• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    甘草素調(diào)控WIG-1基因?qū)Ψ伟┘毎鲋?、細胞凋亡以及放療敏感性影響的研?/h1>
    2020-06-12 02:14:20黃大兵沈夏波張鋒利張洪波
    中國免疫學(xué)雜志 2020年10期
    關(guān)鍵詞:存活X射線敏感性

    王 勇 黃大兵 沈夏波 張鋒利 張洪波

    (中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)腫瘤科,合肥 230001)

    肺癌是臨床常見惡性腫瘤且具有較高的發(fā)病率及死亡率,資料顯示,非小細胞肺癌發(fā)病率呈增加趨勢且嚴重影響患者生命安全[1]。目前臨床不斷優(yōu)化放化療方案,肺癌相關(guān)靶向藥物及免疫治療可有效提高治療效果,但存在腫瘤細胞對放化療耐受性等問題[2]。因而探究肺癌放療抵抗性的機制并尋找提高肺癌細胞放療敏感性的藥物有助于制定個性化治療方案。甘草素(liquiritigenin,LQ)是從甘草中提取的化合物,具有抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)活性,可增強不同腫瘤細胞對放、化療的敏感性,提高治療效果及改善患者預(yù)后[3,4]。但LQ對肺癌細胞放療抵抗性的作用效果及其作用機制尚未見報道。野生型p53誘導(dǎo)基因1(wild-type p53-induced gene1,WIG-1)在腫瘤細胞中高表達并可能參與細胞凋亡及氧化應(yīng)激等生物學(xué)過程[5]。研究發(fā)現(xiàn)WIG-1基因在小細胞肺癌耐藥細胞株中呈高表達并可能降低肺癌細胞對多種化療藥物的敏感性[6]。本研究通過使用適宜濃度LQ作用于肺癌細胞,檢測放射線對肺癌細胞增殖及凋亡的影響,探討LQ是否通過調(diào)控WIG-1基因表達進而增強肺癌細胞放療敏感性,為肺癌的臨床治療提供參考。

    1 材料與方法

    1.1材料 人肺癌細胞株H1299購自美國ATCC細胞庫;LQ購自南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院(純度99.68%),置于DMSO中儲存;RPMI1640 培養(yǎng)基與胎牛血清均購自美國Gibco公司;噻唑藍 (MTT)與Annexin-V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒均購自上海生工生物工程股份有限公司;兔抗人WIG-1單克隆抗體購自美國Cellsignal公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記(HRP)的山羊抗兔IgG二抗與兔抗人GAPDH均購自美國Santa Cruz公司;BCA蛋白定量試劑盒與蛋白提取試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所;Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國ThermoFisher公司;WIG-1 siRNA及其陰性對照質(zhì)粒均購自蘇州吉瑪基因股份有限公司。

    1.2方法

    1.2.1細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 H1299細胞置于RPMI 1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清)中培養(yǎng),放入相對濕度95%、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi),2 d更換培養(yǎng)液,收集對數(shù)生長期細胞用于實驗。轉(zhuǎn)染前1 d將H1299細胞重懸于6孔細胞培養(yǎng)板,24 h后待細胞生長融合至60%左右時,分別將WIG-1 siRNA(si-WIG-1組)及陰性對照序列(si-con組)轉(zhuǎn)染至H1299細胞,將pcDNA-WIG1(pcDNA-WIG1組)及pcDNA(pcDNA組)轉(zhuǎn)染至H1299細胞,將未進行任何處理的H1299細胞作為NC組。轉(zhuǎn)染后放入恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)6 h,更換RPMI1640完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集對數(shù)生長期細胞用于實驗。

    1.2.2LQ處理及實驗分組 收集未經(jīng)任何處理的處于對數(shù)生長期約H1299細胞,制備單細胞懸液(1×106個/ml),180 μl/孔接種至96孔板,每孔加入20 μl不同濃度LQ溶液(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L)[7],以未加入LQ溶液的H1299細胞為對照,對照H1299細胞中加入等體積生理鹽水培養(yǎng),每組均設(shè)置4個復(fù)孔。采用X射線分別以劑量2、4、6、8 Gy照射H1299細胞,照射2次,3 min/次,將H1299細胞分別設(shè)為NC 組:只加培養(yǎng)基;DMSO組:陰性對照;LQ組:含有LQ的培養(yǎng)基。后續(xù)實驗中又分為放射組(IR組):每次采用4 Gy X射線照射3 h;si-WIG-1+IR聯(lián)合放射組:將轉(zhuǎn)染si-WIG-1的H1299細胞經(jīng)4 Gy X線照射;LQ+IR聯(lián)合放射組:LQ處理H1299細胞12 h后采用4 Gy X射線照射;LQ+pcDNA+IR組:將pcDNA轉(zhuǎn)染至LQ+IR聯(lián)合放射組H1299細胞;LQ+ pcDNA-WIG1+IR組:將pcDNA-WIG1轉(zhuǎn)染至LQ+IR聯(lián)合放射組H1299細胞。所有經(jīng)X射線照射處理組均于處理3 h后進行檢測。

