茵陳浸提物抑制尿素酶活性提取工藝優(yōu)化

趙興壇, 崔雪微, 張 全, 閆 梅, 王旖旎, 張孝林

(安徽科技學(xué)院 生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

幽門螺桿菌是一種革蘭氏陰性桿菌，世界上約有50%以上的人口感染該菌，幽門螺桿菌感染患者易發(fā)生胃炎、十二指腸和胃潰瘍等疾病[1]。世界衛(wèi)生組織已確定幽門螺桿菌為Ⅰ類致癌原。相關(guān)研究證實，幽門螺桿菌感染者其患胃癌風(fēng)險明顯升高[2]?，F(xiàn)在治療幽門螺桿菌感染采用的主要方法是利用一種質(zhì)子泵結(jié)合兩種抗生素的“三聯(lián)”療法，有一定的治療效果。但抗生素治療存在病人需口服大劑量抗生素和較長的治療周期，這些導(dǎo)致治療副作用大，病人的依從性比較差[3]。特別是隨著幽門螺桿菌對抗生素耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，用抗生素根治幽門螺桿菌其根治率越來越低，這已成為幽門螺桿菌感染康復(fù)治療的重大醫(yī)學(xué)難題[4]。因此，尋求一種新的治療手段治療幽門螺桿菌感染將具有重大的醫(yī)學(xué)價值和社會價值。幽門螺桿菌定植在胃黏膜中，其生存的環(huán)境是呈現(xiàn)強(qiáng)酸性的，研究發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌能存活在胃黏膜酸性環(huán)境中與幽門螺桿菌具有強(qiáng)的尿素酶活性相關(guān)，幽門螺桿菌的尿素酶蛋白占總蛋白達(dá)到6%～10%[5]。幽門螺桿菌利用尿素酶分解尿素釋放氨氣，在幽門螺桿菌的周圍形成氨云，使其存活的環(huán)境呈弱堿性[6]。幽門螺桿菌一旦失去尿素酶活性，處在酸性環(huán)境中，幽門螺桿菌是不能存活的。同時，幽門螺桿菌的尿素酶存在于細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞表面，是幽門螺桿菌的毒力因子，在幽門螺桿菌定植于胃黏膜中發(fā)揮著重要作用。因此，發(fā)現(xiàn)一種尿素酶抑制劑使幽門螺桿菌的尿素酶喪失活性，幽門螺桿菌將不但喪失產(chǎn)生存活所需的弱堿性環(huán)境，而且幽門螺桿菌也失去其在胃黏膜定植的能力，進(jìn)而達(dá)到根除幽門螺桿菌在胃中定植的作用。研究發(fā)現(xiàn)一些植物含有的活性成分具有很強(qiáng)的尿素酶抑制作用[7]。前期對一些中藥的浸提物抑制尿素酶活性進(jìn)行篩選研究，發(fā)現(xiàn)茵陳浸提物對尿素酶活性具有較強(qiáng)的抑制作用。同時發(fā)現(xiàn)植物的活性成分的提取與多種因素有關(guān)，其中影響最大的因素是料液比、浸提溫度和浸提時間。本研究對這三因素從單因素考察后，設(shè)計正交試驗確立茵陳的浸提物抑制尿素酶活性的最佳工藝條件，為進(jìn)一步把茵陳開發(fā)成用于防治幽門螺桿菌感染提供理論依據(jù)和技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茵陳(ArtemisiacapillarisThunb)購于鳳陽華佗大藥房(經(jīng)安徽科技學(xué)院藥學(xué)系毛斌斌老師鑒定為正品)；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、苯酚、次氯酸鈉、硝普鈉、尿素(AR)、刀豆尿素酶等試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)有限公司；試驗用水為蒸餾水。

1.2 儀器

HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；FA21048電子天平(上海市精密科學(xué)儀器總廠)；SpectraMax190型酶標(biāo)儀(美國MD全波長酶標(biāo)儀)；真空冷凍干燥機(jī)(德國Martin Christ公司)。

