• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    牡荊素對(duì)Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的緩解作用及對(duì)血漿Th17、Th23和MMPs蛋白水平的影響

    2020-06-12 02:14:20亓洪德亓?xí)?/span>高圣龍
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2020年10期
    關(guān)鍵詞:牡荊藥組膠原蛋白

    亓洪德 盧 程 李 庭 亓?xí)?高圣龍

    (山東省濟(jì)南市人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科,濟(jì)南 271100)

    類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA) 是一種以晨僵、關(guān)節(jié)腫痛、活動(dòng)受限為主要臨床癥狀的慢性炎癥性自身免疫性疾病,最終會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能喪失,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1-3]。RA的發(fā)病原因和機(jī)制復(fù)雜,難以根治,新藥物的開發(fā)是治療RA的新希望。牡荊素是從中藥材牡荊葉和牡荊子中提取的天然黃酮類化合物,具有抑菌、抗炎、抗腫瘤、保護(hù)心臟、保護(hù)神經(jīng)等多種生理作用[4-8],但對(duì)Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的大鼠RA作用機(jī)制尚未明確。輔助性T細(xì)胞17(T helper 17 cell,Th17)是能夠分泌IL-17的T細(xì)胞亞群,輔助性T細(xì)胞23(T helper 23 cell,Th23)是能夠分泌IL-23的T細(xì)胞亞群,在RA患者病灶部位高表達(dá),并與RA的嚴(yán)重程度有關(guān)[9]?;|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一類依賴鈣鋅等金屬離子的內(nèi)肽酶家族,在RA中參與細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)[10]。本文研究牡荊素對(duì)Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的大鼠RA的作用及對(duì)血漿Th17、Th23和MMPs蛋白水平的影響。

    1 材料與方法

    1.1材料 SD大鼠購(gòu)自四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,牛Ⅱ型膠原和弗氏完全佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,牡荊素購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司,HE染色試劑盒購(gòu)自舜百生物科技有限公司,BCA試劑盒購(gòu)自上海晶康生物工程有限公司,IL-17和 IL-23 ELISA試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)科技生物有限公司。

    1.2方法

    1.2.1造模 無菌條件下配制1 mg/ml的牛Ⅱ型膠原乳液(0.1 mol/L醋酸溶解的2 mg/ml的牛Ⅱ型膠原與等體積的弗氏完全佐劑混合)。造模方法參考文獻(xiàn)[11]:模型組每只大鼠尾根部分皮內(nèi)注射0.3 ml 牛Ⅱ型膠原乳液,第15天,同等方法同劑量再次注射牛Ⅱ型膠原乳液;對(duì)照組注射等體積生理鹽水。

    1.2.2分組及給藥方式 將SD大鼠隨機(jī)分為健康對(duì)照組(Control組)、模型組(Model組)和給藥組[Vitexin(1.5 mg)組、Vitexin(3 mg)組、Vitexin(6 mg)組]5組,每組10只。造模52 d后,給藥組每天分別腹腔注射牡荊素1.5、3、6 mg/kg,連續(xù)3周;健康對(duì)照組和模型組注射等體積生理鹽水。

    1.2.3HE染色 將大鼠軟骨組織分離,甲醛固定、酒精脫水、石蠟包埋切片,二甲苯脫蠟、酒精至水,蘇木精水溶液和伊紅染色液染色,酒精脫水、二甲苯透明,封片觀察。

    1.2.4Western blot檢測(cè)蛋白含量 提取總蛋白后用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,將待測(cè)蛋白用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜,封閉液中封閉;加入對(duì)應(yīng)的一抗,4℃過夜;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育,暗室中化學(xué)發(fā)光劑顯色成像。

    1.2.5ELISA及檢測(cè)IL-17和IL-23表達(dá) 將樣品加入用純化的抗體包被的微孔板,并加入生物素化抗體和 HRP 標(biāo)記的親和素,底物 TMB 顯色,酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度,計(jì)算樣品濃度。

    1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+IL-17+、CD4+IL-23+數(shù)量 分別取抗凝血100 μl加入不同測(cè)定管,加入CD4+IL-17+、CD4+IL-23+抗體混勻,室溫避光孵育30 min,加入紅細(xì)胞裂解液混勻,室溫避光孵育10 min,冰PBS洗滌3次,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