    1.2.3細胞增殖實驗 分別取各組H1299細胞,制備單細胞懸液,調(diào)整細胞濃度至3×104ml-1,以每孔100 μl單細胞懸液接種至96孔細胞培養(yǎng)板,每組設(shè)置4個復(fù)孔,分別于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后在每孔加入20 μl MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清,加入DMSO(150 μl/孔),微量振蕩器振蕩,10 min后置于酶標(biāo)儀檢測各孔490 nm處吸光度值,計算細胞增殖抑制率=[1-(藥物處理組/陰性對照組吸光度值)]×100%。

    1.2.4細胞凋亡實驗 收集各組對數(shù)生長期H1299細胞,PBS清洗,1 200 r/min離心5 min,離心半徑為6 cm,加入結(jié)合緩沖液(500 μl)懸浮細胞,分別加入5 μl Annexin V-FITC與PI,置于流式細胞儀檢測各組H1299細胞凋亡率。

    1.2.5Western blot檢測WIG-1蛋白表達 采用預(yù)冷PBS洗滌各組H1299細胞,參照蛋白提取試劑盒提取總蛋白,利用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度,25 μl蛋白經(jīng)15%SDS-PAGE凝膠電泳分離,將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜,脫脂牛奶封閉2 h,加入WIG-1(1∶200)、GAPDH(1∶800)抗體孵育過夜(4℃),次日PBS清洗,加入IgG二抗(1∶5 000),室溫孵育2 h后使用PBS清洗,ECL顯影并置于凝膠成像分析系統(tǒng)分析各蛋白條帶。

    1.2.6克隆形成實驗 收集對數(shù)生長期H1299細胞,制備單細胞懸液,按照1.2.2分組及照射劑量將H1299細胞分別接種至不同培養(yǎng)瓶,X射線照射,細胞存活分數(shù)=照射后細胞克隆形成率/照射細胞克隆形成率,其中克隆形成率為克隆細胞數(shù)與接種細胞數(shù)的比值,參照單擊多靶模型擬合曲線計算照射后各組H1299細胞存活曲線,每組均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù),

    2 結(jié)果

    2.1不同濃度的LQ對肺癌細胞增殖和凋亡的影響 與未加入LQ組相比,0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L LQ作用24 h、48 h、72 h時肺癌細胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05),隨著增加,細胞增殖抑制率均呈升高趨勢,檢測不同濃度LQ作用48 h時肺癌細胞凋亡率,結(jié)果顯示隨著LQ作用濃度的增加,肺癌細胞凋亡率呈劑量依賴性上升(P<0.05),見圖1、表1。綜合LQ不同濃度下抑制肺癌細胞增殖及促進凋亡的差異,兼顧后續(xù)放射增敏研究的開展(MTT檢測),綜合LQ不同濃度下抑制肺癌細胞增殖及促進凋亡的差異,兼顧后續(xù)放射增敏研究的開展(MTT檢測)。本研究選用LQ 0.2 mmol/L用于后續(xù)實驗,結(jié)果表明LQ可抑制肺癌細胞增殖并促進細胞凋亡。

    2.2LQ增加肺癌細胞的放療敏感性 根據(jù)MTT檢測結(jié)果選用LQ作用48 h時 0.2 mmol/L濃度作為干預(yù)劑量,以DMSO為陰性對照。隨著放射劑量的增加,NC組、DMSO組與LQ組肺癌細胞H1299存活分數(shù)均逐漸降低(P<0.05), NC組與DMSO組相比差異無顯著無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),LQ組H1299細胞存活分數(shù)相較于NC組、DMSO組均顯著降低(P<0.05),見圖2、表2,LQ組H1299細胞增敏比(SER)為1.27,表明LQ可增加H1299細胞對放療的敏感性。照射劑量4 Gy時H1299細胞存活分數(shù)為0.5左右,因此后續(xù)研究中以4Gy劑量為照射劑量。

    圖1 不同濃度的LQ對肺癌細胞凋亡的影響Fig.1 Effects of different concentrations of LQ on apoptosis of lung cancer cells

    2.3LQ和X射線(4 Gy)對肺癌細胞凋亡的影響 流式細胞術(shù)檢測LQ聯(lián)合X射線對H1299細胞凋亡的影響,結(jié)果顯示LQ組IR組H1299細胞凋亡率均比DMSO組顯著升高(P<0.05),LQ+IR組H1299細胞凋亡率均顯著高于LQ 組、IR組(P<0.05),LQ 組與IR組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 見表3。

    圖2 不同劑量X射線照射后肺癌細胞的存活曲線Fig.2 Survival curves of lung cancer cells after different irradiation dosesNote: *.P<0.05.

