HSPA12B對Aβ1-42誘導(dǎo)PC12細(xì)胞tau蛋白磷酸化的影響①

王 萍

(紹興市人民醫(yī)院，紹興 312000)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種以老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)為主要病理特征的神經(jīng)退行性疾病[1]。淀粉樣β蛋白(amyloid β-protein，Aβ)的聚集誘導(dǎo)神經(jīng)毒性、tau蛋白磷酸化和神經(jīng)元凋亡[2,3]。因此，任何一種能降低Aβ誘導(dǎo)tau磷酸化的蛋白，都可能成為治療和預(yù)防AD的新靶點。熱休克蛋白A12B (heat shock protein A12B,HSPA12B)是HSP70家族的新成員[4]。HSPA12B在腦中高表達(dá)，與腦的發(fā)育過程密切相關(guān)[5]。研究報道，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)應(yīng)激過程中，HSPA12B發(fā)揮保護(hù)作用，可抑制缺血性腦損傷引起的神經(jīng)元凋亡，改善缺血引起的神經(jīng)功能障礙，維持血腦屏障通透性，敲除HSPA12B可顯著上調(diào)神經(jīng)元中活化的caspase-3表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡[6-8]。AD病程中神經(jīng)元的凋亡主要通過激活caspase-3途徑，caspase-3能直接和特異地調(diào)節(jié)tau蛋白磷酸化[9,10]。本實驗選用Aβ1-42誘導(dǎo)PC12細(xì)胞，模擬AD病程中神經(jīng)元損傷模型，觀察HSPA12B對AD的重要病理改變tau蛋白磷酸化的影響，以期為AD的預(yù)防治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料 PC12細(xì)胞購自American Type Culture Collection；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;胰蛋白酶購自美國HyClone公司；Aβ1-42購自上海圣翔生物科技有限公司；Lipofectamine3000、OptiMEM 購自美國Invitrogen公司； HSPA12B多克隆抗體(美國Sigma 公司，HPA13659-100UL,R04942)；phosphor-Tau (pS396，p-tau，32275,F2807)； total-Tau (t-tau，sc-58860,L2315)購自美國Santa cruz公司；β-actin(杭州達(dá)文生物有限公司，DW9562,1508)。大鼠HSPA12B和陰性對照siRNA(NC)的siRNAs購自廣州銳博。CLAS100型細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；電泳儀、蛋白印跡檢測系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞分組培養(yǎng) PC12細(xì)胞加入DMEM培養(yǎng)基(含100 U/ml青毒素、10 μg/ml鏈霉素、10 mmol L-谷氨酰胺及10%小牛血清)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)到80%融合時換成無血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后進(jìn)行實驗。將處于對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞隨機分為4組：空白對照組、DMSO對照組、Aβ單一刺激組(取Aβ1-42終濃度為20 μmol/L刺激后繼續(xù)培養(yǎng)12 h)、Aβ刺激HSPA12B-siRNA組。

1.2.2Western blot 常規(guī)提取各組細(xì)胞總蛋白，采用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。一抗為兔抗HSPA12B多克隆抗體；小鼠抗p-tau、t-tau、β-actin抗體，二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔及山羊抗小鼠抗體。用ECL(pierce)進(jìn)行檢測，柯達(dá)膠片曝光顯影。以β-actin為內(nèi)參，目的蛋白與β-actin的灰度比值代表蛋白表達(dá)水平，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3HSPA12B干擾和過表達(dá)轉(zhuǎn)染 HSPA12B特異siRNAs靶序列為：Si1 (5′-GGCTTCCTTCTCTGTG-GTT-3′)、Si2(5′-GGGTGGACCTGGCCTTTGA-3′)和Si3(5′-GCGGCCCTTATGGTGCAGT-3′)。按照脂質(zhì)體Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染要求轉(zhuǎn)染HSPA12B-siRNAs和過表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h后，用轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.4觀察指標(biāo) 觀察并比較Aβ組、Aβ+HSPA12B-siRNA組、normal組、DMSO組PC12細(xì)胞內(nèi)HSPA12B、p-tau及t-tau蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中tau蛋白磷酸化 用Aβ1-42(20 μmol/L)處理PC12細(xì)胞12 h，檢測tau蛋白的表達(dá)和磷酸化。與normal組相比，Aβ誘導(dǎo)p-tau差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而tau的總表達(dá)(t-tau)保持不變，0.5% DMSO組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05,圖1)。