    1.2.7RT-PCR檢測(cè)MMP-1、MMP-3、MMP-13表達(dá)水平 Trizol試劑提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。96℃預(yù)變性30 s,96℃變性10 s,56℃退火30 s,72℃延伸10 s,共30個(gè)循環(huán);4℃保存。以β-actin為內(nèi)參。

    2 結(jié)果

    2.1牡荊素減輕RA大鼠軟骨損傷 通過HE染色病理切片鏡檢發(fā)現(xiàn):Control組大鼠關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)完整,腔內(nèi)無滲出液,滑膜組織正常;Model組關(guān)節(jié)間隙狹窄,可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),并伴有血管翳形成;給藥組病理癥狀明顯減輕,且呈劑量依賴性減輕,見圖1。

    2.2牡荊素誘導(dǎo)RA大鼠的軟骨細(xì)胞增殖 通過Western blot檢測(cè)Ki67和PCNA蛋白表達(dá),與Control組相比,Model組Ki67和PCNA蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05,圖2A),說明牡荊素可抑制Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的RA大鼠細(xì)胞增殖;與Model組相比,給藥組Ki67和PCNA蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05,圖2A),且效果呈劑量依賴性增強(qiáng),說明牡荊素呈劑量依賴性誘導(dǎo)RA大鼠的細(xì)胞增殖。

    2.3牡荊素抑制RA大鼠的軟骨細(xì)胞凋亡 Western blot檢測(cè)Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá),與Control組相比,Model組Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05,圖2B),與Model組相比,給藥組Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05,圖2B),且效果隨給藥劑量增加而增強(qiáng),說明牡荊素呈劑量依賴性抑制RA大鼠的細(xì)胞凋亡。

    2.4牡荊素減輕RA大鼠炎癥 ELISA檢測(cè)大鼠外周血IL-17和IL-23含量,與Control組相比,Model組IL-17和IL-23含量顯著升高(P<0.05,圖3A),說明牡荊素可抑制RA大鼠的炎癥反應(yīng);與Model組相比,給藥組IL-17和IL-23含量顯著降低(P<0.05,圖3A),且效果隨給藥劑量增加而增強(qiáng),說明牡荊素呈劑量依賴性抑制RA大鼠的炎癥反應(yīng)。

    圖1 HE染色(×400)Fig.1 HE staining (×400)

    流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+IL-17+和CD4+IL-23+水平,與Control組相比,Model組CD4+IL-17+和CD4+IL-23+所占百分比顯著升高(P<0.05, 圖3B),說明牡荊素可抑制Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的RA大鼠的炎癥反應(yīng);與Model組相比,給藥組CD4+IL-17+和CD4+IL-23+百分比顯著降低(P<0.05,圖3B),且效果隨給藥劑量的增加而增強(qiáng),說明牡荊素呈劑量依賴性抑制RA大鼠的炎癥反應(yīng)。

    圖2 Western blot檢測(cè)Ki67、PCNA、Caspase-3和Caspase-9表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of Ki67,PCNA,Caspase-3 and Caspase-9 were detected by Western blotNote: Compared with Control,*.P<0.05;compared with Model,#.P<0.05.

    圖3 各組大鼠IL-17、IL-23、CD4+IL-17+和CD4+IL-23+水平Fig.3 IL-17,IL-23,CD4+IL-17+and CD4+IL-23+ levels in each group of ratsNote: A.IL-17 and IL-23 levels were detected by ELISA;B.CD4+IL-17+and CD4+IL-23+levels were detected by flow cytometry.Compared with Control,*.P<0.05;compared with Model,#.P<0.05.

    2.5牡荊素抑制RA大鼠MMP mRNA相關(guān)的表達(dá) RT-PCR檢測(cè)大鼠MMP-1、MMP-3和MMP-13 RNA表達(dá),與Control組相比,Model組MMP-1、MMP-3和MMP-13相關(guān)mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05,圖4A),說明牡荊素可抑制Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的RA能誘導(dǎo)大鼠MMP相關(guān)RNA表達(dá);與Model組相比,給藥組MMP-1、MMP-3和MMP-13 RNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05,圖4A),且效果隨給藥劑量增加而增強(qiáng),說明牡荊素呈劑量依賴性抑制RA大鼠的MMP相關(guān)mRNA表達(dá)。

