細胞自噬參與病毒免疫關(guān)鍵環(huán)節(jié)①

朱君瑤 翟永貞

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院感染科，沈陽 110004)

細胞自噬從被發(fā)現(xiàn)，到2016年大隅良典因其獲得諾貝爾獎至今，一直都是細胞分子領(lǐng)域的研究熱點，近些年細胞自噬相關(guān)的文章大量涌現(xiàn)，細胞自噬的多種生理功能被挖掘，其中在機體免疫方面的自噬的功能一直備受關(guān)注，研究表明自噬在機體免疫系統(tǒng)，包括免疫防御，免疫監(jiān)視，免疫自身穩(wěn)定方面均存在重要的意義[1-3]。自噬作為“降解”的一種途徑，可以將大分子物質(zhì)分解成可被再利用的小分子物質(zhì)；或?qū)⒁褤p壞或有害的物質(zhì)清除以維持自身的穩(wěn)態(tài)[4]，同時也是細胞重要的防御機制，面對病毒寄生的威脅，自噬擁有將寄生在宿主細胞內(nèi)的病毒的蛋白質(zhì)、核酸以及組裝好的病毒顆粒包裹運送至溶酶體的能力[5]，這為自噬在抗病毒免疫中的作用奠定了重要基礎(chǔ)。雖然目前對于自噬參與抗病毒免疫的機制仍未完全了解，但已有相關(guān)實驗證明自噬參與病毒免疫，Liu等[6]利用果蠅模型，發(fā)現(xiàn)炎性依賴的干擾素刺激基因(stimulator of interferon genes，Sting)活化可以誘導(dǎo)抗病毒自噬限制寨卡病毒在果蠅大腦中的感染，這驗證了自噬在病毒固有免疫方面的功能，同時自噬和干擾素協(xié)同作用也可以促進病毒的清除[7]，自噬在細胞因子的調(diào)控中發(fā)揮雙重作用也成為一個新興的研究課題[8]。此外自噬可被Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)信號誘導(dǎo)清除細胞內(nèi)病原體[9]，協(xié)助吞噬細胞非特異性吞噬病毒，參與病毒抗原的加工提呈，同時自噬也參與了記憶型免疫細胞的形成和壽命的長期維持，應(yīng)對抗病毒的持續(xù)感染或二次感染[10]。已有綜述將自噬的抗病毒免疫作用從天然免疫和適應(yīng)性免疫方面進行了概括性的敘述[11]，鑒于自噬在免疫應(yīng)答中的多重作用(見圖1)，本文主要對自噬在病毒感染免疫中參與的吞噬作用，抗原提呈，淋巴細胞的維穩(wěn)和轉(zhuǎn)化環(huán)節(jié)的研究進展作一綜述。

1 自噬與吞噬作用

吞噬作用是細胞表面模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識別并結(jié)合微生物表面的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)后，將胞外病原體內(nèi)吞形成吞噬泡，與細胞中的內(nèi)體融合形成成熟的吞噬泡，最終與溶酶體融合消化降解吞入的病原體的過程[12]。當(dāng)病毒突破機體屏障結(jié)構(gòu)進入皮膚或皮下組織，接觸到周圍存在的巨噬細胞，即被吞噬清除。值得注意的是，有研究發(fā)現(xiàn)除了對病毒實體的直接吞噬清除，吞噬細胞也可以通過吞噬凋亡細胞，即病毒感染后誘導(dǎo)凋亡的宿主細胞，來限制病毒的傳播減輕病毒感染的病理損傷[13]。最新研究顯示冬凌草甲酸可以通過激活TLR-4增強巨噬細胞的自噬來提高吞噬凋亡體的能力[14]，在此之前Bonilla等[15]在實驗中通過觀察自噬相關(guān)基因7(autophagy-related gene 7，Atg7)缺乏小鼠的巨噬細胞在結(jié)核分枝桿菌感染中的表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)自噬可以通過調(diào)整A類清道夫受體的數(shù)量來調(diào)節(jié)吞噬作用，兩者的實驗都闡述了自噬對巨噬細胞吞噬作用的直接調(diào)節(jié)作用。

