王 勇 黃大兵 沈夏波 張鋒利 張洪波
(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)腫瘤科,合肥 230001)
肺癌是臨床常見惡性腫瘤且具有較高的發(fā)病率及死亡率,資料顯示,非小細胞肺癌發(fā)病率呈增加趨勢且嚴重影響患者生命安全[1]。目前臨床不斷優(yōu)化放化療方案,肺癌相關(guān)靶向藥物及免疫治療可有效提高治療效果,但存在腫瘤細胞對放化療耐受性等問題[2]。因而探究肺癌放療抵抗性的機制并尋找提高肺癌細胞放療敏感性的藥物有助于制定個性化治療方案。甘草素(liquiritigenin,LQ)是從甘草中提取的化合物,具有抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)活性,可增強不同腫瘤細胞對放、化療的敏感性,提高治療效果及改善患者預(yù)后[3,4]。但LQ對肺癌細胞放療抵抗性的作用效果及其作用機制尚未見報道。野生型p53誘導(dǎo)基因1(wild-type p53-induced gene1,WIG-1)在腫瘤細胞中高表達并可能參與細胞凋亡及氧化應(yīng)激等生物學(xué)過程[5]。研究發(fā)現(xiàn)WIG-1基因在小細胞肺癌耐藥細胞株中呈高表達并可能降低肺癌細胞對多種化療藥物的敏感性[6]。本研究通過使用適宜濃度LQ作用于肺癌細胞,檢測放射線對肺癌細胞增殖及凋亡的影響,探討LQ是否通過調(diào)控WIG-1基因表達進而增強肺癌細胞放療敏感性,為肺癌的臨床治療提供參考。
1.1材料 人肺癌細胞株H1299購自美國ATCC細胞庫;LQ購自南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院(純度99.68%),置于DMSO中儲存;RPMI1640 培養(yǎng)基與胎牛血清均購自美國Gibco公司;噻唑藍 (MTT)與Annexin-V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒均購自上海生工生物工程股份有限公司;兔抗人WIG-1單克隆抗體購自美國Cellsignal公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記(HRP)的山羊抗兔IgG二抗與兔抗人GAPDH均購自美國Santa Cruz公司;BCA蛋白定量試劑盒與蛋白提取試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所;Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國ThermoFisher公司;WIG-1 siRNA及其陰性對照質(zhì)粒均購自蘇州吉瑪基因股份有限公司。
1.2方法
1.2.1細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 H1299細胞置于RPMI 1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清)中培養(yǎng),放入相對濕度95%、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi),2 d更換培養(yǎng)液,收集對數(shù)生長期細胞用于實驗。轉(zhuǎn)染前1 d將H1299細胞重懸于6孔細胞培養(yǎng)板,24 h后待細胞生長融合至60%左右時,分別將WIG-1 siRNA(si-WIG-1組)及陰性對照序列(si-con組)轉(zhuǎn)染至H1299細胞,將pcDNA-WIG1(pcDNA-WIG1組)及pcDNA(pcDNA組)轉(zhuǎn)染至H1299細胞,將未進行任何處理的H1299細胞作為NC組。轉(zhuǎn)染后放入恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)6 h,更換RPMI1640完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集對數(shù)生長期細胞用于實驗。
1.2.2LQ處理及實驗分組 收集未經(jīng)任何處理的處于對數(shù)生長期約H1299細胞,制備單細胞懸液(1×106個/ml),180 μl/孔接種至96孔板,每孔加入20 μl不同濃度LQ溶液(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L)[7],以未加入LQ溶液的H1299細胞為對照,對照H1299細胞中加入等體積生理鹽水培養(yǎng),每組均設(shè)置4個復(fù)孔。采用X射線分別以劑量2、4、6、8 Gy照射H1299細胞,照射2次,3 min/次,將H1299細胞分別設(shè)為NC 組:只加培養(yǎng)基;DMSO組:陰性對照;LQ組:含有LQ的培養(yǎng)基。后續(xù)實驗中又分為放射組(IR組):每次采用4 Gy X射線照射3 h;si-WIG-1+IR聯(lián)合放射組:將轉(zhuǎn)染si-WIG-1的H1299細胞經(jīng)4 Gy X線照射;LQ+IR聯(lián)合放射組:LQ處理H1299細胞12 h后采用4 Gy X射線照射;LQ+pcDNA+IR組:將pcDNA轉(zhuǎn)染至LQ+IR聯(lián)合放射組H1299細胞;LQ+ pcDNA-WIG1+IR組:將pcDNA-WIG1轉(zhuǎn)染至LQ+IR聯(lián)合放射組H1299細胞。所有經(jīng)X射線照射處理組均于處理3 h后進行檢測。