    Western blot檢測(cè)MMP-1、MMP-3和MMP-13蛋白表達(dá),與Control組相比,Model組MMP-1、MMP-3和MMP-13蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05,圖4B),說明牡荊素可抑制Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的RA大鼠MMP相關(guān)蛋白表達(dá);與Model組相比,給藥組MMP-1、MMP-3和MMP-13蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05,圖4B),且效果隨給藥劑量增加而增強(qiáng),說明牡荊素呈劑量依賴性抑制RA大鼠的MMP相關(guān)蛋白表達(dá)。

    2.6牡荊素抑制RA大鼠的TGF-β1/Smad2通路 Western blot檢測(cè)TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá),與Control組相比,Model組TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),說明牡荊素可抑制Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的RA大鼠TGF-β1/Smad2通路激活;與Model組相比,給藥組TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05),且效果隨給藥劑量增加而增強(qiáng),說明牡荊素呈劑量依賴性抑制RA大鼠的TGF-β1/Smad2通路激活。見圖5。

    圖4 各組大鼠的MMP-1、MMP-3和MMP-13表達(dá)水平Fig.4 MMP-1,MMP-3 and MMP-13 expression levels in each group of ratsNote: A.RT-PCR was used to detect expression levels of MMP-1,MMP-3 and MMP-13 rekatuve mRNA;B.Western blot was used to detect expression levels of MMP-1,MMP-3 and MMP-13.Compared with Control,*.P<0.05;compared with Model,#.P<0.05.

    圖5 Western blot檢測(cè)TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá)Fig.5 Detection of TGF-β1 and p-Smad2 protein expression by Western blotNote: Compared with Control,*.P<0.05;compared with Model,#.P<0.05.

    3 討論

    RA發(fā)病可能與遺傳、感染和性激素等有關(guān),病理主要是滑膜襯里細(xì)胞增生、間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及微血管的新生、血管翳的形成及軟骨和骨組織的破壞等[12]。本研究通過HE染色發(fā)現(xiàn)RA大鼠的關(guān)節(jié)間隙狹窄、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),并伴有血管翳形成;而給藥組大鼠病理癥狀明顯減輕,這說明牡荊素能夠減輕Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的RA大鼠的軟骨損傷。

    RA通常會(huì)抑制軟骨細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的凋亡,從而使軟骨組織破壞,因此,有效抑制軟骨組織破壞可減輕RA。Che等[7]報(bào)道牡荊素抑制心肌細(xì)胞凋亡對(duì)心臟起保護(hù)作用,因此,牡荊素有望抑制軟骨組織破壞從而減輕RA。本研究發(fā)現(xiàn)牡荊素可顯著上調(diào)RA大鼠的Ki67和PCNA表達(dá),顯著下調(diào)Caspase-3和Caspase-9表達(dá),說明牡荊素誘導(dǎo)RA大鼠的軟骨細(xì)胞增殖、抑制RA大鼠的軟骨細(xì)胞凋亡。

    RA通常存在間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),因此,有效抑制炎癥反應(yīng)可減輕RA。Sun等[13]發(fā)現(xiàn)牡荊素通過抑制氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡來減輕大鼠急性阿霉素的心臟毒性,因此,牡荊素有望抑制炎癥反應(yīng)從而減輕RA。本研究發(fā)現(xiàn)牡荊素可顯著降低RA大鼠的IL-17和IL-23含量,說明牡荊素抑制RA大鼠的炎癥反應(yīng)。

    CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群平衡紊亂在RA關(guān)節(jié)局部的炎癥發(fā)展和全身免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。Canete等[14]發(fā)現(xiàn)RA滑膜淋巴細(xì)胞因子Th17/23的高表達(dá)和較高的疾病活性有關(guān)。Th17/23高表達(dá)除了能增強(qiáng)炎癥反應(yīng)外,還增強(qiáng)了關(guān)節(jié)膠原破壞、重建、使骨質(zhì)破壞,及軟骨破壞,并在急性滑膜炎轉(zhuǎn)變?yōu)槁云茐男躁P(guān)節(jié)炎中起關(guān)鍵作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)牡荊素顯著降低RA大鼠CD4+IL-17+和CD4+IL-23+所占百分比,說明牡荊素能抑制大鼠RA。