    表2 DMSO和LQ組間單擊多靶模型參數(shù)

    Tab.2 Parameters of single-hit multi-target(SHMT)model between group DMSO and LQ

    GroupsD0 (Gy)Dq (Gy)NSF2kSERDMSO2.042.25 3.06 0.77 0.48 -LQ1.641.48 2.47 0.58 0.61 1.27

    GroupsInhibitory rate(LQ 0 mmol/L)24 h48 h72 hApoptosis rateLQ 0 mmol/L0.00±0.000.00±0.000.00±0.005.54±0.83LQ 0.1 mmol/L7.32±0.711)15.06±1.291)27.49±2.631)11.08±1.051)LQ 0.2 mmol/L14.24±1.291)2)23.43±2.881)2)38.54±3.321)2)16.43±2.121)2)LQ 0.4 mmol/L47.26±4.181)2)3)59.56±5.571)2)3)68.22±5.131)2)3)25.26±2.251)2)3)LQ 0.8 mmol/L63.34±5.221)2)3)4)75.57±6.241)2)3)4)87.17±6.141)2)3)4)47.41±3.841)2)3)4)F240.614187.930214.517154.323P0.0000.0000.0000.000

    Note:Compared with LQ 0 mmol/L group,1)P<0.05;compared with LQ 0.1 mmol/L group,2)P<0.05;compared with LQ 0.2 mmol/L group,3)P<0.05;compared with LQ 0.4 mmol/L group,4)P<0.05.

    GroupsApoptosis rate(%)DMSO5.16±0.49LQ16.82±1.151)IR13.28±1.271)LQ+IR34.49±3.432)3)F122.939P0.000

    Note:Compared with NC group,1)P<0.05;compared with LQ group,2)P<0.05;compared with IR group,3)P<0.05.

    圖3 不同濃度LQ對肺癌細胞WIG-1的表達的影響Fig.3 Effect of different concentrations of LQ ON expression of WIG-1 in lung cancer cells

    GroupsWIG-1 proteinLQ 0 mmol/L0.96±0.08LQ 0.1 mmol/L0.62±0.061)LQ 0.2 mmol/L0.44±0.041)2)LQ 0.4 mmol/L0.31±0.031)2)LQ 0.8 mmol/L0.16±0.021)2)3)F110.837P0.000

    Note:Compared with LQ 0 mmol/L group,1)P<0.05;compared with LQ 0.1 mmol/L group,2)P<0.05;compared with LQ 0.2 mmol/L group,3)P<0.05.

    結(jié)果表明LQ可促進放療后H1299細胞凋亡。

    2.4不同濃度的LQ對肺癌細胞WIG-1表達的影響 Western blot法檢測不同濃度LQ對H1299細胞中WIG-1蛋白表達的影響,結(jié)果顯示隨著LQ作用濃度增加WIG-1蛋白表達呈劑量低依賴性降低(P<0.05),呈劑量依賴效應(yīng),見圖3、表4。結(jié)果表明LQ可抑制H1299細胞WIG-1蛋白表達。

    圖4 沉默WIG-1對肺癌細胞放療敏感性的影響Fig.4 Effects of silenced WIG-1 on radiosensitivity of lung cancer cellsNote: A.Expression of WIG-1 in lung cancer cells;B.Survival curves of lung cancer cells after different irradiation doses.*.P<0.05.

    GroupsWIG-1 proteinNC0.82±0.08si-con0.75±0.08si-WIG-10.27±0.041)F56.021P0.000

    Note:Compared with si-con group,*.P<0.05.

    表6 si-con和si-WIG-1組間單擊多靶模型參數(shù)

    Tab.6 Parameters of single-hit multi-target(SHMT)model between group si-con and si-WIG-1

    GroupsD0 (Gy)Dq (Gy)NSF2kSERsi-con2.13 2.11 2.70 0.74 0.47 -si-WIG-11.43 0.95 1.95 0.42 0.70 1.49

    2.5沉默WIG-1肺癌細胞對放療敏感性和細胞凋亡的影響 采用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默WIG-1表達,Western blot檢測轉(zhuǎn)染后H1299細胞中WIG-1蛋白表達并驗證WIG-1的沉默表達效率,結(jié)果顯示si-WIG-1組H1299細胞中WIG-1蛋白表達顯著低于NC組、si-con組(P<0.05),見圖4A、表5。提示沉默WIG-1表達效率良好。不同放療劑量照射H1299細胞后,si-WIG-1組、NC組及si-con組H1299細胞存活分數(shù)均明顯降低(P<0.05),si-WIG-1組顯著低于NC組、si-con組(P<0.05),si-WIG-1組H1299細胞增敏比(SER)為1.49,見圖4B、表6。說明沉默WIG-1表達可增加H1299細胞放療敏感性。采用流式細胞術(shù)觀察H1299細胞凋亡情況,與si-con組相比,si-WIG-1組與IR組H1299細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與si-WIG-1組、IR組相比,si-WIG-1+IR組H1299細胞凋亡率顯著升高(P<0.05),見表7。表明沉默WIG-1基因可誘導(dǎo)放療后H1299細胞凋亡。

    GroupsApoptosis rate(%)si-con5.42±0.62si-WIG-117.73±1.451)IR12.87±1.141)si-WIG-1+IR31.74±2.872)3)F122.741P0.000

    Note:Compared with si-con group,1)P<0.05;compared with si-WIG-1 group,2)P<0.05;compared with IR group,3)P<0.05.

