轉基因產品檢測標準物質量值一致性研究進展

王顥潛 李夏瑩 張麗 趙新 陳銳 陳笑蕓 高芳瑞 蘭青闊

王永3 張秀杰1

（1. 農業(yè)農村部科技發(fā)展中心，北京 100176；2. 中南民族大學生命科學學院，武漢 430074；3. 天津市農業(yè)質量標準與檢測技術研究所， 天津 300381；4. 浙江省農業(yè)科學院農產品質量標準研究所，杭州 310021）

轉基因產品檢測標準物質在轉基因生物安全監(jiān)管、轉基因產品定性與定量檢測、檢測方法研究與標準化過程中是不可缺少的物質基礎。應用可靠的標準物質可有效提高轉基因檢測結果可比性、有效性和溯源性，是獲得高質量分析測定數(shù)據(jù)的保證［1］。

轉基因檢測標準物質的研制過程復雜、技術要求高，目前國際上研制轉基因檢測標準物質的單位較少，主要有美國的油脂化學家學會（American Oil Chemists’Society，AOCS）和歐盟聯(lián)合研究中心（Joint Research Center，JRC）。此外，日本國立食品綜合研究所（National Food Resear ch Institute，NFRI）和墨西哥國家計量院（The National Center of Metrology，CENAM）［2］也生產少量轉基因檢測標準物質。為占領轉基因檢測標準物質研制的制高點，我國自2008年開始，在轉基因生物新品種培育重大專項的支持下，也成功研制出了一系列轉基因檢測標準物質［3］。

根據(jù)轉基因產品檢測標準物質的形態(tài)特征，可分為基體標準物質、基因組DNA 和質粒DNA 標準物質3 種類型［3］。本文主要對國內外轉基因檢測標準物質的研制現(xiàn)狀，同類或同種轉化體標準物質的量值表達方式進行對比分析，為我國轉基因生物檢測標準物質研制工作的進一步開展提供支撐。

1 不同研發(fā)機構轉基因檢測標準物質研制 現(xiàn)狀

1.1 歐盟轉基因檢測標準物質研發(fā)概況

歐盟研發(fā)的標準物質有基體標準物質和質粒DNA 標準物質兩種類型。由于歐盟法規(guī)規(guī)定轉基因生物的含量是以質量百分比（mass fraction，% m/m）來衡量，因此其量值單位大多是g/kg，一般有5 個不同梯度（https：//ec.europa.eu/jrc/en/research-topic/ reference-materials-gmo-analysis）。

歐盟研發(fā)了4 個質粒分子標準物質，分別為ERM-AD413、ERM-AD415、ERM-AD425 和ERMAD427。值得注意的是歐盟在標準物質使用指南中規(guī)定，在轉基因定量檢測中，應以質量百分比的標準物質測定結果為準，測量結果為拷貝數(shù)百分比（DNA copy number ratio，% cpT/cpE）的應轉換為質量百分比。歐盟在2019 年10 月針對各轉化體發(fā)布了拷貝數(shù)百分比轉化為質量百分比的轉換系數(shù)［4］。

1.2 AOCS轉基因檢測標準物質研發(fā)概況

AOCS 研制的是純品形式的標準物質，有基體和基因組DNA 兩種類型。從AOCS 轉基因生物標準物質目錄及量值表（https：//www.aocs.org/crm）可以發(fā)現(xiàn)，AOCS 所賦予的量值及不確定度主要從純度的角度考慮。但是，無論是相同或不同類型的標準物質，其量值表達方式和單位均沒有達到一致。有的量值就是該轉化體本身，也不具有不確定度；有的量值和不確定度根據(jù)抽樣檢驗的結果用統(tǒng)計分析的方法計算得來。有的標準物質有量值單位，有的則沒有量值單位。

雖然AOCS 的標準物質在量值方面具有不一致性，但其在研制過程中盡量保證標準物質的純度，對原材料的身份和純度進行了充分的實驗驗證。

1.3 我國轉基因檢測標準物質研發(fā)概況

我國在轉基因生物新品種培育重大專項的支持下，目前也成功研制出了一些轉基因生物標準物質（表1）。我國標準物質的量值測定和不確定度評估模式與歐盟模式相似，但特性量值更多樣化，不僅有質量百分比值，還有基因的拷貝數(shù)濃度值，基因的拷貝數(shù)百分比值。質量分數(shù)值可由PCR 測量和重量配制兩種測量方式得來。

2 相同轉化體標準物質量值及不確定度比較

比較國際上不同研發(fā)機構生產的轉基因生物標準物質的特點，可綜合為以下區(qū)別。

2.1 在轉化體數(shù)量上的差異

從表2 可以看到歐盟生產了31 個轉化體的標準物質，其中31 個轉化體的基體標準物質，4 個轉化體的質粒DNA 標準物質。AOCS 生產了42 個轉化體的標準物質，其中27 個轉化體的基體標準物質，15 個轉化體的基因組DNA 標準物質。我國生產了14 個轉化體的標準物質，其中8 個轉化體的基體標準物質，5 個轉化體的質粒DNA 標準物質，3 個轉化體的基因組DNA 標準物質。