    MMPs在正常的滑膜成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中無活性,而在RA患者滑膜液中高表達(dá)[16,17],Okada等[18]研究發(fā)現(xiàn)活性MMPs具有使幾乎所有軟骨成分(蛋白聚糖、層黏連蛋白、纖連蛋白和膠原蛋白Ⅳ)變性的能力。因此,有效抑制MMPs表達(dá)能夠減輕RA癥狀。本研究發(fā)現(xiàn)牡荊素顯著下調(diào)RA大鼠MMP-1、MMP-3和MMP-13蛋白表達(dá),說明牡荊素抑制RA大鼠的MMPs相關(guān)蛋白表達(dá)。

    TGF-β/Smad信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移、黏附及胞外基質(zhì)的產(chǎn)生中具有非重要的作用,其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)[19,20]。Hase等[21]研究發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)TGF-β/Smad2信號(hào)通路抑制OPG的產(chǎn)生有助于RA的治療,Xiong等[22]報(bào)道m(xù)iR-21通過TGF-β/Smad信號(hào)通路減輕RA,證明TGF-β/Smad信號(hào)通路在RA的治療中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)牡荊素顯著下調(diào)TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá),說明牡荊素抑制RA大鼠的TGF-β1/Smad2信號(hào)通路。

    綜上所述,牡荊素能夠減輕RA大鼠的軟骨組織損傷、誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞增殖、抑制軟骨細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng),并顯著下調(diào)血漿Th17、Th23和MMPs蛋白表達(dá),從而對(duì)RA起緩解作用。這為牡荊素開發(fā)利用提供新的參考依據(jù),為RA的預(yù)防和治療奠定理論基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    牡荊藥組膠原蛋白
    格列美脲聯(lián)合胰島素治療2型糖尿病的臨床效果觀察
    HPLC法測(cè)定低溫烘焙綠豆中牡荊苷與異牡荊苷的含量及變化
    高效液相色譜梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定調(diào)氣丸中6個(gè)主要成分含量
    想不到你是這樣的膠原蛋白
    Coco薇(2017年12期)2018-01-03 21:27:09
    美國(guó)肉參膠原蛋白肽對(duì)H2O2損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用
    膠原蛋白在食品中的應(yīng)用現(xiàn)狀及其發(fā)展前景分析
    梭魚骨膠原蛋白的提取及其性質(zhì)
    一測(cè)雙評(píng)法測(cè)定咳特靈膠囊中牡荊苷與異牡荊苷的含量△
    試論補(bǔ)陽(yáng)還五湯中黃芪與活血藥組的配伍意義
    牡荊素與DNA相互作用的機(jī)理研究
    老司机靠b影院| netflix在线观看网站| 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产高清videossex| 日本a在线网址| 少妇被粗大的猛进出69影院| 怎么达到女性高潮| 久久久精品欧美日韩精品| av免费在线观看网站| 亚洲av成人精品一区久久| 国产乱人伦免费视频| 日韩高清综合在线| 五月伊人婷婷丁香| 精品福利观看| 日本三级黄在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 草草在线视频免费看| 国产免费男女视频| 精品日产1卡2卡| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 日韩欧美 国产精品| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 高清在线国产一区| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产精品日韩av在线免费观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲一区二区三区不卡视频| www.精华液| 1024视频免费在线观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 日本黄色视频三级网站网址| 国内精品久久久久精免费| aaaaa片日本免费| 又大又爽又粗| 亚洲熟妇熟女久久| 国产一区二区在线观看日韩 | 亚洲欧美精品综合久久99| а√天堂www在线а√下载| 男人舔女人下体高潮全视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 制服人妻中文乱码| 欧美日韩一级在线毛片| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久久香蕉精品热| 特级一级黄色大片| 久久久久国产一级毛片高清牌| 精品国产乱码久久久久久男人| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲色图av天堂| 国产在线精品亚洲第一网站| xxxwww97欧美| 成人手机av| 国产精品 国内视频| 两个人免费观看高清视频| 午夜两性在线视频| 9191精品国产免费久久| 国产片内射在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲熟妇熟女久久| 午夜影院日韩av| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产精品 欧美亚洲| av福利片在线| 天天添夜夜摸| 久久天堂一区二区三区四区| 男女午夜视频在线观看| 成年版毛片免费区| 日本一本二区三区精品| 99热6这里只有精品| 69av精品久久久久久| 变态另类丝袜制服| 国产高清激情床上av| 久久久国产欧美日韩av| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产av麻豆久久久久久久| 嫁个100分男人电影在线观看| 露出奶头的视频| 美女大奶头视频| 婷婷精品国产亚洲av| 久久久久久久久中文| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久这里只有精品19| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 