1.2.3細胞增殖實驗 分別取各組H1299細胞,制備單細胞懸液,調(diào)整細胞濃度至3×104ml-1,以每孔100 μl單細胞懸液接種至96孔細胞培養(yǎng)板,每組設(shè)置4個復(fù)孔,分別于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后在每孔加入20 μl MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清,加入DMSO(150 μl/孔),微量振蕩器振蕩,10 min后置于酶標(biāo)儀檢測各孔490 nm處吸光度值,計算細胞增殖抑制率=[1-(藥物處理組/陰性對照組吸光度值)]×100%。
1.2.4細胞凋亡實驗 收集各組對數(shù)生長期H1299細胞,PBS清洗,1 200 r/min離心5 min,離心半徑為6 cm,加入結(jié)合緩沖液(500 μl)懸浮細胞,分別加入5 μl Annexin V-FITC與PI,置于流式細胞儀檢測各組H1299細胞凋亡率。
1.2.5Western blot檢測WIG-1蛋白表達 采用預(yù)冷PBS洗滌各組H1299細胞,參照蛋白提取試劑盒提取總蛋白,利用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度,25 μl蛋白經(jīng)15%SDS-PAGE凝膠電泳分離,將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜,脫脂牛奶封閉2 h,加入WIG-1(1∶200)、GAPDH(1∶800)抗體孵育過夜(4℃),次日PBS清洗,加入IgG二抗(1∶5 000),室溫孵育2 h后使用PBS清洗,ECL顯影并置于凝膠成像分析系統(tǒng)分析各蛋白條帶。
1.2.6克隆形成實驗 收集對數(shù)生長期H1299細胞,制備單細胞懸液,按照1.2.2分組及照射劑量將H1299細胞分別接種至不同培養(yǎng)瓶,X射線照射,細胞存活分數(shù)=照射后細胞克隆形成率/照射細胞克隆形成率,其中克隆形成率為克隆細胞數(shù)與接種細胞數(shù)的比值,參照單擊多靶模型擬合曲線計算照射后各組H1299細胞存活曲線,每組均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù),
2.1不同濃度的LQ對肺癌細胞增殖和凋亡的影響 與未加入LQ組相比,0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L LQ作用24 h、48 h、72 h時肺癌細胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05),隨著增加,細胞增殖抑制率均呈升高趨勢,檢測不同濃度LQ作用48 h時肺癌細胞凋亡率,結(jié)果顯示隨著LQ作用濃度的增加,肺癌細胞凋亡率呈劑量依賴性上升(P<0.05),見圖1、表1。綜合LQ不同濃度下抑制肺癌細胞增殖及促進凋亡的差異,兼顧后續(xù)放射增敏研究的開展(MTT檢測),綜合LQ不同濃度下抑制肺癌細胞增殖及促進凋亡的差異,兼顧后續(xù)放射增敏研究的開展(MTT檢測)。本研究選用LQ 0.2 mmol/L用于后續(xù)實驗,結(jié)果表明LQ可抑制肺癌細胞增殖并促進細胞凋亡。
2.2LQ增加肺癌細胞的放療敏感性 根據(jù)MTT檢測結(jié)果選用LQ作用48 h時 0.2 mmol/L濃度作為干預(yù)劑量,以DMSO為陰性對照。隨著放射劑量的增加,NC組、DMSO組與LQ組肺癌細胞H1299存活分數(shù)均逐漸降低(P<0.05), NC組與DMSO組相比差異無顯著無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),LQ組H1299細胞存活分數(shù)相較于NC組、DMSO組均顯著降低(P<0.05),見圖2、表2,LQ組H1299細胞增敏比(SER)為1.27,表明LQ可增加H1299細胞對放療的敏感性。照射劑量4 Gy時H1299細胞存活分數(shù)為0.5左右,因此后續(xù)研究中以4Gy劑量為照射劑量。
圖1 不同濃度的LQ對肺癌細胞凋亡的影響Fig.1 Effects of different concentrations of LQ on apoptosis of lung cancer cells
2.3LQ和X射線(4 Gy)對肺癌細胞凋亡的影響 流式細胞術(shù)檢測LQ聯(lián)合X射線對H1299細胞凋亡的影響,結(jié)果顯示LQ組IR組H1299細胞凋亡率均比DMSO組顯著升高(P<0.05),LQ+IR組H1299細胞凋亡率均顯著高于LQ 組、IR組(P<0.05),LQ 組與IR組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 見表3。
圖2 不同劑量X射線照射后肺癌細胞的存活曲線Fig.2 Survival curves of lung cancer cells after different irradiation dosesNote: *.P<0.05.