AOCS 生產的標準物質轉化體較全面，歐盟在制定拷貝數(shù)百分比轉化為質量百分比的轉化系數(shù)時，也使用了AOCS 生產的純品標準物質（如MON89788 轉化系數(shù)的確定）。

2.2 在標準物質量值表達方式上的差異

歐盟以質量百分比作為標準物質的量值表達方式，并堅持所有的檢測結果應轉化成質量百分比的形式。AOCS 則以純度作為標準物質的量值表達方式。我國研發(fā)的標準物質的量值表達方式既有質量百分比，也有拷貝數(shù)百分比，標準物質既有梯度形式，也有純品形式，但在量值測定和不確定度評估方面與歐盟更接近（表3）。

表1 中國轉基因生物標準物質目錄及量值表

表2 以轉化體計不同國家/地區(qū)生產轉基因生物標準物質情況

3 量值差異的來源

在使用不同表達方式對轉基因檢測標準物質賦值時發(fā)現(xiàn)，對于同一個標準物質，質量分數(shù)比為

表3 不同國家/地區(qū)生產的轉基因生物標準物質量值表達方式

100%時，拷貝數(shù)百分比不一定為100%［4］。對于基體標準物質和基因組DNA 標準物質，候選物種子的遺傳特性決定了量值的差異。在植物發(fā)育過程中，種子來自父本母本生殖細胞的融合，以及后期的組織分化，最終造成種子內部不同部位的染色體倍性、基因組成等遺傳信息不同［5-6］。

3.1 遺傳特性

單子葉和雙子葉植物的種子具有不同的遺傳特性。單子葉的種皮發(fā)育自母本胚囊的壁，為雙倍體；胚乳來自母本的雙倍體和父本的單倍體，所以為三倍體；胚含有父本和母本各一半遺傳物質，為二倍體；且這3 種組織中DNA 總量隨物種和品種的不同存在差異。雙子葉的種皮發(fā)育自母本胚囊壁，為二倍體；胚和胚乳（停止發(fā)育）中均含有父母本各一半遺傳物質，為雙倍體。

3.2 種子的純合性

制種特點例如自交、雜交、遠緣雜交等影響種子的純合性，父本或母本為轉基因親本對種子產品的影響也不同。

大豆是自交植物，因此絕大多數(shù)為純合子；玉米為典型的雜交植物，種子為雜交種，其子代含有

非轉基因、純合轉基因和雜合轉基因（1∶2∶1）?，F(xiàn)有的轉基因玉米標準物質大多數(shù)為雜交材料（即種子），而被檢材料（籽粒）大多為混合樣品，平均含有75%的轉基因籽粒（1/3 純合，2/3 雜合）。油菜有自交植物，但是在自然條件下，雜交率在5%-30%，而且其雜交品種也越來越多。菜籽多用來榨油和飼用，樣品混合度很高。

3.3 DNA提取效率

基體標準物質研制是由轉基因陽性材料及其受體材料充分混合，形成不同重量梯度的標準物質。但是，如果陽性與受體材料的DNA 提取效率不同，會造成從基體標準物質中提取DNA 總量中，陽性材料DNA 與非轉基因受體DNA 比值，與經認證的重量比（g/kg）的結果顯著偏差，導致重量比值與拷貝數(shù)比值兩種量值方式的結果不一致。

3.4 其他因素

很多其他因素造成了外源基因含量的差異，包括食用飼用的種子組織特點、品種差異、父母本差異、種子成熟度等。

4 不同量值單位的轉換

在國際現(xiàn)行的轉基因閾值標識體系中，均使用重量法來表示，因此現(xiàn)有轉基因檢測標準物質大部分以重量法來表示特性量值。但隨著數(shù)字PCR 等檢測技術［7］，質粒DNA［3］等標準物質研制技術和溯源體系的進步，拷貝數(shù)比值的表達方式越來越得到共識。為了保障檢測結果的一致性和互通性，歐盟引入醫(yī)療檢驗中常用的參考測量系統(tǒng)（Reference measurement systems）的概念［8-9］，提出了轉換系數(shù)（Conversion factor，CF）的概念［10］，對52 個轉化體對應的標準物質的轉化系數(shù)進行確定，并提供了詳細的應用說明［11］。

4.1 轉換系數(shù)的確定

轉換系數(shù)是歐盟聯(lián)合實驗室（EURL-GMFF）通過試驗手段確定的，其測量不確定度最終將輸入到轉基因檢測標準物質整體不確定度當中。

其中，CFCRM為標準物質轉換系數(shù)，cpT為外源基因拷貝數(shù)濃度（以cpT/μL 表示），cpE為內標準基因拷貝數(shù)濃度（以cpE/μL表示），mGM為轉基因成分含量（以重量法%表示），mnonGM為非轉基因成分含量（以重量法%表示）。