嫩草影院精品99| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 欧美日韩国产亚洲二区| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 真人做人爱边吃奶动态| 国产亚洲欧美98| 国产精品 国内视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 一a级毛片在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 精品福利观看| netflix在线观看网站| 国产精品一区二区免费欧美| 91麻豆av在线| 午夜老司机福利片| 欧美成人性av电影在线观看| 九色成人免费人妻av| 午夜a级毛片| 亚洲 国产 在线| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲专区字幕在线| 亚洲在线自拍视频| 国产v大片淫在线免费观看| 久久精品成人免费网站| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| av中文乱码字幕在线| 国产精品久久久久久久电影 | 在线永久观看黄色视频| 久久人人精品亚洲av| 一区二区三区高清视频在线| 国产精品亚洲一级av第二区| 真人做人爱边吃奶动态| 天堂影院成人在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲九九香蕉| a级毛片a级免费在线| 婷婷六月久久综合丁香| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产精品一区二区免费欧美| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产高清激情床上av| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 午夜a级毛片| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 99久久精品热视频| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 午夜免费成人在线视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲国产高清在线一区二区三| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产成人av激情在线播放| 精品欧美一区二区三区在线| 91国产中文字幕| 亚洲精品久久国产高清桃花| 天天添夜夜摸| 久久久久久大精品| 男女床上黄色一级片免费看| 在线免费观看的www视频| 精品久久久久久,| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 少妇粗大呻吟视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲电影在线观看av| 国产精品久久久久久久电影 | 亚洲av美国av| 国产亚洲欧美在线一区二区| 色综合站精品国产| 亚洲av成人av| 久久99热这里只有精品18| 国产私拍福利视频在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 精华霜和精华液先用哪个| 精品国产美女av久久久久小说| 在线观看一区二区三区| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 18禁国产床啪视频网站| 精华霜和精华液先用哪个| 在线视频色国产色| 国产野战对白在线观看| 国产av在哪里看| 久久亚洲精品不卡| 99久久精品热视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲熟女毛片儿| 在线观看66精品国产| 亚洲国产中文字幕在线视频| 中文在线观看免费www的网站 | 99精品欧美一区二区三区四区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产午夜精品论理片| 国产黄片美女视频| 妹子高潮喷水视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| av欧美777| 嫩草影院精品99| 在线观看免费日韩欧美大片| av视频在线观看入口| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 制服人妻中文乱码| 高清在线国产一区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 一本精品99久久精品77| 免费看十八禁软件| 一级片免费观看大全| 国产亚洲av嫩草精品影院| 老司机午夜福利在线观看视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产亚洲精品一区二区www| 精品电影一区二区在线| 久久久国产精品麻豆| 欧美日韩一级在线毛片| 男男h啪啪无遮挡| 久久精品91蜜桃| 宅男免费午夜| 久久久久久久午夜电影| 两性夫妻黄色片| 国产av一区在线观看免费| 看黄色毛片网站| 免费在线观看影片大全网站| 日韩欧美精品v在线| 国产91精品成人一区二区三区| 叶爱在线成人免费视频播放| 午夜老司机福利片| 久久国产精品人妻蜜桃| 91九色精品人成在线观看| 国产精品免费视频内射| 99国产精品一区二区三区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 三级国产精品欧美在线观看 | 亚洲中文日韩欧美视频| 国产激情欧美一区二区| 中文字幕av在线有码专区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲最大成人中文| 亚洲精品在线美女| 国产片内射在线| 哪里可以看免费的av片| 舔av片在线| 黄色片一级片一级黄色片| 久久久久久久久免费视频了| 岛国在线观看网站| 国产亚洲精品第一综合不卡| 欧美又色又爽又黄视频| 免费av毛片视频| 一夜夜www| 日韩三级视频一区二区三区| 俺也久久电影网| 老司机午夜福利在线观看视频| 久久久久久久久中文| 欧美三级亚洲精品| 久久这里只有精品中国| 18禁美女被吸乳视频| 99热6这里只有精品| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日韩国内少妇激情av| 真人做人爱边吃奶动态| netflix在线观看网站| 亚洲中文字幕日韩| 精品人妻1区二区| 国产精品免费一区二区三区在线| 一个人免费在线观看的高清视频| 日本a在线网址| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| www.