1.3 方法

1.3.1 正交試驗考察的因素的確定 茵陳浸提物對抑制尿素酶活性有較大影響的浸提因素主要是浸提溫度、浸提時間和料液比。本研究以茵陳浸提物對尿素酶活性抑制率為指標(biāo)，以上述3因素為考察對象，設(shè)計正交試驗，確立茵陳浸提物影響抑制尿素酶活性的最佳浸提工藝條件。

1.3.2 茵陳浸提物對尿素酶活性的抑制作用——靛酚藍(lán)法 尿素酶活性的檢測主要利用尿素酶具有催化尿素生成氨的作用，檢測生成氨的量就可知道尿素酶的活性。氨在弱堿性溶液中能與次氯酸鈉發(fā)生反應(yīng)生成氯胺，氯銨在硝普鈉作為催化劑情況下與酚作用生成靛酚藍(lán)，靛酚藍(lán)的最大吸收波長是在625 nm處。本研究根據(jù)文獻(xiàn)[8]測定浸提物對尿素酶活性的抑制率：

(1)溶液的配置：① 50 mM磷酸鉀緩沖液配制：KH2PO41.701 5 g溶于100 mL去離子水中；K2HPO42.177 5 g溶于100 mL去離子水中；兩溶液混合后定容至1 000 mL；②溶液A的配制：0.5 g苯酚，2.5 mg硝普鈉溶于45 mL緩沖液中，定容至50 mL；③溶液B的配制：0.25 g NaOH 0.42 mL 5%次氯酸鈉 溶于45 mL緩沖液中，定容至50 mL；④ 300 mM尿素溶液的制備：1.8 g尿素溶于90 mL緩沖液，再定容至100 mL。

(2)1 mL反應(yīng)體系組成和抑制率測量：①在1.5 mL的離心管中分別加入茵陳浸提物0.1 mL和生理鹽水0.1 mL(作為對照)然后再分別加入20 IU/mL尿素酶貯備液 0.05 mL，最終尿素酶在1 mL反應(yīng)體系濃度為1 IU/mL；小心混勻后在37 ℃ 溫浴10 min；②分別加入溶液A： 0.25 mL， 溶液B：0.25 mL；③分別加入300 mM尿素貯備液0.1 mL，最終尿素的最終濃度為30 mM，每個試管加入緩沖液0.25 mL，小心混勻后在37 ℃ 溫浴30 min。分別取0.2 mL至96孔酶標(biāo)板，每個樣品作3個平行，在630 nm處檢測吸光度值后求平均值。對照組為Ao，樣品茵陳浸提液組為A。

茵陳浸提液對尿素酶活性的抑制率按下列公式計算：

抑制率(%)=(Ao-A)/Ao×100%

1.3.3 茵陳浸提物對尿素酶活性抑制作用的單因素考察

1.3.3.1 影響浸提物抑制尿素酶活性的溫度試驗 稱取2 g茵陳分別加入5個錐形瓶，再向錐形瓶中加入42 mL去離子水(料液比1∶21)，水浴溫度依次為50、60、70、80、90 ℃，提取時間100 min，浸提物進(jìn)行抽濾，把濾液真空冷凍干燥，用10 mL去離子水進(jìn)行稀釋配置溶液，進(jìn)行茵陳浸提物對尿素酶活性抑制率檢測。

1.3.3.2 提物抑制尿素酶活性的浸提時間試驗 稱取2 g茵陳分別加入5個錐形瓶，向5個錐形瓶中加入42 mL去離子水(料液比1∶21)，浸提溫度80 ℃，浸提時間為60、80、100、120、140 min，浸提物進(jìn)行抽濾，把濾液真空冷凍干燥，用10 mL的去離子水進(jìn)行稀釋配置溶液，進(jìn)行茵陳浸提物對尿素酶活性抑制率檢測。