4.2 轉換系數(shù)的應用

在檢測過程中，通過數(shù)字PCR 或其他方法獲得的拷貝數(shù)比值結果，除以標準物質轉換系數(shù)CFCRM即為百分比濃度結果。

其測量不確定度計算如下：

其中，ucomb為合成不確定度，um為拷貝數(shù)比值測量中的相對不確定度，uCF為標準物質轉換系數(shù)的不確定度。

由于與轉換系數(shù)相關的不確定度較低，因此最終結果的擴展不確定度估計數(shù)僅略微增加。

表4 展示了對模擬混合樣品檢測結果的轉換過程。模擬樣品中含有MON-89788 -1 大豆、DAS-4?278 -9 玉米、MON-??863 -5 玉米，經數(shù)字PCR方法檢測獲得拷貝數(shù)比值結果（%GM，cpT/cpE）。應用CFCRM，對定量結果進行轉化，獲得重量法比值結果（%GM，m/m）。

表4 轉基因檢測標準物質量值轉換系數(shù)應用示例

5 建議

5.1 集成技術成果，確定研究重點與研制策略

自2008 年開始，我國啟動了轉基因生物新品種培育重大專項“轉基因成分檢測標準物質”，系統(tǒng)建立了涵蓋候選物鑒定、制備、聯(lián)合定值、不確定度評估、試用性評價等關鍵環(huán)節(jié)的轉基因檢測標準物質研制技術體系，發(fā)布了一系列技術標準［12-20］，成功研制出了一系列轉基因檢測標準物質［3］。Wu 等［21］在對現(xiàn)有技術成果總結的基礎上，提出了轉基因檢測標準物質研制策略，為今后標準物質研制提供了思路和參考。其中，對于基體標準物質，建議以純品為主，量值形式包括重量比值和拷貝數(shù)比值；對于基因組DNA 標準物質，建議以葉片為材料，量值包括拷貝數(shù)濃度和拷貝數(shù)比值；對于質粒DNA 標準物質，以多靶標、定性檢測陽性對照為定位，主要用于非授權檢測。

5.2 加強合作共贏，建立國內外交流機制

對比歐盟、美國和我國的轉基因檢測標準物質研發(fā)進展發(fā)現(xiàn)，在標準物質類型、轉化體種類、量值表達等方面均存在差異；歐盟和美國研發(fā)的轉化體僅有1 項重復；我國研發(fā)重點在于國內具有產業(yè)化前景的轉化體；但整體求同存異，并通過轉換系數(shù)等方法達到量值的統(tǒng)一。

為了維護我國轉基因檢測標準物質研發(fā)技術的先進性，避免重復研制，建議建立國內外合作交流機制，以信息交換、聯(lián)合攻關為重點，在實現(xiàn)資源共享的同時，優(yōu)勢互補，不僅可以提高標準物質的質量，也對未來全球標準物質的發(fā)展、等效一致的量傳溯源體系的推進意義重大。

5.3 緊跟上游研發(fā)，擴寬新型標準物質領域

隨著社會和經濟的發(fā)展，標準物質的應用領域不斷拓展。當前國內外轉基因檢測標準物質集中為轉基因作物，而在轉基因動物、新型轉基因產品涉及較少。為保持技術領先地位，應緊跟轉基因新產品、新技術發(fā)展態(tài)勢，擴寬新型標準物質領域，做好技術儲備。主要包括基因編輯產品、RNAi 產品、轉基因動物標準物質等?；蚓庉嫯a品標準物質的研制可以從質粒DNA 構建上突破。李蔥蔥等［22］以MSTN基因編輯動物為研究對象，構建了編輯型和野生型質粒對照。其中編輯型含有MSTN基因序列147 bp，野生型含有149 bp，編輯型較野生型少了2個堿基，形成一個［AG］缺失的InDel 標記，并以該InDel 標記位點為靶標，建立了基于焦磷酸測序技術的基因編輯產品定量檢測方法。

5.4 圍繞產品應用，做好技術培訓和應用指導

轉基因檢測過程復雜，特別是在轉基因定量檢測過程中，涉及DNA 提取效率、定值結果表述、測量不確定度評估等難點［23］。為更好達到測量值的準確性、一致性，轉基因檢測標準物質研發(fā)機構應做好標準物質應用的技術培訓，在難點和細節(jié)上進行技術指導。目前國內外的標準物質均附有標準物質證書及簡單的使用說明，但信息量明顯不足。建議圍繞轉基因檢測標準物質應用，結合檢測技術標準，開展測量不確定度評估［24］、基于數(shù)字PCR 的轉基因定量檢測、拷貝數(shù)比值量值標準物質應用等內容的技術培訓。