表2 DMSO和LQ組間單擊多靶模型參數(shù)
Tab.2 Parameters of single-hit multi-target(SHMT)model between group DMSO and LQ
GroupsD0 (Gy)Dq (Gy)NSF2kSERDMSO2.042.25 3.06 0.77 0.48 -LQ1.641.48 2.47 0.58 0.61 1.27
GroupsInhibitory rate(LQ 0 mmol/L)24 h48 h72 hApoptosis rateLQ 0 mmol/L0.00±0.000.00±0.000.00±0.005.54±0.83LQ 0.1 mmol/L7.32±0.711)15.06±1.291)27.49±2.631)11.08±1.051)LQ 0.2 mmol/L14.24±1.291)2)23.43±2.881)2)38.54±3.321)2)16.43±2.121)2)LQ 0.4 mmol/L47.26±4.181)2)3)59.56±5.571)2)3)68.22±5.131)2)3)25.26±2.251)2)3)LQ 0.8 mmol/L63.34±5.221)2)3)4)75.57±6.241)2)3)4)87.17±6.141)2)3)4)47.41±3.841)2)3)4)F240.614187.930214.517154.323P0.0000.0000.0000.000
Note:Compared with LQ 0 mmol/L group,1)P<0.05;compared with LQ 0.1 mmol/L group,2)P<0.05;compared with LQ 0.2 mmol/L group,3)P<0.05;compared with LQ 0.4 mmol/L group,4)P<0.05.
GroupsApoptosis rate(%)DMSO5.16±0.49LQ16.82±1.151)IR13.28±1.271)LQ+IR34.49±3.432)3)F122.939P0.000
Note:Compared with NC group,1)P<0.05;compared with LQ group,2)P<0.05;compared with IR group,3)P<0.05.
圖3 不同濃度LQ對肺癌細胞WIG-1的表達的影響Fig.3 Effect of different concentrations of LQ ON expression of WIG-1 in lung cancer cells
GroupsWIG-1 proteinLQ 0 mmol/L0.96±0.08LQ 0.1 mmol/L0.62±0.061)LQ 0.2 mmol/L0.44±0.041)2)LQ 0.4 mmol/L0.31±0.031)2)LQ 0.8 mmol/L0.16±0.021)2)3)F110.837P0.000
Note:Compared with LQ 0 mmol/L group,1)P<0.05;compared with LQ 0.1 mmol/L group,2)P<0.05;compared with LQ 0.2 mmol/L group,3)P<0.05.
結(jié)果表明LQ可促進放療后H1299細胞凋亡。
2.4不同濃度的LQ對肺癌細胞WIG-1表達的影響 Western blot法檢測不同濃度LQ對H1299細胞中WIG-1蛋白表達的影響,結(jié)果顯示隨著LQ作用濃度增加WIG-1蛋白表達呈劑量低依賴性降低(P<0.05),呈劑量依賴效應(yīng),見圖3、表4。結(jié)果表明LQ可抑制H1299細胞WIG-1蛋白表達。
圖4 沉默WIG-1對肺癌細胞放療敏感性的影響Fig.4 Effects of silenced WIG-1 on radiosensitivity of lung cancer cellsNote: A.Expression of WIG-1 in lung cancer cells;B.Survival curves of lung cancer cells after different irradiation doses.*.P<0.05.
GroupsWIG-1 proteinNC0.82±0.08si-con0.75±0.08si-WIG-10.27±0.041)F56.021P0.000
Note:Compared with si-con group,*.P<0.05.
表6 si-con和si-WIG-1組間單擊多靶模型參數(shù)
Tab.6 Parameters of single-hit multi-target(SHMT)model between group si-con and si-WIG-1
GroupsD0 (Gy)Dq (Gy)NSF2kSERsi-con2.13 2.11 2.70 0.74 0.47 -si-WIG-11.43 0.95 1.95 0.42 0.70 1.49
2.5沉默WIG-1肺癌細胞對放療敏感性和細胞凋亡的影響 采用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默WIG-1表達,Western blot檢測轉(zhuǎn)染后H1299細胞中WIG-1蛋白表達并驗證WIG-1的沉默表達效率,結(jié)果顯示si-WIG-1組H1299細胞中WIG-1蛋白表達顯著低于NC組、si-con組(P<0.05),見圖4A、表5。提示沉默WIG-1表達效率良好。不同放療劑量照射H1299細胞后,si-WIG-1組、NC組及si-con組H1299細胞存活分數(shù)均明顯降低(P<0.05),si-WIG-1組顯著低于NC組、si-con組(P<0.05),si-WIG-1組H1299細胞增敏比(SER)為1.49,見圖4B、表6。說明沉默WIG-1表達可增加H1299細胞放療敏感性。采用流式細胞術(shù)觀察H1299細胞凋亡情況,與si-con組相比,si-WIG-1組與IR組H1299細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與si-WIG-1組、IR組相比,si-WIG-1+IR組H1299細胞凋亡率顯著升高(P<0.05),見表7。表明沉默WIG-1基因可誘導(dǎo)放療后H1299細胞凋亡。
GroupsApoptosis rate(%)si-con5.42±0.62si-WIG-117.73±1.451)IR12.87±1.141)si-WIG-1+IR31.74±2.872)3)F122.741P0.000
Note:Compared with si-con group,1)P<0.05;compared with si-WIG-1 group,2)P<0.05;compared with IR group,3)P<0.05.
