有血管翳形成;而給藥組大鼠病理癥狀明顯減輕,這說明牡荊素能夠減輕Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的RA大鼠的軟骨損傷。

    RA通常會(huì)抑制軟骨細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的凋亡,從而使軟骨組織破壞,因此,有效抑制軟骨組織破壞可減輕RA。Che等[7]報(bào)道牡荊素抑制心肌細(xì)胞凋亡對(duì)心臟起保護(hù)作用,因此,牡荊素有望抑制軟骨組織破壞從而減輕RA。本研究發(fā)現(xiàn)牡荊素可顯著上調(diào)RA大鼠的Ki67和PCNA表達(dá),顯著下調(diào)Caspase-3和Caspase-9表達(dá),說明牡荊素誘導(dǎo)RA大鼠的軟骨細(xì)胞增殖、抑制RA大鼠的軟骨細(xì)胞凋亡。

    RA通常存在間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),因此,有效抑制炎癥反應(yīng)可減輕RA。Sun等[13]發(fā)現(xiàn)牡荊素通過抑制氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡來減輕大鼠急性阿霉素的心臟毒性,因此,牡荊素有望抑制炎癥反應(yīng)從而減輕RA。本研究發(fā)現(xiàn)牡荊素可顯著降低RA大鼠的IL-17和IL-23含量,說明牡荊素抑制RA大鼠的炎癥反應(yīng)。

    CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群平衡紊亂在RA關(guān)節(jié)局部的炎癥發(fā)展和全身免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。Canete等[14]發(fā)現(xiàn)RA滑膜淋巴細(xì)胞因子Th17/23的高表達(dá)和較高的疾病活性有關(guān)。Th17/23高表達(dá)除了能增強(qiáng)炎癥反應(yīng)外,還增強(qiáng)了關(guān)節(jié)膠原破壞、重建、使骨質(zhì)破壞,及軟骨破壞,并在急性滑膜炎轉(zhuǎn)變?yōu)槁云茐男躁P(guān)節(jié)炎中起關(guān)鍵作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)牡荊素顯著降低RA大鼠CD4+IL-17+和CD4+IL-23+所占百分比,說明牡荊素能抑制大鼠RA。

    MMPs在正常的滑膜成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中無活性,而在RA患者滑膜液中高表達(dá)[16,17],Okada等[18]研究發(fā)現(xiàn)活性MMPs具有使幾乎所有軟骨成分(蛋白聚糖、層黏連蛋白、纖連蛋白和膠原蛋白Ⅳ)變性的能力。因此,有效抑制MMPs表達(dá)能夠減輕RA癥狀。本研究發(fā)現(xiàn)牡荊素顯著下調(diào)RA大鼠MMP-1、MMP-3和MMP-13蛋白表達(dá),說明牡荊素抑制RA大鼠的MMPs相關(guān)蛋白表達(dá)。

    TGF-β/Smad信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移、黏附及胞外基質(zhì)的產(chǎn)生中具有非重要的作用,其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)[19,20]。Hase等[21]研究發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)TGF-β/Smad2信號(hào)通路抑制OPG的產(chǎn)生有助于RA的治療,Xiong等[22]報(bào)道m(xù)iR-21通過TGF-β/Smad信號(hào)通路減輕RA,證明TGF-β/Smad信號(hào)通路在RA的治療中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)牡荊素顯著下調(diào)TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá),說明牡荊素抑制RA大鼠的TGF-β1/Smad2信號(hào)通路。

    綜上所述,牡荊素能夠減輕RA大鼠的軟骨組織損傷、誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞增殖、抑制軟骨細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng),并顯著下調(diào)血漿Th17、Th23和MMPs蛋白表達(dá),從而對(duì)RA起緩解作用。這為牡荊素開發(fā)利用提供新的參考依據(jù),為RA的預(yù)防和治療奠定理論基礎(chǔ)。

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