他克莫司對(duì)阿霉素腎病大鼠足細(xì)胞損傷的修復(fù)作用

陳財(cái)銘 李藝蝦 林佳群 萬(wàn)建新

350005 福州，福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科

腎小球?yàn)V過(guò)屏障由內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球基底膜和臟層上皮細(xì)胞(足細(xì)胞)組成，其中足細(xì)胞的作用至關(guān)重要。有研究表明蛋白尿與足細(xì)胞受損密切相關(guān)[1]。本文建立以足細(xì)胞損傷為主的阿霉素腎病模型，用新型免疫抑制劑他克莫司進(jìn)行干預(yù)處理，探討他克莫司對(duì)足細(xì)胞損傷的修復(fù)作用，從而為足細(xì)胞病治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

清潔級(jí)雄性SD大鼠，2月齡，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，喂養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境。阿霉素(深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè))，他克莫司(安斯泰來(lái)制藥有限公司)，TUNEL試劑盒(羅氏公司)，兔抗WT-1多克隆一抗(Abcam公司)，兔抗nephrin多克隆一抗(Abcam公司)，兔抗p38多克隆一抗(Santa cruz公司)，兔抗caspase-3多克隆一抗(Merk Millipore公司)，山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金橋公司)，山羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(北京中杉金橋公司)，Alexa Fluor594標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)。

二、方法

1.分組 健康雄性SD大鼠，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，普通光照，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周。將24只SD大鼠隨機(jī)分成3組(每組各8只)。對(duì)照組：不進(jìn)行阿霉素尾靜脈注射，也不給予他克莫司灌胃處理，僅以等量生理鹽水尾靜脈注射和灌胃；模型組：于實(shí)驗(yàn)第1天尾靜脈注射阿霉素4 mg/kg，間隔1周，即第7天給予第二次尾靜脈注射阿霉素3.5 mg/kg，并以等量生理鹽水灌胃；他克莫司組：與模型組相同的方法進(jìn)行阿霉素尾靜脈注射，并在第一次尾靜脈注射阿霉素后同日給予他克莫司進(jìn)行灌胃，劑量為0.5 mg·kg-1·d-1。

2.標(biāo)本收集 尿液收集：將大鼠置于代謝籠中，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，后分別于實(shí)驗(yàn)第0、7、14、21、28、35天通過(guò)代謝籠收集大鼠24 h尿液，加入防腐劑后保存于-80℃待統(tǒng)一送檢。

腎臟標(biāo)本收集：于造模第35天收集腎臟標(biāo)本。大鼠麻醉后，打開(kāi)腹腔迅速切開(kāi)腎臟包膜，取出雙側(cè)腎臟，沿縱軸剖開(kāi)，左側(cè)腎組織以10的福爾馬林固定并編號(hào)，石蠟包埋，超薄切片機(jī)3 μm連續(xù)切片，常規(guī)做HE染色。同時(shí)，用鋒利的刀片切取1 mm腎皮質(zhì)組織，立即投入電鏡固定液中。右側(cè)腎臟沿縱軸剖開(kāi)后放入-80℃冰箱中保存，供后續(xù)Western-blot法檢測(cè)。

3.大鼠24小時(shí)尿蛋白定量檢測(cè) 24只大鼠飼養(yǎng)于代謝籠中，于造模前一天及造模第7、14、21、28、35天收集大鼠24 h尿液，加入防腐劑，置于-80℃冰箱保存，待造模結(jié)束后(第35天)收集完畢統(tǒng)一送檢，采用我院全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠24 h尿蛋白排泄量。

采用TUNEL法測(cè)足細(xì)胞凋亡。石蠟切片按常規(guī)方法脫蠟至水，加入蛋白酶K工作液37℃反應(yīng)15～30 min，進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)1 h(37℃)，加converter-POD轉(zhuǎn)化液37℃孵育30 min，DAB顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片觀察。以腎小球內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性結(jié)果，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。采用圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0對(duì)各組陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行積分光密度值分析。

5.免疫印跡檢測(cè) 取腎臟皮質(zhì)組織約50 mg在裂解液1 mL中勻漿，加入等體積的2×SDS，100℃水浴5 min，離心后取上清。制備10% SDS-PAGE分離膠和5% SDS-PAGE積層膠、蛋白上樣、電泳、將SDS-PAGE凝膠上分離出的蛋白條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜，1%麗春紅染液預(yù)染，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗、二抗孵育，最后加入ALP顯影劑顯影。膠片條帶掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)蛋白與β-actin的光密度比值，表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 他克莫司對(duì)阿霉素腎病大鼠尿蛋白的影響(mg/24 h)

