抗人載脂蛋白6單鏈抗體的篩選、制備及活性鑒定①

陳 炯 詹 飛 馮 巍

(河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，洛陽 471023)

人類載脂蛋白6 (human lipocalin 6，hLCN6) 是新發(fā)現(xiàn)的一類附睪特異性表達(dá)并分泌的載脂家族蛋白，能與精子頭部和尾部結(jié)合，與精子成熟有關(guān)[1]。本實(shí)驗(yàn)室曾構(gòu)建了抗hLCN6雜交瘤細(xì)胞株1B2，分泌鼠源單克隆抗體具有較高的組織特異性與靈敏度[2]，可用于精子的免疫熒光檢測。目前，hLCN6單克隆抗體 (hLCN6 mAb) 偶聯(lián)的免疫磁珠可有效用于混合細(xì)胞中精子的分離與法醫(yī)學(xué)鑒定[3]。與傳統(tǒng)單抗相比，小分子重組抗體因分子量小、易于進(jìn)行基因工程操作而備受重視[4-6]，包括單鏈抗體 (scFv)、雙價(jià)單鏈抗體 (bsFv) 和嵌合抗體Fab片段，既保留了親本抗體所具有的高親和力和特異性，又簡單經(jīng)濟(jì)且易于改造，是基于抗原-抗體相互作用分離精子的理想材料。本研究通過構(gòu)建抗hLCN6全套鼠源scFv噬菌體抗體文庫，篩選親和力和特異性較好的抗hLCN6 scFv,并進(jìn)行原核表達(dá)純化和鑒定,為后期規(guī)模化制備該抗體偶聯(lián)的免疫磁珠、法醫(yī)混合斑中精細(xì)胞的分離奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 按照知情同意原則，實(shí)驗(yàn)用精液樣本及女性口腔上皮細(xì)胞樣本，分別由本實(shí)驗(yàn)室健康成年男性和女性志愿者提供。BALB/c小鼠購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；大腸桿菌Escherichiacoli(E.coli)Rosetta(DE3)、pET-28a質(zhì)粒、hLCN6抗原及小鼠抗hLCN6 mAb 1B2由本室保存或制備；噬菌體載體pFAB5C購自Biovector公司；E.coliXL1-Blue和輔助噬菌體M13KO7購自美國Stratagene公司；Triziol試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司；膜蛋白提取試劑盒購自美國Biovision公司；Sulfo-NHS-LC-Biotin、DynabeadsTMM-280 Streptavidin和HRP-Streptavidin試劑盒購自Thermo Fisher公司；鼠抗噬菌體M13抗體、HRP-羊抗鼠IgG、BCA蛋白定量試劑盒和增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物 (ECL) 購自Pierce公司；Ni-NTA親和層析填料購自QIAGEN公司；弗氏佐劑和四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) 購自Sigma-Aldrich；限制性內(nèi)切酶、dNTPs、Taq酶和DNA連接酶購自TaKaRa公司；DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購自北京天根公司；超濾濃縮管購自Millipore公司；引物購自蘇州金唯智公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1全套VH、VL基因的擴(kuò)增和鑒定 hLCN6抗原的制備及動(dòng)物免疫方法參照文獻(xiàn)[2]。用TRIziol試劑從致敏小鼠的脾細(xì)胞中提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)小鼠免疫球蛋白可變區(qū)基因序列中相對(duì)保守的框架區(qū)FR1、FR4，設(shè)計(jì)了4對(duì)簡并引物[7]。序列如下：VHfor:5′-TGGGGSTGTYGTTTTGGCTGMRGAG-ACRGTGA-3′，VHback:5′-SAGGTGMAGCTKCASSA-RTCWGG-3′；VLfor:5′-GGATCAAGTTGGTCCACCATCAGCCCGTTT-3′，VLback:5′-GACATTCTGMTSACMCAGWCTCCA-3′；VH′ for:5′-ACCGCCGGATCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCTGMRGAGACD-GTGAGCGTGG-3′，VH′ back:5′-ATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCSAGGTGCARCTKGTGSAGTCWGG-3′；VL′ for:5′-ATTCTGCGGCCGCTTACCGTTTYATYTCCARCTTKGTCCC-3′，VL′ back:5′-GGCTCGGG-TGGCGGTGGATCCGGCGGTGGCGGTTCGGACATTCT-GMTSACMCAGWCTCCA-3′。其中：r=A/G,Y=T/C,M=A/C,W=A/T,K=G/T,S=C/G，D=G/A/T，劃線部分分別為SfiⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)。以上引物由蘇州金唯智公司合成。以cDNA為模板，分別以VHback、VHfor以及VLback、VLfor為引物，PCR擴(kuò)增全套可變區(qū)基因。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離后，切膠回收全部VH、VL基因。