圖1 自噬參與免疫的多種途徑Fig.1 Variety of immunity pathways involved by autophagy

近年來，不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)自噬與吞噬之間存在協(xié)同作用且共享某些元件，兩者在形成自噬體和吞噬體以及成熟方面高度相似。有實驗顯示，在相關(guān)TLR被激活后，含有內(nèi)容物的單層膜吞噬泡可以迅速招募微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light-chain 3,LC3)，然后與溶酶體融合，加速吞噬細胞對被吞噬病原體的殺滅作用，此過程稱為LC3相關(guān)吞噬作用(LC3-associated phagocytosis，LAP)[16]。值得注意的是，LC3是自噬過程重要的標(biāo)志蛋白，自噬的啟動有賴于LC3的脫乙?；痆17]，且LC3在自噬體膜的延伸和成熟中同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用[18]。LAP與自噬均可被TLR激活，參與機體的固有免疫[16]，最新的研究顯示LAP在對抗真菌感染以及原生動物寄生方面起到關(guān)鍵性作用[19,20]，但在病毒消除方面的直接作用尚未得到證實，相反有學(xué)者發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)可以利用LAP途徑逃脫細胞的抗病毒防御，在產(chǎn)生細胞限制因子骨髓基質(zhì)抗原2 (bone marrow stromal antigen 2,BST2)的細胞中，BST2可以限制包膜病毒例如HIV的釋放，而HIV輔助蛋白Vpu(HIV-1 Viral Proteins U,Vpu)可以拮抗這一作用。Madjo等[21]研究發(fā)現(xiàn)LC3蛋白的其中一個亞型LC3C起到關(guān)鍵作用，實驗觀察到海拉(HeLa)細胞中LC3C是Vpu介導(dǎo)清除位于病毒出芽位點的BST2的關(guān)鍵分子，有趣的是，Vpu利用LC3C需要BST2的表達，與LC3C特異性結(jié)合，再與BST2結(jié)合，類似于激活LAP途徑來促進BST2向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，減少對病毒釋放的干擾。缺乏LC3C會導(dǎo)致成熟的病毒滯留在細胞內(nèi)單層膜的囊泡內(nèi)，影響病毒的釋放。這揭示了病毒面對細胞防御措施時往往可以利用自噬逃離免疫，進一步探究自噬途徑在病毒免疫中發(fā)揮的作用會是展開抗病毒免疫新局面的重要手段。

2 自噬與抗原提呈

抗原提呈是機體從天然固有免疫向適應(yīng)性免疫轉(zhuǎn)變的過渡階段，也是機體對病原體進行免疫應(yīng)答的起始階段，在此過程中抗原提呈細胞和人類主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex class molecules，MHC)擔(dān)負起了非常重要的任務(wù)。病毒因其寄生的特點，既可以作為外源性抗原，也可以作為內(nèi)源性抗原，分別激活經(jīng)典的MHCⅠ或MHCⅡ途徑，并且涉及交叉提呈途徑，因此了解自噬對抗原提呈的影響對于認識自噬抗病毒作用有重要意義。

啟動針對某些病毒的抗病毒免疫可能更多地依賴于被感染的抗原提呈細胞利用內(nèi)源性抗原通過MHCⅡ途徑激活[22]，有實驗證明單純性皰疹病毒1 (Herpes Simplex Virus 1，HSV1)的神經(jīng)毒性因子ICP34.5(infected cell protein 34.5)可以破壞巨自噬，從而抑制MHCⅡ類分子上的病毒抗原表達[23]。在Goulon等[24]的實驗中，基于巨自噬的分子機制，在樹突狀細胞(dendritic cell，DC)中，利用LC3融合蛋白將HIV抗原特異性地靶向于自噬體，有利于HIV抗原MHCⅡ限制性表達，且增強CD4+T細胞反應(yīng)。除了直接向溶酶體提供降解的抗原物質(zhì)，Susana等[25]在實驗中發(fā)現(xiàn)，在人類抗原提呈細胞中，用Atg8/LC3修飾的吞噬體顯示成熟延遲，可以延長抗原呈遞時間，吞噬體暫時充當(dāng)抗原的儲存?zhèn)}庫，以維持MHCⅡ類抗原提呈途徑的持續(xù)活動。