1.3.3.3 影響浸提物抑制尿素酶活性的料液比試驗 稱取2 g茵陳分別加入5個錐形瓶，向5個錐形瓶中分別加入30、36、42、48、54 mL去離子水，相當(dāng)于料液比1∶15、1∶18、1∶21、1∶24、1∶27，浸提溫度為80 ℃，浸提時間100 min, 浸提物進(jìn)行抽濾，把濾液真空冷凍干燥，用10 mL的去離子水進(jìn)行稀釋配置溶液，進(jìn)行茵陳浸提物對尿素酶活性抑制率檢測。

1.3.4 正交試驗設(shè)計 依據(jù)1.3.3節(jié)單因素試驗結(jié)果，選取3個茵陳浸提物對尿素酶活性較好抑制率的浸提條件，確立單因素合適的三水平，設(shè)計三因素三水平正交試驗獲得茵陳浸提物對尿素酶活性抑制率最大的浸提工藝條件。因素水平如表1所示,正交試驗結(jié)果如表2所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗的結(jié)果

2.1.1 溫度對浸提物抑制尿素酶活性的影響 溫度對浸提物抑制尿素酶活性的影響如圖1所示。浸提溫度從50 ℃到80 ℃時隨著浸提溫度的升高時，茵陳浸提物抑制尿素酶活性逐漸增大，當(dāng)浸提溫度從80 ℃到90 ℃時，茵陳浸提物抑制尿素酶活性沒有增大反而有所下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是，開始隨著溫度的不斷升高有利于活性成分從茵陳中浸出，但茵陳浸提物抑制尿素酶活性的成分對高溫存在敏感性，當(dāng)溫度過高時，造成浸提物中抑制尿素酶活性成分被破壞。因此，茵陳浸提時浸提溫度不宜太高，確定80 ℃為茵陳的最佳浸提溫度。

圖1 溫度對浸提物抑制尿素酶活性的影響

圖2 時間對浸提物抑制尿素酶活性的影響

2.1.2 浸提時間對浸提物抑制尿素酶活性的影響 浸提時間對浸提物抑制尿素酶活性的影響如圖2所示。浸提時間從60～100 min時隨著浸提時間的延長浸提物對尿素酶活性逐漸增大，當(dāng)浸提時間從100～140 min繼續(xù)增加時，獲得的茵陳浸提物抑制尿素酶活性不但沒有增大反而有所下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是，開始隨著浸提時間延長有利于茵陳抑制尿素酶活性成分從茵陳中浸出，在浸提100 min時活性成分已基本浸出，如果再繼續(xù)延長浸提時間，已浸出的茵陳活性成分在較高浸提溫度下被破壞。這也進(jìn)一步證實上述隨著浸提溫度升高到80 ℃后，茵陳浸提物抑制尿素酶活性不升反降，對茵陳抑制尿素酶活性成分熱不穩(wěn)定性我們將做進(jìn)一步研究。因此，茵陳浸提物具有較好抑制尿素酶活性的浸提時間確定為100 min。

2.1.3 料液比對浸提物抑制尿素酶活性的影響 料液比對浸提物抑制尿素酶活性的影響如圖3所示。浸提時間從1∶15到1∶27提取溶劑的量增加幾乎1倍。從圖3可以看出從1∶15到1∶21時，隨著料液比的增加浸提物對尿素酶活性逐漸增大，當(dāng)料液比從1∶21到1∶27時，茵陳浸提物抑制尿素酶活性并沒有繼續(xù)增大。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是，開始隨著料液比的增加有利于抑制尿素酶活性成分從茵陳中浸出，當(dāng)料液比也就是提取溶劑繼續(xù)增大時，因抑制尿素酶活性成分已基本從茵陳中浸出，再繼續(xù)增大溶劑劑量時，濃縮獲得相同體積的茵陳浸提物對尿素酶活性的抑制率不再繼續(xù)增大。考慮浸提物濃縮需蒸發(fā)，溶劑量越多蒸發(fā)消耗的能源越多，成本越高，因此，當(dāng)料液比為1∶21時，獲得茵陳浸提物不但具有較好抑制尿素酶活性，而且具有很好的經(jīng)濟(jì)性。