    圖5 過表達WIG-1逆轉(zhuǎn)LQ對肺癌細胞的放療敏感性Fig.5 Overexpression of WIG-1 reverses radiosensitivity of LQ to lung cancer cellsNote:Compared with LQ+pcDNA group,*.P<0.05;compared with LQ group, #.P<0.05.

    2.6過表達WIG-1逆轉(zhuǎn)LQ對肺癌細胞的放療敏感性 為了驗證LQ是否通過調(diào)控WIG-1基因表達而增加H1299細胞放療敏感性,通過構(gòu)建WIG-1過表達載體分別轉(zhuǎn)染至LQ+IR組H1299細胞,Western blot法驗證WIG-1的過表達效率,結(jié)果顯示pcDNA-WIG-1組H1299細胞中WIG-1蛋白表達水平顯著高于NC組、pcDNA組(P<0.05),見圖5A、表8。提示W(wǎng)IG-1的過表達效率良好。隨著照射劑量的增加LQ+pcDNA組與LQ+pcDNA-WIG1組H1299細胞存活分數(shù)均逐漸降低(P<0.05),LQ+ pcDNA-WIG1組H1299細胞存活分數(shù)顯著高于LQ+pcDNA組,LQ+pcDNA-WIG1組H1299細胞增敏比(SER)為0.793,見圖5B、表9。表明 WIG1過表達可降低LQ對H1299細胞放療增敏作用。流式細胞術(shù)檢測H1299細胞凋亡率,與LQ+pcDNA+IR比較,LQ+pcDNA-WIG1+IR細胞凋亡率顯著降低(P<0.05),見表10。表明WIG1過表達可逆轉(zhuǎn)LQ促進放療后H1299細胞凋亡的作用。

    GroupsWIG-1 proteinNC0.80±0.09pcDNA0.81±0.11pcDNA-WIG-11.48±0.141)F34.349P0.001

    Note:Compared with pcDNA group,1)P<0.05.

    表9 四組間單擊多靶模型參數(shù)

    Tab.9 Parameters of single-hit multi-target(SHMT)model among four groups

    GroupsD0 (Gy)Dq (Gy)NSF2kSERDMSO2.041 2.249 3.010 0.757 0.490 -LQ1.639 1.482 2.470 0.579 0.610 1.24LQ+pcDNA1.724 0.955 1.740 0.480 0.580 -LQ+ pcDNAWIG12.174 1.592 2.080 0.653 0.460 0.793

    GroupsApoptosis rate(%)DMSO+IR14.84±0.93LQ+IR35.25±1.971)LQ+pcDNA+IR34.24±1.91LQ+ pcDNA-WIG1+IR16.27±1.242)F148.936P0.000

    Note:Compared with DMSO + IR group,1)P<0.05;compared with LQ + pcDNA + IR group,2)P<0.05.

    3 討論

    肺癌發(fā)生發(fā)展與細胞增殖、凋亡失衡密切相關(guān),抗腫瘤藥物可通過促進腫瘤細胞凋亡進而抑制腫瘤惡化進程,同時還可影響腫瘤細胞放療敏感性[8]。放療是腫瘤治療的主要方法之一,其主要作用機理為輻射可通過激活p53誘導(dǎo)的細胞凋亡途徑進而殺傷腫瘤細胞[9,10]。中藥提取物對惡性腫瘤放療敏感性的影響成為腫瘤放射治療的重點研究,但目前關(guān)于LQ與肺癌細胞放療敏感性的關(guān)系研究結(jié)果較少,因此探究LQ與肺癌細胞放療敏感性的關(guān)系可豐富臨床放療方案。

    LQ的主要成分中包含二氫黃酮類成分,可抑制結(jié)腸癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤細胞增殖,還可抑制靜脈內(nèi)皮細胞增殖及遷移[11,12]。本研究結(jié)果顯示不同濃度LQ干預(yù)H1299細胞后可劑量依賴性抑制肺癌細胞增殖并促進細胞凋亡,提示LQ可抑制肺癌細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡。既往研究顯示LQ可通過激活細胞凋亡相關(guān)信號通路進而抑制黑色素瘤、卵巢癌等腫瘤細胞增殖及侵襲[13,14]。分析LQ抑制腫瘤細胞增殖并促使細胞凋亡的機制可能為促進細胞活性氧生成、上調(diào)抑癌基因p53及促凋亡蛋白Bax表達并下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2進而激活線粒體凋亡途徑導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡[15]。由此推測LQ可能通過激活線粒體凋亡途徑進而促進H1299細胞凋亡。張榮芳等[16]研究表明LQ可通過提高鼻咽癌細胞自噬水平進而增強細胞放療敏感性。進一步探究LQ是否可增強肺癌細胞放療敏感性,本研究結(jié)果顯示LQ處理H1299細胞后接受不同X射線照射劑量照射,隨著照射劑量的增加H1299細胞存活分數(shù)明顯降低,LQ處理組H1299細胞存活分數(shù)明顯低于DMSO組、NC組,說明LQ處理組H1299細胞對放射線的敏感性強于DMSO組、NC組H1299細胞。提示LQ處理后可增強肺癌細胞放療敏感性并避免放療抵抗性的發(fā)生。同時采用流式細胞術(shù)檢測肺癌H1299細胞凋亡率,結(jié)果顯示LQ+IR組H1299細胞凋亡率均顯著高于LQ 組、IR組,LQ處理后接受放療的H1299細胞凋亡率明顯升高,說明LQ可提高H1299細胞對放療的敏感性并促進H1299細胞凋亡。提示LQ可能通過促進H1299細胞凋亡進而提高H1299細胞對放療的敏感性。