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

結(jié) 果

一、他克莫司對(duì)阿霉素腎病大鼠尿蛋白的影響

造模前一天各組大鼠尿蛋白比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模后第7、14、21、28、35天，模型組和他克莫司組24 h尿蛋白排泄量均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，但他克莫司組較模型組尿蛋白顯著降低(P<0.05)。表明阿霉素尾靜脈注射造成大鼠腎臟損傷，引起大量蛋白尿；他克莫司治療可顯著減少大鼠尿蛋白。(表1)

二、他克莫司對(duì)阿霉素腎病大鼠腎組織損傷的影響

腎組織HE染色可見(jiàn)，3組大鼠腎小球、腎小管和腎間質(zhì)未見(jiàn)明顯異常。電鏡顯示模型組腎小球足細(xì)胞肥大，胞漿空泡樣變性，足突廣泛融合、裂隙消失，表明大鼠微小病變型腎病模型造模成功；他克莫司組大鼠足細(xì)胞足突融合減輕，突起成指狀或柵欄狀攀附于腎小球基底膜，表明他克莫司能夠改善足細(xì)胞足突融合，修復(fù)足細(xì)胞損傷。(圖1)

三、他克莫司對(duì)阿霉素腎病大鼠足細(xì)胞數(shù)量的影響

WT-1是表達(dá)于足細(xì)胞胞核的細(xì)胞特異性蛋白，圖2顯示W(wǎng)T-1免疫組化染色可將腎小球足細(xì)胞胞核染成棕色，模型組較對(duì)照組腎小球中棕色染色顆粒明顯減少，其積分光密度值明顯下降(P<0.05)；他克莫司組腎小球足細(xì)胞胞核棕色染色顆粒顯著增多，積分光密度值增加(P<0.05)。表明他克莫司治療可以減少阿霉素腎病大鼠足細(xì)胞的丟失。

四、他克莫司對(duì)阿霉素腎病大鼠足細(xì)胞凋亡的影響

采用TUNEL法檢測(cè)大鼠腎小球足細(xì)胞的凋亡，結(jié)果顯示模型組腎小球內(nèi)棕色染色顆粒較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)，提示阿霉素尾靜脈注射可誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡；他克莫司治療后，大鼠腎小球內(nèi)棕色染色顆粒明顯減少(P<0.05)，表明他克莫司能夠抑制足細(xì)胞凋亡。足細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3免疫熒光染色顯示，模型組較對(duì)照組caspase-3表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)；他克莫司治療后，caspase-3熒光強(qiáng)度明顯下降(P<0.05)(圖3)。Western blot檢測(cè)結(jié)果同樣顯示，模型組較對(duì)照組caspase-3蛋白表達(dá)量明顯增多(P<0.05)；他克莫司治療后，caspase-3蛋白表達(dá)量明顯減少(P<0.05)(圖4)。以上結(jié)果均表明阿霉素注射導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡增加，他克莫司可抑制足細(xì)胞凋亡。

討 論

足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過(guò)膜最后一道屏障，其功能受損已被證實(shí)是蛋白尿發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。以足細(xì)胞損傷或功能異常為基礎(chǔ)的腎小球疾病又稱為足細(xì)胞病，包括微小病變性腎病、局灶節(jié)段腎小球硬化、彌漫性腎小球系膜硬化、塌陷性腎病[2]。Barisoni等[3]提出足細(xì)胞對(duì)損傷刺激的反應(yīng)有4種表現(xiàn)：(1)表型修飾為足突融合但足細(xì)胞數(shù)目沒(méi)改變；(2)細(xì)胞凋亡伴有足細(xì)胞減少；(3)發(fā)育停滯伴有輕度增殖活動(dòng)；(4)分裂并重新進(jìn)入細(xì)胞周期伴有明顯的增殖活動(dòng)。