圖3 料液比對浸提物抑制尿素酶活性的影響

2.2 正交試驗因素與水平的確立及正交試驗結(jié)果

2.2.1 正交試驗因素和水平確立 根據(jù)單因素獲得抑制尿素酶活性的浸提因素的浸提條件，設(shè)計下列正交試驗各因素水平如表1所示:

表1 正交試驗各因素水平

2.2.2 正交試驗結(jié)果 按照1.3.2試驗方法和單因素試驗結(jié)果確立的三因素和三水平進(jìn)行正交試驗，測得茵陳浸提物對尿素酶活性的抑制率結(jié)果如表2所示。根據(jù)表2對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，3個因素的極差R可知：茵陳浸提物對尿素酶活性抑制率在三因素中，浸提溫度A因素影響最大，其次是浸提物料液比B因素影響較大，浸提時間C因素在影響浸提物抑制尿素酶活性中最小。茵陳浸提物對尿素酶活性的抑制率的最佳浸提條件組合是A2、B2、C3，即浸提溫度80 ℃，浸提時間100 min及料液比為1∶24的浸提條件下所獲得的茵陳浸提物對尿素酶活性的抑制率最大。浸提最佳組合條件A2、B2、C3存在于正交試驗表中，茵陳浸提物對尿素酶活性的抑制率可達(dá)到85.67%，說明茵陳浸提物對尿素酶活性有較好的抑制功能。進(jìn)一步進(jìn)行方差分析結(jié)果如表3所示：F0.10(2,2)=9，F(xiàn)0.05(2,2)=19，F(xiàn)0.01(2,2)=99，所以，A因素的F>F0.05，具有顯著性，B、C因素不具顯著性。說明A因素浸提溫度對茵陳浸提物抑制尿素酶活性具有顯著意義，且非常重要與極差分析具有一致性。

表2 方差分析

表3 抑制率正交試驗結(jié)果

3 結(jié)論與討論

相關(guān)研究證實抑制幽門螺桿菌尿素酶活性可殺滅幽門螺桿菌在胃中的定植[8]，尋找一種天然活性成分對尿素酶活性的作用[8]，以期探究一種新的防治幽門螺桿菌在胃中定植的新方法具有重要的價值?，F(xiàn)有的抗生素治療幽門螺桿菌時，幽門螺桿已產(chǎn)生了耐藥性，使抗生素治療幽門螺桿菌的根除率逐漸降低。另外，抗生素治療為了達(dá)到理想的治療效果，加大用藥劑量和延長用藥周期，這不但增加了用藥成本，也使抗生素對人體的副作用進(jìn)一步增大。茵陳是一種常見的中草藥，茵陳具有多種生理學(xué)功能[9]。臨床主要用于治療黃疸、肝炎、慢性肝病、膽囊炎等肝膽疾患。在治療肝病的方劑中茵陳使用劑量較大可達(dá)到六兩,約82.8 g，說明茵陳臨床應(yīng)用比較安全[10]。

本研究在尿素酶活性抑制作用試驗采用的是更加靈敏的靛酚藍(lán)法，而不是傳統(tǒng)的酚紅試驗方法。研究發(fā)現(xiàn)，茵陳浸提物對尿素酶活性有非常強(qiáng)的抑制作用，實驗同時證實，茵陳浸提物的抑制尿素酶活性雖然受浸提溫度、浸提時間和料液比都有影響，但浸提溫度影響最大，其次是料液比，可能是抑制尿素酶活性的茵陳浸提物活性成分對高溫存在敏感性，這是很多中藥活性成分通常存在的共性。本研究只是對具抑制尿素酶活性茵陳浸提物進(jìn)行初步的研究，對具抑制尿素酶活性的茵陳浸提物具體成分還有待進(jìn)一步深入研究。