    WIG-1基因在小細胞肺癌耐藥細胞中表達水平高于敏感細胞,抑制WIG-1基因表達可增強小細胞肺癌細胞敏感性[17]。WIG-1主要依賴p53發(fā)揮作用,正常生理條件下WIG-1呈低表達,WIG-1是p53直接作用靶點,機體受到刺激或創(chuàng)傷時WIG-1表達水平明顯升高并可參與細胞增殖及凋亡等多種生物學(xué)過程[18,19]。然而相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)WIG-1基因高表達可抑制食管癌細胞增殖并促進細胞凋亡,同時可通過抑制ERCC1及P-gp表達進而提高食管癌細胞對化療藥物的敏感性[20]。WIG-1在小細胞肺癌與食管癌發(fā)生及發(fā)展過程中的表達及作用效果不同,其可能與癌細胞種類及作用通路不同有關(guān)。本研究結(jié)果顯示不同濃度LQ處理后均可抑制H1299細胞中WIG-1蛋白表達,隨著作用濃度的增加其抑制作用增強。通過沉默WIG-1表達分析其對肺癌細胞放療敏感性及細胞凋亡的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)放療劑量照射H1299細胞后si-WIG-1組H1299細胞存活分數(shù)顯著低于NC組、si-con組,說明沉默WIG-1表達可增強H1299細胞放療敏感性。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示si-WIG-1+IR組H1299細胞凋亡率顯著高于si-WIG-1組、IR組,說明沉默WIG-1表達后經(jīng)X射線照射可促進H1299細胞凋亡。提示沉默WIG-1可增強肺癌細胞放療敏感性并誘導(dǎo)細胞凋亡。為證實LQ是否通過調(diào)控WIG-1基因發(fā)揮作用,進一步研究發(fā)現(xiàn)pcDNA-WIG1組H1299細胞存活分數(shù)顯著高于LQ+pcDNA組,且增敏比明顯降低,說明WIG1過表達后可降低H1299細胞放療敏感性。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示LQ+ pcDNA-WIG1+IR組H1299細胞凋亡率顯著低于LQ+pcDNA+IR組,說明WIG1過表達與LQ共同處理H1299細胞后經(jīng)照射細胞凋亡率明顯升高。提示過表達WIG-1可逆轉(zhuǎn)LQ對肺癌細胞凋亡及放療敏感性的作用。

    綜上所述,LQ可促進肺癌細胞凋亡及抑制細胞增殖,同時可通過調(diào)控WIG1基因表達進而增強肺癌細胞對放療的敏感性,為臨床治療研究提供理論依據(jù)。但仍需通過動物實驗及臨床檢測驗證LQ對肺癌發(fā)生及發(fā)展的作用。

    猜你喜歡
    存活X射線敏感性
    “X射線”的那些事兒
    實驗室X射線管安全改造
    機電安全(2022年5期)2022-12-13 09:22:26
    虛擬古生物學(xué):當(dāng)化石遇到X射線成像
    科學(xué)(2020年1期)2020-01-06 12:21:34
    病毒在體外能活多久
    愛你(2018年24期)2018-08-16 01:20:42
    病毒在體外能活多久
    釔對Mg-Zn-Y-Zr合金熱裂敏感性影響
    飛利浦在二戰(zhàn)中如何存活
    中國照明(2016年4期)2016-05-17 06:16:18
    AH70DB鋼焊接熱影響區(qū)組織及其冷裂敏感性
    焊接(2016年1期)2016-02-27 12:55:37
    如何培養(yǎng)和提高新聞敏感性
    新聞傳播(2015年8期)2015-07-18 11:08:24
    131I-zaptuzumab對體外培養(yǎng)腫瘤細胞存活的影響