1.2.2全套scFv基因的克隆和鑒定 以純化的VH、VL全套基因?yàn)槟０?，相?yīng)地分別以VH′ back、VH′ for及VL′ back、VL′ for 為引物，在VH的5′端和3′端分別加上SfiⅠ酶切位點(diǎn)、連接肽編碼序列；在VL的3′端和5′端分別加上NotⅠ酶切位點(diǎn)、連接肽編碼序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，將全部VH′、VL′基因切膠回收。以純化的VH′、VL′全套基因互為模板和引物，進(jìn)行重疊延伸PCR形成編碼連接肽(Gly4Ser)3的序列，從而將全套VH′、VL′基因隨機(jī)拼接為scFv。PCR反應(yīng)先94℃變性45 s，58℃退火45 s、72℃延伸1 min，循環(huán)7次；再加入VH′ back、VL′ for引物，按上述參數(shù)繼續(xù)循環(huán)30次。產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，膠回收全套scFv基因，經(jīng)SfiⅠ和NotⅠ雙酶切后與相同酶切的pFAB5C噬菌體質(zhì)粒連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli XL1-Blue，涂布于含100 μg/ml氨芐青霉素和2%葡萄糖的2×YT (2×YTAG) 瓊脂板上，37℃培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑取單克隆抗體進(jìn)行菌落PCR鑒定。

1.2.3ScFv基因噬菌體抗體庫的構(gòu)建及滴度測定 用15 ml 2×YTAG培養(yǎng)液洗下菌苔，培養(yǎng)至OD600=0.4～0.6，加入2×1010空斑形成單位 (pfu) 輔助噬菌體M13KO7于37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，以1 000 g離心10 min，沉淀用10 ml含100 μg/ml氨芐青霉素和50 μg/ml卡那霉素的2×YT培養(yǎng)基重懸，于37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。次日，1 000 g 離心20 min，收集上清即為噬菌體抗體庫。用0.45 μm的微孔濾膜過濾后于4℃保存。將5 μl經(jīng)適當(dāng)稀釋的噬菌體抗體庫加到 100 μl OD600=1的XL1-Blue菌液中，室溫放置15 min,涂布于2×YTAG瓊脂板上，37℃培養(yǎng)過夜，計(jì)算集落形成單位 (cfu) 即為噬菌體抗體庫滴度。

1.2.4抗hLCN6 scFv 的篩選 純化的hLCN6蛋白按Sulfo-NHS-LC-Biotin試劑盒說明書進(jìn)行生物素化。約5×1011cfu新鮮制備的scFv文庫噬菌體用封閉液 (1×PBS緩沖液中含3% BSA,0.05% Tween-20) 于室溫封閉1 h，加入10 μg生物素化蛋白于封閉后的噬菌體抗體庫中，37℃緩慢振蕩孵育1 h。按說明書加入鏈霉親和素包被的M-280磁珠于混合液中，振蕩孵育30 min捕獲抗原-抗體復(fù)合物。用含0.1% Tween-20的PBS緩沖液 (PBST) 洗滌磁珠10次，胰酶消化30 min后洗脫噬菌體。洗脫的噬菌體溶液感染XL1-Blue后涂布2×YTAG培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)過夜，同時(shí)進(jìn)行噬菌體滴度檢測，計(jì)算噬菌體output、input等，完成第1輪篩選。用M13KO7進(jìn)行超感染，對(duì)再次生成的抗體庫進(jìn)行第2輪篩選。該過程重復(fù)4輪以獲得具有特異性抗體的噬菌體文庫。