2.2Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中HSPA12B的表達(dá) 用20 μmol/L Aβ1-42處理12 h后，與normal組相比，HSPA12B表達(dá)顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；0.5%DMSO組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖2)。

2.3沉默HSPA12B增強Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中tau蛋白磷酸化 為了降低PC12細(xì)胞中HSPA12B的表達(dá)，Western blot檢測了3條特異的HSPA12B siRNAs (Si1、Si2和Si3)和一條陰性的siRNA(NC)干擾效率。PC12細(xì)胞內(nèi)分別轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol/L 的HSPA12B-siRNAs和NC，48 h后，檢測結(jié)果顯示： Si3顯著下調(diào)HSPA12B蛋白表達(dá)，干擾效率達(dá)70%；Si2次之達(dá)57%；Si1的效率僅有35%；而NC組與normal組無統(tǒng)計學(xué)差異(圖3A)。因此，選取干擾效率最佳的Si3進(jìn)行后續(xù)實驗。HSPA12B-Si3沉默可部分消除Aβ1-42誘導(dǎo)的HSPA12B表達(dá)(圖3B)，并顯著增加了tau蛋白磷酸化(圖3B)。這提示HSPA12B可能在Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞tau磷酸化中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

圖1 Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中tau蛋白磷酸化水平比較Fig.1 Aβ-induced tau phosphorylation in PC12 cellsNote: *.P<0.05,vs normal.

圖2 Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中HSPA12B蛋白水平比較Fig.2 Aβ-induced HSPA12B expression in PC12 cellsNote: *.P<0.05,vs normal.

圖3 HSPA12B基因沉默增強Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中tau磷酸化蛋白水平Fig.3 Knockdown HSPA12B expression in PC12 cells efficiency increased tau phosphorylation induced by AβNote: A.Effect of silencing HSPA12B protein in PC12 cells；B.HSPA12B-Si3 silencing significantly blocked Aβ mediated up-regulation of HSPA12B expression in PC12 cells,and Aβ-induced tau phosphorylation was significantly increased than that of Aβ group. &.P<0.05，vs the normal cells；*.P<0.05，vs the NC cells；#.P<0.05，vs Aβ-treated PC12 cells.

3 討論

AD是老年人最常見的神經(jīng)退變性疾病，過度磷酸化的tau蛋白在AD中更容易聚集，因此如何降低tau蛋白有望成為AD治療的途徑。本研究探討了HSPA12B在Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞tau蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)作用。Aβ1-4220 μmol/L作用12 h后，HSPA12B表達(dá)增加；同時tau蛋白磷酸化水平增強。提示HSPA12B可通過抑制tau蛋白磷酸化對Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞所致的神經(jīng)毒性過程中起保護(hù)作用。

Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性伴隨著興奮性毒性、促炎癥反應(yīng)和促凋亡性事件以及氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激本身既介導(dǎo)直接神經(jīng)毒性作用，也介導(dǎo)間接tau蛋白過度磷酸化[11,12]。研究表明，Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用主要是通過激活皮層神經(jīng)元和海馬神經(jīng)元中tau蛋白磷酸化的升高來實現(xiàn)[13,14]。尤其在PC12細(xì)胞中，tau磷酸化水平的升高被認(rèn)為是Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性機制之一[15]。因此，阻斷tau蛋白磷酸化可作為對Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的保護(hù)作用。熱休克蛋白70 (HSP70)具有防止β淀粉樣蛋白/tau蛋白聚集的能力，使其成為潛在的藥物靶點[16]。HSPA12B 是最近發(fā)現(xiàn)的HSP70 家族的新成員，在CNS的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞都有表達(dá)[17]。文獻(xiàn)報道了過表達(dá)HSPA12B，能顯著縮小MCAO引起的腦梗死面積，顯著減輕海馬神經(jīng)元損傷[18]。在缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中敲除HSPA12B可明顯上調(diào)活性caspase-3活性，提示HSPA12B在PC12細(xì)胞凋亡中起重要作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，Aβ可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞tau蛋白的過度磷酸化，同時HSPA12B的表達(dá)顯著增強。誘導(dǎo)型HSP家庭成員在應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮保護(hù)作用的標(biāo)志之一就是表達(dá)增強。敲除HSPA12B顯著增強了PC12細(xì)胞tau蛋白的磷酸化。提示Aβ誘導(dǎo)的tau蛋白過度磷酸化受HSPA12B的影響，HSPA12B在PC12細(xì)胞中發(fā)揮抗Aβ的神經(jīng)保護(hù)作用，為AD治療提供新的干預(yù)靶點。