    美女高潮的动态| 内地一区二区视频在线| 一区二区三区免费毛片| 亚洲av熟女| 久久99热这里只有精品18| 深夜a级毛片| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲成av人片在线播放无| 国产精品人妻久久久久久| 日本一本二区三区精品| 婷婷精品国产亚洲av在线| 欧美精品啪啪一区二区三区| 午夜久久久久精精品| 中文字幕免费在线视频6| 最新在线观看一区二区三区| 国内精品久久久久久久电影| 在线看三级毛片| 久久久久国内视频| 中文字幕久久专区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产亚洲欧美98| 欧美xxxx性猛交bbbb| 日韩 亚洲 欧美在线| 午夜激情福利司机影院| 精品无人区乱码1区二区| 精品日产1卡2卡| 国产色爽女视频免费观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 五月伊人婷婷丁香| 少妇丰满av| 日本黄大片高清| 亚洲经典国产精华液单 | 午夜福利高清视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 午夜两性在线视频| 国产极品精品免费视频能看的| 网址你懂的国产日韩在线| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产免费男女视频| 国产精品亚洲美女久久久| 日本黄大片高清| 欧美午夜高清在线| 69av精品久久久久久| 国产亚洲欧美98| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国内揄拍国产精品人妻在线| 欧美性感艳星| 一进一出抽搐动态| 亚洲在线观看片| 黄色日韩在线| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 嫩草影院精品99| 简卡轻食公司| 精品日产1卡2卡| 亚洲男人的天堂狠狠| 夜夜夜夜夜久久久久| 99riav亚洲国产免费| 给我免费播放毛片高清在线观看| 欧美激情在线99| 免费看美女性在线毛片视频| 国产精品精品国产色婷婷| 国产av不卡久久| 性色av乱码一区二区三区2| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产一区二区三区视频了| 欧美乱色亚洲激情| 国产探花在线观看一区二区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 日本黄色视频三级网站网址| 国产探花在线观看一区二区| 日韩大尺度精品在线看网址| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 老司机午夜十八禁免费视频| 黄色视频,在线免费观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 成人欧美大片| 国产日本99.免费观看| 男女视频在线观看网站免费| 精品一区二区免费观看| 欧美最新免费一区二区三区 | 日韩大尺度精品在线看网址| 精品久久久久久成人av| 如何舔出高潮| 婷婷丁香在线五月| 国产久久久一区二区三区| 国产成人啪精品午夜网站| 精品国内亚洲2022精品成人| 中文字幕av在线有码专区| 757午夜福利合集在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 不卡一级毛片| www.色视频.com| 欧美黄色片欧美黄色片| 日日干狠狠操夜夜爽| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 色吧在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 一个人看视频在线观看www免费| 熟女电影av网| 亚洲成人免费电影在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 嫩草影视91久久| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产伦精品一区二区三区视频9| 深夜精品福利| www.999成人在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 日本a在线网址| 亚洲精品久久国产高清桃花| 久久九九热精品免费| 日韩亚洲欧美综合| 在线免费观看不下载黄p国产 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产真实乱freesex| 国产久久久一区二区三区| 国产在线男女| 一个人看视频在线观看www免费| 日韩中文字幕欧美一区二区| 日韩欧美 国产精品| 一a级毛片在线观看| 热99在线观看视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 我要看日韩黄色一级片| 久久久久国内视频| 午夜激情欧美在线| 久久久久精品国产欧美久久久| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 色5月婷婷丁香| 伦理电影大哥的女人| 久久国产精品影院| 一进一出抽搐gif免费好疼| 午夜福利18| 成年女人永久免费观看视频| 日韩亚洲欧美综合| 两人在一起打扑克的视频| 日本黄色片子视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 欧美最黄视频在线播放免费| 免费看光身美女| 人人妻人人澡欧美一区二区| 波多野结衣高清作品| 亚洲人与动物交配视频| 欧美不卡视频在线免费观看| 哪里可以看免费的av片| 久久草成人影院| 国产黄片美女视频| 九色成人免费人妻av| 99热6这里只有精品| 亚洲在线自拍视频| 亚洲第一区二区三区不卡| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲一区高清亚洲精品| 欧美日韩黄片免| 90打野战视频偷拍视频| 成人亚洲精品av一区二区| 久久国产精品影院| 国产一区二区在线av高清观看| 日本黄色片子视频| 动漫黄色视频在线观看| а√天堂www在线а√下载| 国产在视频线在精品| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲人成网站在线播| 动漫黄色视频在线观看| 超碰av人人做人人爽久久| 日韩欧美在线二视频| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产成人啪精品午夜网站| 国内精品美女久久久久久| 我要看日韩黄色一级片| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲电影在线观看av| 国产三级黄色录像| 黄色丝袜av网址大全| 国产高潮美女av| 国产精品女同一区二区软件 | 少妇高潮的动态图| 国产伦精品一区二区三区视频9| 最近在线观看免费完整版| 久久久久久久久久成人| 高清日韩中文字幕在线| 又爽又黄无遮挡网站| 中文亚洲av片在线观看爽| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲av不卡在线观看| 在线天堂最新版资源| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产精品久久电影中文字幕| 成人av一区二区三区在线看| 欧美日韩乱码在线| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲美女黄片视频| 国模一区二区三区四区视频| 免费一级毛片在线播放高清视频| 最新中文字幕久久久久| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 伦理电影大哥的女人| 哪里可以看免费的av片| 久久伊人香网站| 悠悠久久av| 51午夜福利影视在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产极品精品免费视频能看的| 