1.2.5陽性克隆的ELISA檢測 將第4輪親和富集篩選的陽性噬菌體感染E.coliXL1-Blue后，從所涂布的平板上隨機(jī)挑取單克隆菌落接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 (含2×YTAG培養(yǎng)基) 培養(yǎng)過夜。次日從該板上轉(zhuǎn)接2 μl菌液至第二塊96孔板，37℃培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8時(shí)加入1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，30℃培養(yǎng)過夜。次日離心取上清進(jìn)行ELISA檢測[8]。用hLCN6抗原 (2 μg/孔) 包被96孔酶標(biāo)板，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后，每孔加入30 μl誘導(dǎo)上清，陰性對(duì)照孔加入輔助噬菌體M13KO7超感染的pFAB5C空載體離心上清，陽性對(duì)照孔加入抗hLCN6 mAb，空白對(duì)照孔直接加PBS，室溫孵育1 h。PBST洗3次后，每孔加入1∶5 000稀釋的鼠抗噬菌體M13抗體，室溫孵育1 h。洗板3次后，加入HRP-羊抗鼠IgG孵育1 h。再以PBST洗板3次后加入TMB底物顯色，然后加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取OD450值。陽性克隆菌株確定標(biāo)準(zhǔn)為：OD值為陰性對(duì)照值3倍以上。

1.2.6陽性克隆的基因序列分析及表達(dá)純化 對(duì)ELISA檢測陽性克隆進(jìn)行測序以確認(rèn)抗體序列。根據(jù)pFAB5C載體序列合成測序引物。P1:5′-TATGCTTCCGGCTCGTATGT-3′，P2:5′-GTCAGACGATTGGCCTTGAT-3′。再以陽性噬菌體質(zhì)粒為模板，用上游引物5′-GGAATTCCATATGGTCAAACTGCAGCAGTCTGG-3′ (劃線部分為NdeⅠ限制性酶切位點(diǎn))、下游引物5′-CCGCTCGAGCTACCGTTTTATT-TCCAGCTTGGTCCC-3′ (劃線部分為XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn)) 擴(kuò)增不含基因Ⅲ信號(hào)肽序列的scFv基因，連接到pET-28a表達(dá)載體后轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta (DE3)，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中 (含50 μg/ml 卡那霉素和34 μg/ml氯霉素) 過夜培養(yǎng)，再以 1∶100的比例放大培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，加入1 mmol/L IPTG于37℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。離心收集菌體，懸浮于20 ml裂解緩沖液 (50 mmol/L Tris-Cl，150 mmol/L NaCl，100 μg/ml 苯甲基磺酰氟，pH 8.0) 中，置于冰上進(jìn)行超聲破碎。將菌體裂解液15 000 r/min 離心20 min，收集上清，用0.45 μmol/L濾膜過濾，上樣于Ni-NTA螯合柱，用20%的洗脫緩沖液 (50 mmol/L Tris-Cl，150 mmol/L NaCl，250 mmol/L 咪唑，pH8.0) 洗脫5個(gè)柱體積，之后以100%洗脫緩沖液洗脫，收集各洗脫峰，進(jìn)行SDS-PAGE分析后合并高純度樣品。將合并的樣品透析過夜后后用超濾法濃縮。以BCA法進(jìn)行定量。

1.2.7抗hLCN6 scFv的生物學(xué)活性鑒定

1.2.7.1Western blot檢測 純化的scFv蛋白按Sulfo-NHS-LC-Biotin試劑盒說明書進(jìn)行生物素化。將誘導(dǎo)后的hLCN6表達(dá)菌株裂解后上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行Western blot檢測。精子與口腔上皮細(xì)胞混合懸液的制備參照文獻(xiàn)[3]。取精子(1×105個(gè)/ml)和口腔上皮細(xì)胞(1×104個(gè)/ml)懸液各1 ml，用膜蛋白提取試劑盒提取精子細(xì)胞膜蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，每份樣品取等量 (80 μg) 進(jìn)行Western blot檢測。一抗為1∶200稀釋的生物素標(biāo)記的scFv，二抗為1∶500稀釋的HRP標(biāo)記的鏈酶親和素，用ECL化學(xué)發(fā)光底物顯影成像。

1.2.7.2間接ELISA法檢測抗hLCN6 scFv的親和力 參考文獻(xiàn)[3]，scFv按Sulfo-NHS-LC-Biotin試劑盒說明書進(jìn)行生物素化。利用間接ELISA法測定抗hLCN6 mAb的親和力，以1 μg/ml hLCN6蛋白包被酶標(biāo)板，用含3%脫脂奶粉的PBS溶液室溫封閉1 h，PBS洗滌。加入倍比稀釋的scFv，室溫孵育1 h。PBST洗板3次，加入HRP標(biāo)記的鏈酶親和素，室溫孵育1 h。洗滌后加底物溶液避光顯色，酶標(biāo)儀讀取OD450值。當(dāng)連續(xù)幾個(gè)稀釋度的OD450讀數(shù)不再增大時(shí)視為抗原抗體100%結(jié)合，以抗體濃度 (mol/L) 為橫坐標(biāo)，OD450吸光值為縱坐標(biāo)作散點(diǎn)圖，生成對(duì)數(shù)趨勢(shì)線和公式。將OD450最大值的一半代入公式，求出此時(shí)的抗體濃度即為scFv的親和力解離常數(shù)(Kd)。