熟女人妻精品国产| 国产精品国产高清国产av| 大型黄色视频在线免费观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久99热这里只有精品18| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产av麻豆久久久久久久| 日本黄大片高清| 国产精品一及| 一个人免费在线观看电影 | 久久久久久人人人人人| 欧美午夜高清在线| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 一级毛片女人18水好多| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲美女黄片视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 91av网站免费观看| 亚洲成人久久爱视频| 欧美色欧美亚洲另类二区| 九色国产91popny在线| 欧美最黄视频在线播放免费| 99国产精品99久久久久| 亚洲av片天天在线观看| 女警被强在线播放| 国产成人影院久久av| 欧美黑人巨大hd| 亚洲成人久久爱视频| bbb黄色大片| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲成av人片在线播放无| 精品久久久久久,| 最近视频中文字幕2019在线8| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产久久久一区二区三区| 国产伦在线观看视频一区| av在线播放免费不卡| 搡老妇女老女人老熟妇| av片东京热男人的天堂| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产精品久久久av美女十八| 成在线人永久免费视频| x7x7x7水蜜桃| 国产久久久一区二区三区| 级片在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看 | 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲人与动物交配视频| 日韩欧美国产在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 国产一区二区激情短视频| 亚洲五月婷婷丁香| 在线看三级毛片| 91国产中文字幕| 欧美国产日韩亚洲一区| 精品欧美一区二区三区在线| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲一区中文字幕在线| 男女午夜视频在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av | 麻豆av在线久日| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 一级毛片高清免费大全| 男女那种视频在线观看| 曰老女人黄片| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产成年人精品一区二区| 久久中文字幕一级| 美女 人体艺术 gogo| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 精品日产1卡2卡| 999久久久精品免费观看国产| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久香蕉国产精品| 欧美极品一区二区三区四区| 久热爱精品视频在线9| 日本成人三级电影网站| 免费看a级黄色片| 国产黄a三级三级三级人| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 午夜福利免费观看在线| 久久亚洲真实| 两个人看的免费小视频| av免费在线观看网站| 国产一区在线观看成人免费| 天堂√8在线中文| 亚洲五月天丁香| 性色av乱码一区二区三区2| 中文在线观看免费www的网站 | 亚洲欧美一区二区三区黑人| 色精品久久人妻99蜜桃| xxxwww97欧美| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 一区二区三区激情视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 男女视频在线观看网站免费 | 亚洲全国av大片| 国产成年人精品一区二区| 国产精品久久视频播放| 99热这里只有精品一区 | 国产成人aa在线观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 熟女电影av网| 免费av毛片视频| 精品久久久久久久末码| 成熟少妇高潮喷水视频| 一本大道久久a久久精品| 男女午夜视频在线观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 久久午夜亚洲精品久久| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲精品在线美女| 久久久精品欧美日韩精品| 精品久久蜜臀av无| av福利片在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲美女黄片视频| 神马国产精品三级电影在线观看 | 两个人免费观看高清视频| av超薄肉色丝袜交足视频| √禁漫天堂资源中文www| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产精品久久久人人做人人爽| 91国产中文字幕| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 88av欧美| xxxwww97欧美| 国产视频一区二区在线看| 国产精品av久久久久免费| 男女那种视频在线观看| 此物有八面人人有两片| 日韩av在线大香蕉| 在线观看日韩欧美| 99久久综合精品五月天人人| 小说图片视频综合网站| 精品午夜福利视频在线观看一区| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区三| 两个人视频免费观看高清| 在线播放国产精品三级| 成人国产一区最新在线观看| 性色av乱码一区二区三区2| 国产在线精品亚洲第一网站| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 久99久视频精品免费| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲美女视频黄频| 在线观看日韩欧美| 757午夜福利合集在线观看| 丰满的人妻完整版| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 无限看片的www在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| tocl精华| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲片人在线观看| 一级作爱视频免费观看| 国产精品国产高清国产av| 深夜精品福利| 成人国语在线视频| 亚洲中文字幕日韩| 国产三级黄色录像| 99热这里只有精品一区 | 51午夜福利影视在线观看| 久久久精品大字幕| 欧美av亚洲av综合av国产av| 99riav亚洲国产免费| 久久精品国产综合久久久| 亚洲成人久久性| 