俄罗斯特黄特色一大片| 99热精品在线国产| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 一级黄片播放器| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久人人爽人人爽人人片va | 老熟妇仑乱视频hdxx| 天美传媒精品一区二区| 真人做人爱边吃奶动态| 久久精品国产清高在天天线| 俺也久久电影网| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲精华国产精华精| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 精品人妻熟女av久视频| 中文字幕久久专区| 一区二区三区高清视频在线| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 午夜精品在线福利| 99热这里只有是精品50| 亚洲电影在线观看av| 丰满人妻一区二区三区视频av| 夜夜爽天天搞| 午夜福利成人在线免费观看| 精品欧美国产一区二区三| 男女之事视频高清在线观看| 国产成人av教育| 国产亚洲精品av在线| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产精品一及| 免费搜索国产男女视频| 内地一区二区视频在线| 亚洲经典国产精华液单 | 最近视频中文字幕2019在线8| 我要看日韩黄色一级片| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产精品久久视频播放| 亚洲一区高清亚洲精品| 成人精品一区二区免费| 国内精品美女久久久久久| 色噜噜av男人的天堂激情| 我要搜黄色片| 美女高潮的动态| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲乱码一区二区免费版| 深爱激情五月婷婷| 亚洲一区高清亚洲精品| 免费av观看视频| 午夜a级毛片| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久久精品欧美日韩精品| 性欧美人与动物交配| 婷婷亚洲欧美| 精品久久久久久,| 一二三四社区在线视频社区8| bbb黄色大片| 亚洲一区二区三区不卡视频| 日韩精品青青久久久久久| 九九热线精品视视频播放| 乱人视频在线观看| 欧美最新免费一区二区三区 | 热99在线观看视频| 午夜老司机福利剧场| 亚洲自偷自拍三级| 69人妻影院| 亚洲欧美激情综合另类| 国产精品电影一区二区三区| 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲av电影在线进入| 日韩有码中文字幕| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲中文字幕日韩| 国产精品伦人一区二区| 国产亚洲精品av在线| 91av网一区二区| 久久亚洲真实| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 国产真实伦视频高清在线观看 | 日韩欧美免费精品| 亚洲精品456在线播放app | 欧美三级亚洲精品| 变态另类丝袜制服| 欧美另类亚洲清纯唯美| 老司机深夜福利视频在线观看| 在线免费观看的www视频| 亚洲国产色片| 中文字幕av在线有码专区| 永久网站在线| 天美传媒精品一区二区| 直男gayav资源| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久久久性生活片| 在线观看66精品国产| 很黄的视频免费| 日韩精品中文字幕看吧| 久久精品综合一区二区三区| 午夜激情福利司机影院| 91在线观看av| 草草在线视频免费看| bbb黄色大片| 亚洲无线观看免费| 99久久精品热视频| 亚洲五月婷婷丁香| 免费人成在线观看视频色| 国产野战对白在线观看| 欧美黑人巨大hd| 欧美一级a爱片免费观看看| 波多野结衣高清无吗| 高清毛片免费观看视频网站| a级一级毛片免费在线观看| av中文乱码字幕在线| 中亚洲国语对白在线视频| av在线老鸭窝| 亚洲美女黄片视频| 一级作爱视频免费观看| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 哪里可以看免费的av片| 91麻豆av在线| 99热精品在线国产| 最新中文字幕久久久久| 一本一本综合久久| 内射极品少妇av片p| www.999成人在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲av美国av| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 色哟哟·www| 99久久成人亚洲精品观看| 大型黄色视频在线免费观看| АⅤ资源中文在线天堂| 三级毛片av免费| 国内精品一区二区在线观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 日韩欧美国产在线观看| av中文乱码字幕在线| 毛片一级片免费看久久久久 | 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲精品在线美女| 最近中文字幕高清免费大全6 | 夜夜夜夜夜久久久久| 久久久久久久久久成人| 热99在线观看视频| 简卡轻食公司| 身体一侧抽搐| av女优亚洲男人天堂| 不卡一级毛片| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美日韩黄片免| 美女cb高潮喷水在线观看| 欧美日韩综合久久久久久 | 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 成人一区二区视频在线观看| 精品国产三级普通话版| 成年人黄色毛片网站| 伦理电影大哥的女人| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲精品久久国产高清桃花| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产真实乱freesex| 日本成人三级电影网站| 精品乱码久久久久久99久播| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲国产精品成人综合色| 欧美乱色亚洲激情| 乱人视频在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 少妇丰满av| 国产中年淑女户外野战色| 欧美日韩黄片免| 亚洲精华国产精华精| 亚洲无线观看免费| 亚洲国产欧美人成| 天堂网av新在线| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 亚洲国产色片| 在线观看免费视频日本深夜| 最近中文字幕高清免费大全6 | 欧美成人a在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| www.999成人在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 婷婷精品国产亚洲av在线| www.www免费av| 国产精品人妻久久久久久| 无遮挡黄片免费观看| 国产成人影院久久av| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 俺也久久电影网| 亚洲最大成人中文| 亚洲自偷自拍三级| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 欧美日韩乱码在线| 欧美日本视频| www.999成人在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 毛片女人毛片| 一级黄色大片毛片| 免费人成视频x8x8入口观看| 成人精品一区二区免费| 天堂√8在线中文| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 