2 結(jié)果

2.1全套scFv基因的克隆與噬菌體抗體庫的構(gòu)建 將全套VH、VL基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳后，擴(kuò)增出的VH基因片段約為340 bp，VL基因片段約為320 bp，與預(yù)期大小一致 (圖1A)。將全套VH、VL基因添加酶切位點(diǎn)及連接肽序列后，用重疊延伸PCR將重、輕鏈可變區(qū)拼接成完整的scFv基因，拼接擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后，得到1條約710 bp的片段，同預(yù)期結(jié)果相符 (圖1B)。將拼接產(chǎn)物雙酶切后與載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli后鋪板，測定庫容為1.5×106，隨機(jī)挑取10個(gè)集落，PCR擴(kuò)增鑒定重組率為90% (圖1C)。

圖1 全套scFv基因的克隆與鑒定Fig.1 Cloning and identification of anti-hLCN6 scFv geneNote: A.PCR amplification of VH and VL gene repertoires；M.DNA marker.Lane 1.Product of VH gene;Lane 2.Product of VL gene;B.Identification of scFv gene products；M.DNA marker;Lane 1-2.PCR products of scFv gene;C.PCR identification of recombinant scFv clones.

2.2噬菌體抗體庫的篩選及陽性克隆的鑒定 噬菌體抗體庫經(jīng)4輪富集篩選后，噬菌體抗體收獲率由第1輪的2.5×10-8增加到第4輪的3.3×10-5，富集倍數(shù)增加1 000多倍 (表1)。將第4輪親和富集篩選的陽性噬菌體感染E.coliXL1-Blue后，從所涂布的平板中隨機(jī)挑取48個(gè)單克隆菌落接種于96 孔板中進(jìn)行培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)scFv，用ELISA進(jìn)行初步篩選，最后得到2株陽性克隆，其分別命名為AM38-6和AM38-7。測序分析表明，2個(gè)克隆為同一序列。其中重鏈可變區(qū)基因長342 bp，編碼114個(gè)氨基酸；輕鏈可變區(qū)基因長327 bp，編碼109個(gè)氨基酸 (圖2)。NCBI blast分析表明，該scFv基因序列符合數(shù)據(jù)庫中單鏈抗體所具有的特點(diǎn)，其重鏈可變區(qū)與小鼠IgG的γ重鏈同源性達(dá)95.8%，輕鏈可變區(qū)與小鼠κ鏈同源性達(dá)97.9%，重鏈和輕鏈可變區(qū)具有完整的骨架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū) (劃線序列) 結(jié)構(gòu)。

表1 親和富集篩選對(duì)抗hLCN6 scFv的富集效應(yīng)

Tab.1 Selective enrichment of anti-hLCN6 phage antibodies from phage display library

Round Input(cfu)Output(cfu)Recovery rate(output/input)Enrichment[rate(n)/rate(1)]11.0×10132.5×1052.5×10-8121.5×10122.0×1061.3×10-65232.0×10123.8×1071.9×10-576042.4×10127.9×1073.3×10-51 320

圖2 抗hLCN6 scFv基因序列分析Fig.2 Sequence analysis of anti-hLCN6 scFv geneNote: Underline.CDR region;Bold.Linker.