国产不卡一卡二| 后天国语完整版免费观看| 国产熟女xx| 亚洲片人在线观看| www.www免费av| 亚洲午夜理论影院| 国产精品久久久人人做人人爽| av福利片在线| 又黄又爽又免费观看的视频| 美女黄网站色视频| aaaaa片日本免费| 国产精品免费视频内射| 嫩草影视91久久| 日韩欧美在线乱码| 美女大奶头视频| 国产成人影院久久av| 久久久久久久久中文| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产亚洲av嫩草精品影院| 曰老女人黄片| 免费看美女性在线毛片视频| 国产99久久九九免费精品| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲免费av在线视频| 悠悠久久av| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 十八禁人妻一区二区| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产私拍福利视频在线观看| 成年免费大片在线观看| 不卡一级毛片| av视频在线观看入口| 国产成+人综合+亚洲专区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 一本精品99久久精品77| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 两性夫妻黄色片| 国产黄片美女视频| 性色av乱码一区二区三区2| 丁香六月欧美| 亚洲av成人av| 久久久久久久久免费视频了| 成人三级黄色视频| 可以在线观看的亚洲视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 99热这里只有是精品50| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲 欧美一区二区三区| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 超碰成人久久| 亚洲精品美女久久av网站| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲中文字幕日韩| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲av成人精品一区久久| 国产在线观看jvid| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 十八禁网站免费在线| 老司机福利观看| 日韩免费av在线播放| a级毛片在线看网站| 黑人操中国人逼视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国内精品久久久久久久电影| 免费无遮挡裸体视频| 嫩草影院精品99| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲全国av大片| a级毛片a级免费在线| 99热这里只有精品一区 | 亚洲成a人片在线一区二区| 午夜精品一区二区三区免费看| www日本黄色视频网| 一本大道久久a久久精品| 一边摸一边做爽爽视频免费| 搡老妇女老女人老熟妇| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 99re在线观看精品视频| 可以在线观看的亚洲视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 少妇的丰满在线观看| 久久久久久人人人人人| 一级片免费观看大全| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精品九九99| 亚洲天堂国产精品一区在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲人成电影免费在线| 国产亚洲av高清不卡| 日韩欧美免费精品| 一级毛片女人18水好多| 91麻豆精品激情在线观看国产| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产精品av久久久久免费| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 在线观看66精品国产| 国产伦人伦偷精品视频| 免费在线观看日本一区| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲一区高清亚洲精品| 久久久久久人人人人人| 亚洲五月婷婷丁香| 欧美精品亚洲一区二区| 国产黄色小视频在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久9热在线精品视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美zozozo另类| 日韩欧美在线乱码| 国产午夜精品久久久久久| 九色国产91popny在线| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 午夜老司机福利片| 少妇粗大呻吟视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲色图av天堂| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 欧美一级a爱片免费观看看 | 国产av又大| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 免费人成视频x8x8入口观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 成在线人永久免费视频| 中文字幕av在线有码专区| 国产午夜精品久久久久久| 国产99久久九九免费精品| 99精品欧美一区二区三区四区| 天堂影院成人在线观看| 久久久久亚洲av毛片大全| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 悠悠久久av| 午夜福利视频1000在线观看| 精品不卡国产一区二区三区| 免费搜索国产男女视频| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 欧美日韩乱码在线| 国产伦在线观看视频一区| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲成av人片在线播放无| 舔av片在线| 欧美最黄视频在线播放免费| 长腿黑丝高跟| 精品久久久久久久久久久久久| 午夜福利欧美成人| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲免费av在线视频| 久久人人精品亚洲av| xxxwww97欧美| 午夜影院日韩av| 很黄的视频免费| 午夜福利高清视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 黄色 视频免费看| 亚洲人成电影免费在线| 午夜福利高清视频| 三级毛片av免费| 日本五十路高清| 少妇的丰满在线观看|