波多野结衣高清无吗| 亚洲最大成人手机在线| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 色哟哟·www| av黄色大香蕉| 久久这里只有精品中国| 能在线免费观看的黄片| 在线国产一区二区在线| 美女黄网站色视频| 欧美黑人巨大hd| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 69人妻影院| 色综合婷婷激情| 男人舔女人下体高潮全视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 色精品久久人妻99蜜桃| 国语自产精品视频在线第100页| 久久精品综合一区二区三区| 日本一本二区三区精品| av欧美777| 色视频www国产| 日韩免费av在线播放| 精品久久久久久久末码| 色综合婷婷激情| 又爽又黄无遮挡网站| 欧美三级亚洲精品| 中国美女看黄片| h日本视频在线播放| 亚洲av五月六月丁香网| 我的女老师完整版在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| av中文乱码字幕在线| 精品一区二区三区视频在线| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久久人妻av系列| www日本黄色视频网| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产视频一区二区在线看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 天天一区二区日本电影三级| 日韩欧美免费精品| 国产午夜精品论理片| 亚洲av电影在线进入| 国产精品电影一区二区三区| 五月玫瑰六月丁香| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 青草久久国产| 亚洲av二区三区四区| 亚洲av电影在线进入| 成人欧美大片| 亚洲av美国av| 首页视频小说图片口味搜索| 久久欧美精品欧美久久欧美| 18美女黄网站色大片免费观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 99国产综合亚洲精品| a级一级毛片免费在线观看| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产精品久久久久久久久免 | 村上凉子中文字幕在线| 免费在线观看亚洲国产| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久久久久九九精品二区国产| 青草久久国产| 午夜两性在线视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| a级毛片a级免费在线| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 美女黄网站色视频| 午夜久久久久精精品| 久久中文看片网| 国产在线男女| 成人午夜高清在线视频| 国产极品精品免费视频能看的| aaaaa片日本免费| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 99热精品在线国产| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲电影在线观看av| 亚洲欧美激情综合另类| 国产精品久久久久久精品电影| 国产精品野战在线观看| 欧美在线一区亚洲| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧美又色又爽又黄视频| 免费在线观看亚洲国产| av天堂在线播放| 无人区码免费观看不卡| 我的老师免费观看完整版| 在现免费观看毛片| 国产黄片美女视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 国产精品三级大全| 国产av麻豆久久久久久久| 国产伦人伦偷精品视频| 精品国产亚洲在线| 国产单亲对白刺激| 国产精品免费一区二区三区在线| 中文资源天堂在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 嫩草影视91久久| 日本三级黄在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产真实伦视频高清在线观看 | 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产69精品久久久久777片| 久久精品国产清高在天天线| 国产亚洲精品av在线| 国模一区二区三区四区视频| 神马国产精品三级电影在线观看| 日韩欧美在线二视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲av五月六月丁香网| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产伦精品一区二区三区视频9| 真人做人爱边吃奶动态| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲 国产 在线| 日本在线视频免费播放| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 欧美日韩综合久久久久久 | 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 欧美一区二区国产精品久久精品| 伊人久久精品亚洲午夜| 麻豆成人午夜福利视频| 午夜a级毛片| 波多野结衣巨乳人妻| 午夜福利在线观看吧| 国产三级中文精品| 午夜久久久久精精品| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 亚洲人成伊人成综合网2020| 高清日韩中文字幕在线| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲最大成人手机在线| www日本黄色视频网| 国产精品野战在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲精品在线观看二区| 国产 一区 欧美 日韩| 俄罗斯特黄特色一大片| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 极品教师在线视频| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲经典国产精华液单 | 草草在线视频免费看| netflix在线观看网站| 国产成人影院久久av| 日韩成人在线观看一区二区三区| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 丝袜美腿在线中文| 神马国产精品三级电影在线观看| 久久人妻av系列| 91在线精品国自产拍蜜月| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 色尼玛亚洲综合影院| av在线天堂中文字幕| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 婷婷丁香在线五月| 成人特级av手机在线观看| 久久香蕉精品热| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 少妇的逼好多水| 国产黄片美女视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 长腿黑丝高跟| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产亚洲欧美98| 国产av不卡久久| 亚洲色图av天堂| 国产视频内射| 十八禁网站免费在线| 国产黄片美女视频| 成年免费大片在线观看| 哪里可以看免费的av片| 亚洲专区国产一区二区| 女人被狂操c到高潮| 有码 亚洲区| 九九在线视频观看精品| 亚洲欧美精品综合久久99| 九九热线精品视视频播放| 动漫黄色视频在线观看| 国产精品久久电影中文字幕|