圖5 過表達WIG-1逆轉(zhuǎn)LQ對肺癌細胞的放療敏感性Fig.5 Overexpression of WIG-1 reverses radiosensitivity of LQ to lung cancer cellsNote:Compared with LQ+pcDNA group,*.P<0.05;compared with LQ group, #.P<0.05.
2.6過表達WIG-1逆轉(zhuǎn)LQ對肺癌細胞的放療敏感性 為了驗證LQ是否通過調(diào)控WIG-1基因表達而增加H1299細胞放療敏感性,通過構(gòu)建WIG-1過表達載體分別轉(zhuǎn)染至LQ+IR組H1299細胞,Western blot法驗證WIG-1的過表達效率,結(jié)果顯示pcDNA-WIG-1組H1299細胞中WIG-1蛋白表達水平顯著高于NC組、pcDNA組(P<0.05),見圖5A、表8。提示W(wǎng)IG-1的過表達效率良好。隨著照射劑量的增加LQ+pcDNA組與LQ+pcDNA-WIG1組H1299細胞存活分數(shù)均逐漸降低(P<0.05),LQ+ pcDNA-WIG1組H1299細胞存活分數(shù)顯著高于LQ+pcDNA組,LQ+pcDNA-WIG1組H1299細胞增敏比(SER)為0.793,見圖5B、表9。表明 WIG1過表達可降低LQ對H1299細胞放療增敏作用。流式細胞術(shù)檢測H1299細胞凋亡率,與LQ+pcDNA+IR比較,LQ+pcDNA-WIG1+IR細胞凋亡率顯著降低(P<0.05),見表10。表明WIG1過表達可逆轉(zhuǎn)LQ促進放療后H1299細胞凋亡的作用。
GroupsWIG-1 proteinNC0.80±0.09pcDNA0.81±0.11pcDNA-WIG-11.48±0.141)F34.349P0.001
Note:Compared with pcDNA group,1)P<0.05.
表9 四組間單擊多靶模型參數(shù)
Tab.9 Parameters of single-hit multi-target(SHMT)model among four groups
GroupsD0 (Gy)Dq (Gy)NSF2kSERDMSO2.041 2.249 3.010 0.757 0.490 -LQ1.639 1.482 2.470 0.579 0.610 1.24LQ+pcDNA1.724 0.955 1.740 0.480 0.580 -LQ+ pcDNAWIG12.174 1.592 2.080 0.653 0.460 0.793
GroupsApoptosis rate(%)DMSO+IR14.84±0.93LQ+IR35.25±1.971)LQ+pcDNA+IR34.24±1.91LQ+ pcDNA-WIG1+IR16.27±1.242)F148.936P0.000
Note:Compared with DMSO + IR group,1)P<0.05;compared with LQ + pcDNA + IR group,2)P<0.05.