相較于自噬對于MHCⅡ經(jīng)典途徑明確的促進作用，其在MHCⅠ途徑中的表現(xiàn)恰恰相反。Monica等[26]明確指出自噬機制支持MHCⅡ限制性抗原提呈，但損害MHCⅠ限制性抗原呈遞。他們通過對比Atg5或Atg7缺陷的小鼠與野生小鼠在在MHCⅠ類分子表達方面的表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)自噬機制的缺陷會提升其表達，且在體內(nèi)外對抗病毒感染的實驗中Atg5缺陷的DC均能更有效地刺激CD8+T細胞。之后也有實驗發(fā)現(xiàn)調(diào)控自噬啟動的重要蛋白Vps34(vacuolar protein sorting 34)缺陷的DC對于卵清蛋白，流感病毒和淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒的MHCⅠ類抗原提呈能力均有明顯的增強作用[27]。

DC作為專職抗原提呈的免疫細胞，在病毒抗原的交叉提呈中有著重要意義，有研究顯示自噬缺陷的DC在交叉提呈可溶性抗原方面(如卵清蛋白)效率下降，但在表面受體靶向抗原或凋亡細胞相關(guān)抗原的交叉表達上沒有缺陷[28]。然而，也有實驗顯示缺乏Vps34的DC在與凋亡細胞相關(guān)抗原的交叉表達上存在缺陷，而其他抗原表現(xiàn)正常交叉[26]。此外，HSV1的ICP34.5可以對抗感染DC的自噬降解，導(dǎo)致溶酶體降解減少，從而損害對HSV1的抗原處理和MHCⅠ表達，猜測自噬可能是作為一種向免疫系統(tǒng)報告病原體入侵的補償手段[29]。

實驗結(jié)果的差異可能歸結(jié)于所選缺陷自噬基因的不同，或者實驗的抗原選取上的不同。此外，有些自噬相關(guān)蛋白除了自噬過程以外也參與其他胞內(nèi)代謝活動。據(jù)此推測，當(dāng)自噬相關(guān)蛋白基因缺陷既引起自噬缺陷，也影響到這些胞內(nèi)代謝活動時，并不能直接說明是自噬缺陷導(dǎo)致了代謝活動的改變?？偨Y(jié)來說，自噬在抗原提呈方面的作用可能由于實驗的差異而存在一些爭議，但實驗所得到的結(jié)果是確實客觀的，利用得到的結(jié)論或許可以改進自噬在體外疫苗制備時提純抗原方面的技術(shù)。

3 自噬與淋巴細胞

逃離了固有免疫系統(tǒng)非特異性清除的病毒持續(xù)復(fù)制，最終會被專職抗原提呈細胞捕獲并激活特異性免疫，啟動由淋巴細胞主導(dǎo)的體液免疫和細胞免疫。

3.1自噬與T淋巴細胞免疫 通過T淋巴細胞清除異物，尤其是病毒等胞內(nèi)微生物感染的宿主細胞，是機體應(yīng)對病毒感染的重要手段。初始T淋巴細胞成熟后分化為功能不同的T細胞，包括細胞毒性T細胞，輔助型T細胞和記憶型T細胞，已經(jīng)有研究證實自噬對于維護初始T細胞的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[30]，且對于正在發(fā)揮免疫功能的T細胞起到保護作用[31]，自噬在各類T細胞中發(fā)揮的作用也被重點關(guān)注。

效應(yīng)型T細胞，因其表面主要表達CD8+因子，也稱作CD8+T細胞，由其介導(dǎo)的細胞毒性作用對于清除病毒感染細胞尤其重要，有學(xué)者通過監(jiān)測細胞內(nèi)的自噬通量，觀察不同發(fā)育階段中的CD8+T細胞在特異性敲除相關(guān)自噬基因后對抗病毒感染的表現(xiàn)[32]，并發(fā)現(xiàn)自噬對于正常效應(yīng)型CD8+T細胞的克隆擴增并不是必需的，但對其通過收縮期形成記憶型T細胞有顯著影響，表明有缺陷的自噬通路損害了CD8+T細胞記憶池的形成。同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在Katrin等[10]的實驗中，他們發(fā)現(xiàn)效應(yīng)型CD8+T細胞不僅需要自噬來抑制細胞死亡和維持生存以應(yīng)對病毒感染，且在對抗流感病毒感染的反應(yīng)中，Atg5缺陷CD8+T細胞達到效應(yīng)反應(yīng)峰值的能力下降，在效應(yīng)階段無法維持細胞活力，同時也影響了記憶T細胞的存活。