2.3抗hLCN6 scFv的表達(dá)純化與生物學(xué)活性鑒定 轉(zhuǎn)化hLCN6 scFv表達(dá)質(zhì)粒的工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，離心收集上清，經(jīng)Ni-NTA親和層析柱分離純化后，收集目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后呈單一蛋白條帶，表明純化的scFv具有較高的純度。蛋白樣品分子量約為27 kD，與scFv理論分子量基本一致 (圖3A)。scFv經(jīng)濃縮和BCA法定量后，其濃度為2.65 mg/ml。Western blot顯示，以純化的生物素標(biāo)記的scFv作為一抗，在誘導(dǎo)菌株裂解物和精子中均檢出hLCN6蛋白，與蛋白已知分子量一致，而口腔上皮細(xì)胞中檢測結(jié)果呈陰性，證明scFv可與hLCN6抗原發(fā)生特異性結(jié)合(圖3B～D)。利用間接ELISA實(shí)驗(yàn)測定抗hLCN6 scFv的親和力，結(jié)果表明該抗體與抗原的Kd值為6.69×107mol/L (圖4)。

圖3 抗hLCN6 scFv的純化與活性鑒定Fig.3 Purification and activity identification of anti-hLCN6 scFvNote: A.ScFv purification by affinity chromatography with a Ni-NTA column;M.Protein marker;Lane 1.Supernatant of lysed bacteria after induction;Lane 2.Loading solution passed through a Ni-NTA column;Lane 3.Elution with wash buffer containing 50mM imidazole;Lane 4-5.Elutions with buffer containing 250mM imidaz-ole；B.hLCN6 expression in E.coli Rosetta (DE3);M.Protein marker;Lane 1.Rosetta (DE3)/pET-28a-hLCN6 (IPTG uninduced);Lane 2.Rosetta (DE3)/pET-28a-hLCN6 (IPTG induced);Lane 3.Precipitation of hLCN6 protein strain after ultrasonication.hLCN6 is indicated with an arrow；C.Western blotting analysis of figure B with anti-hLCN6 scFv;D.Western blotting analysis of hLCN6 expression in spermatozoa and buccal epithelial cells with anti-hLCN6 scFv.Lane 1.Buccal epithelial cells; Lane 2.Spermatozoa.

圖4 抗hLCN6 scFv親和力測定Fig.4 Affinity assay of anti-hLCN6 scfv

3 討論

精子在附睪中所進(jìn)行的表面修飾是精子成熟過程中不可或缺的一步[9]。hLCN6是新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)附睪特異性分泌表達(dá)的載脂家族蛋白，它能夠結(jié)合到精子的頭部和尾部，與精子的成熟有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室曾以E.coli表達(dá)純化的hLCN6為抗原，獲得了抗hLCN6 mAb，其偶聯(lián)的免疫磁珠可成功用于混合細(xì)胞中精子的分離與鑒定。但由于mAb制備成本較高，難以滿足大規(guī)模法醫(yī)檢案的需要，因此制備經(jīng)濟(jì)有效的基因工程抗體成為必需。本實(shí)驗(yàn)室曾用RT-PCR法從雜交瘤細(xì)胞中克隆抗體可變區(qū)基因，但得到的scFv無抗原結(jié)合活性，原因可能是設(shè)計(jì)的簡并引物改變了第一骨架區(qū)氨基酸序列，從而影響了抗原與抗體的結(jié)合[10]。近年來，噬菌體抗體已成為基因工程抗體研究的熱點(diǎn)，并被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域[11-13]。通過噬菌體展示技術(shù)可以快速制備出針對(duì)幾乎所有抗原的功能抗體片段。scFv是目前研究最多的基因工程抗體之一，其免疫原性低，能較好地保持對(duì)抗原的親和性，且易于基因操作和大量生產(chǎn)[14]，對(duì)法醫(yī)物證檢案頗具價(jià)值。

因此，為了快速制備鼠源抗hLCN6 scFv，本研究利用噬菌體展示技術(shù)成功構(gòu)建了全套scFv噬菌體抗體庫，最終獲得了2株能與hLCN6抗原特異結(jié)合的陽性克隆。構(gòu)建的工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后呈可溶性表達(dá)，進(jìn)而采用親和層析純化，獲得了高純度的scFv抗體。Western blot和間接ELISA實(shí)驗(yàn)表明，純化的scFv與hLCN6具有較高的親和力，能夠特異性的識(shí)別并結(jié)合精子上的hLCN6蛋白。

綜上，與本實(shí)驗(yàn)室曾采用的以E.coli原核表達(dá)系統(tǒng)制備抗hLCN6 scFv相比，利用噬菌體展示技術(shù)制備scFv更能保持其抗原結(jié)合活性，可大量生產(chǎn)，為后續(xù)構(gòu)建抗hLCN6 scFv免疫磁珠用于法醫(yī)混合檢材中精細(xì)胞的鑒定與分離奠定了基礎(chǔ)。