足細(xì)胞通過(guò)裂孔隔膜蛋白、頂膜區(qū)蛋白、基底膜區(qū)蛋白和細(xì)胞骨架蛋白穩(wěn)定附著于腎小球基底膜上。nephrin、podocin、CD2AP等構(gòu)成裂孔隔膜蛋白，其中以nephrin為關(guān)鍵組分；足細(xì)胞頂膜區(qū)由帶負(fù)電荷的蛋白多聚復(fù)合物覆蓋，形成了腎小球?yàn)V過(guò)膜的電荷屏障；基底膜區(qū)蛋白α3β1整合素使足細(xì)胞錨定于腎小球基底膜上；細(xì)胞骨架蛋白包括actin、actinin-4和synaptopodin，連接基底膜的整合素和裂孔膜蛋白起到橋梁作用，從而維持足細(xì)胞的正常形態(tài)功能。這4組分子蛋白中任何一組蛋白受損均會(huì)導(dǎo)致足細(xì)胞的損傷和丟失，而足細(xì)胞丟失將導(dǎo)致腎小球硬化發(fā)生和發(fā)展。足細(xì)胞丟失的百分率與腎小球疾病的嚴(yán)重程度成正相關(guān)[1，4]。因此，維持足細(xì)胞應(yīng)有的數(shù)量從而維持腎小球正常濾過(guò)功能成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

他克莫司是一種新型免疫抑制藥物，它能夠抑制多種炎癥因子如IL-2、IL-10等的產(chǎn)生，抑制T淋巴細(xì)胞的功能，發(fā)揮強(qiáng)大細(xì)胞免疫抑制作用[5-7]。同時(shí)，他克莫司也能抑制B細(xì)胞功能，抑制體液免疫[8]。他克莫司最早被應(yīng)用于臨床器官移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的預(yù)防和治療，取得了很好的抗免疫排斥效果。近10多年來(lái)，人們嘗試將他克莫司聯(lián)合激素應(yīng)用于多種激素耐受性腎小球疾病的治療，獲得較滿意的治療效果[9-11]。國(guó)內(nèi)學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)他克莫司可以通過(guò)減少足細(xì)胞表達(dá)和分泌血管生成素樣蛋白4(Angptl 4)，減少足細(xì)胞損傷的作用[12]。

微小病變腎病的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，目前主要認(rèn)為與T細(xì)胞免疫功能紊亂，介導(dǎo)異常的免疫應(yīng)答導(dǎo)致足細(xì)胞損傷而發(fā)病[13]。他克莫司能夠穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與他克莫司結(jié)合蛋白(FKBP)結(jié)合，抑制T淋巴細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)抑制T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，下調(diào)細(xì)胞免疫應(yīng)答，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞免于損傷[14-16]。

本研究建立阿霉素腎病模型，類似于人類微小病變腎病，單獨(dú)應(yīng)用他克莫司進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示干預(yù)組大鼠尿蛋白明顯減少，足突融合改善和足細(xì)胞數(shù)目恢復(fù)，從而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了單獨(dú)應(yīng)用他克莫司對(duì)腎小球疾病的治療同樣具有顯著的療效。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)阿霉素誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡通過(guò)兩個(gè)途徑。一個(gè)是通過(guò)激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)，上調(diào)Fas和caspase-3蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)[17]，或者刺激線粒體釋放細(xì)胞色素C，間接刺激caspase-3表達(dá)實(shí)現(xiàn)[18]；另一個(gè)是通過(guò)刺激線粒體融合蛋白1和2的表達(dá)，改變線粒體的外部形態(tài)和內(nèi)部F-actin骨架蛋白重構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)[18]。有學(xué)者通過(guò)對(duì)氨基核苷嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside，PAN)誘導(dǎo)大鼠足細(xì)胞病模型的研究，發(fā)現(xiàn)環(huán)孢素A和他克莫司均能夠直接下調(diào)caspase-3的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，還能通過(guò)抑制線粒體細(xì)胞色素C釋放，間接抑制細(xì)胞凋亡，并且減輕線粒體功能紊亂而抑制細(xì)胞凋亡[19]。Liao等[20]研究他克莫司對(duì)狼瘡腎炎的足細(xì)胞保護(hù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)他克莫司可以穩(wěn)定F-actin骨架蛋白，抑制TGF-β1誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。我們的研究在建立阿霉素腎病大鼠模型后，以他克莫司灌胃干預(yù)，與模型組相比，治療組大鼠尿蛋白顯著減少，TUNEL結(jié)果顯示足細(xì)胞凋亡陽(yáng)性率下降，Western blot結(jié)果提示caspase-3蛋白表達(dá)量下降，免疫熒光結(jié)果提示腎小球caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，從而在體內(nèi)驗(yàn)證了他克莫司具有抗足細(xì)胞凋亡作用，其具體細(xì)胞信號(hào)通路有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本文初步證實(shí)了他克莫司可修復(fù)阿霉素腎病大鼠足細(xì)胞損傷，其機(jī)制與抑制足細(xì)胞凋亡有關(guān)。