細胞免疫和體液免疫的正常過程都需要輔助型T細胞的參與，其也被稱作CD4+T細胞，自噬除了利用清除受損細胞器的功能來保證CD4+T細胞在發(fā)育過程中的穩(wěn)態(tài)[33]，還可以幫助其對抗病毒的侵襲。CD4+T細胞是HIV主要的感染細胞，研究表明在HIV病毒攻擊后早期自噬選擇性地降低了HIV-1轉(zhuǎn)錄活化因子(trans-activator of transcription，Tat)，起到了一定的抵抗作用，但很快就被病毒所抑制[34]。

3.2自噬與B淋巴細胞 在體液免疫中，漿細胞產(chǎn)生的抗體可以中和病毒，阻止其結(jié)合宿主細胞的受體，如果抗體能在病原體復(fù)制之前產(chǎn)生，那么體液免疫就能阻止感染的臨床表現(xiàn)，這也是注射疫苗的主要目的。自噬在體液免疫，尤其是在B細胞中發(fā)揮的作用已經(jīng)被研究了相當(dāng)長的時間。

首先，為了維持B淋巴細胞在淋巴器官中的正常數(shù)量，B細胞需要基礎(chǔ)水平的自噬[35]。其次，當(dāng)B細胞接受抗原和輔助型T細胞的雙重刺激信號，開始分化為漿細胞以及記憶B細胞時，自噬在其中也起到了重要作用。分化過程中缺乏自噬的B細胞不能夠很好活化，且抗體分泌受損，無法形成有效地體液免疫，Kara等[36]和Florent等[37]的實驗證實了這一點，且兩者都注意到這是由于自噬可能參與了B細胞抗原受體(B cell receptor，BCR)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運，影響B(tài)細胞的極化。

對于漿細胞而言，自噬更多地滿足了維持細胞穩(wěn)態(tài)和長期體液免疫的雙重需要。實驗發(fā)現(xiàn)自噬缺陷小鼠體內(nèi)的漿細胞分泌免疫球蛋白的能力明顯升高，但與正常小鼠相比，長壽的具有抗原特異性的骨髓漿細胞較少，這證實了免疫球蛋白的合成和生存能力之間具有一種自噬依賴性的保護平衡作用[38]。

在體液免疫中，擁有長壽的記憶B細胞可以更加快速準(zhǔn)確的應(yīng)對病毒的二次感染，有研究表明自噬對于記憶B細胞的初始生成也許不是至關(guān)重要的，但是對于它們的長期生存是必需的，在細胞自噬活躍的記憶B細胞維持階段，刺激自噬可能更有效地改善記憶B細胞的功能[39]。這一發(fā)現(xiàn)可能在制備疫苗以及延長疫苗的效應(yīng)期方面展現(xiàn)了一個新的突破口。

4 結(jié)語與展望

自噬從被發(fā)現(xiàn)至今，在病毒免疫過程中的多種促進或者抑制作用發(fā)現(xiàn)了其在抗病毒治療和預(yù)防方面的巨大潛力。有學(xué)者已經(jīng)想到將抗原同自噬相關(guān)蛋白結(jié)合直接導(dǎo)向自噬通路，用以提高免疫應(yīng)答水平；另外自噬可以延長記憶型免疫細胞的存活壽命，相關(guān)實驗只是發(fā)現(xiàn)了這些現(xiàn)象，但具體的機制問題仍未得到解決。除卻自噬本身可以維持穩(wěn)態(tài)保證細胞存活以外，與其他細胞活動過程的合作或者拮抗是否也可以提高記憶細胞的壽命？如果解決了這類機制問題，對于提高某些疫苗的長效期方面會是重大的突破。