肺癌發(fā)生發(fā)展與細胞增殖、凋亡失衡密切相關(guān),抗腫瘤藥物可通過促進腫瘤細胞凋亡進而抑制腫瘤惡化進程,同時還可影響腫瘤細胞放療敏感性[8]。放療是腫瘤治療的主要方法之一,其主要作用機理為輻射可通過激活p53誘導(dǎo)的細胞凋亡途徑進而殺傷腫瘤細胞[9,10]。中藥提取物對惡性腫瘤放療敏感性的影響成為腫瘤放射治療的重點研究,但目前關(guān)于LQ與肺癌細胞放療敏感性的關(guān)系研究結(jié)果較少,因此探究LQ與肺癌細胞放療敏感性的關(guān)系可豐富臨床放療方案。
LQ的主要成分中包含二氫黃酮類成分,可抑制結(jié)腸癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤細胞增殖,還可抑制靜脈內(nèi)皮細胞增殖及遷移[11,12]。本研究結(jié)果顯示不同濃度LQ干預(yù)H1299細胞后可劑量依賴性抑制肺癌細胞增殖并促進細胞凋亡,提示LQ可抑制肺癌細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡。既往研究顯示LQ可通過激活細胞凋亡相關(guān)信號通路進而抑制黑色素瘤、卵巢癌等腫瘤細胞增殖及侵襲[13,14]。分析LQ抑制腫瘤細胞增殖并促使細胞凋亡的機制可能為促進細胞活性氧生成、上調(diào)抑癌基因p53及促凋亡蛋白Bax表達并下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2進而激活線粒體凋亡途徑導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡[15]。由此推測LQ可能通過激活線粒體凋亡途徑進而促進H1299細胞凋亡。張榮芳等[16]研究表明LQ可通過提高鼻咽癌細胞自噬水平進而增強細胞放療敏感性。進一步探究LQ是否可增強肺癌細胞放療敏感性,本研究結(jié)果顯示LQ處理H1299細胞后接受不同X射線照射劑量照射,隨著照射劑量的增加H1299細胞存活分數(shù)明顯降低,LQ處理組H1299細胞存活分數(shù)明顯低于DMSO組、NC組,說明LQ處理組H1299細胞對放射線的敏感性強于DMSO組、NC組H1299細胞。提示LQ處理后可增強肺癌細胞放療敏感性并避免放療抵抗性的發(fā)生。同時采用流式細胞術(shù)檢測肺癌H1299細胞凋亡率,結(jié)果顯示LQ+IR組H1299細胞凋亡率均顯著高于LQ 組、IR組,LQ處理后接受放療的H1299細胞凋亡率明顯升高,說明LQ可提高H1299細胞對放療的敏感性并促進H1299細胞凋亡。提示LQ可能通過促進H1299細胞凋亡進而提高H1299細胞對放療的敏感性。
WIG-1基因在小細胞肺癌耐藥細胞中表達水平高于敏感細胞,抑制WIG-1基因表達可增強小細胞肺癌細胞敏感性[17]。WIG-1主要依賴p53發(fā)揮作用,正常生理條件下WIG-1呈低表達,WIG-1是p53直接作用靶點,機體受到刺激或創(chuàng)傷時WIG-1表達水平明顯升高并可參與細胞增殖及凋亡等多種生物學(xué)過程[18,19]。然而相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)WIG-1基因高表達可抑制食管癌細胞增殖并促進細胞凋亡,同時可通過抑制ERCC1及P-gp表達進而提高食管癌細胞對化療藥物的敏感性[20]。WIG-1在小細胞肺癌與食管癌發(fā)生及發(fā)展過程中的表達及作用效果不同,其可能與癌細胞種類及作用通路不同有關(guān)。本研究結(jié)果顯示不同濃度LQ處理后均可抑制H1299細胞中WIG-1蛋白表達,隨著作用濃度的增加其抑制作用增強。通過沉默WIG-1表達分析其對肺癌細胞放療敏感性及細胞凋亡的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)放療劑量照射H1299細胞后si-WIG-1組H1299細胞存活分數(shù)顯著低于NC組、si-con組,說明沉默WIG-1表達可增強H1299細胞放療敏感性。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示si-WIG-1+IR組H1299細胞凋亡率顯著高于si-WIG-1組、IR組,說明沉默WIG-1表達后經(jīng)X射線照射可促進H1299細胞凋亡。提示沉默WIG-1可增強肺癌細胞放療敏感性并誘導(dǎo)細胞凋亡。為證實LQ是否通過調(diào)控WIG-1基因發(fā)揮作用,進一步研究發(fā)現(xiàn)pcDNA-WIG1組H1299細胞存活分數(shù)顯著高于LQ+pcDNA組,且增敏比明顯降低,說明WIG1過表達后可降低H1299細胞放療敏感性。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示LQ+ pcDNA-WIG1+IR組H1299細胞凋亡率顯著低于LQ+pcDNA+IR組,說明WIG1過表達與LQ共同處理H1299細胞后經(jīng)照射細胞凋亡率明顯升高。提示過表達WIG-1可逆轉(zhuǎn)LQ對肺癌細胞凋亡及放療敏感性的作用。
綜上所述,LQ可促進肺癌細胞凋亡及抑制細胞增殖,同時可通過調(diào)控WIG1基因表達進而增強肺癌細胞對放療的敏感性,為臨床治療研究提供理論依據(jù)。但仍需通過動物實驗及臨床檢測驗證LQ對肺癌發(fā)生及發(fā)展的作用。