共表達HAC1 和分子伴侶基因對甘露聚糖酶在畢赤 酵母中表達的影響

閔琪 高子涵 姚銀 張華山 熊海容 張莉

（1. 中南民族大學生命科學學院，武漢 430074；2 湖北工業(yè)大學發(fā)酵工程省部共建教育部重點實驗室，武漢 430068）

β-甘露聚糖酶（β-1，4-mannanase，EC 3.2.1.78）是降解甘露聚糖的關鍵酶，屬于內切水解酶，能降解含 β-1，4-甘露糖苷鍵的甘露寡糖和甘露多 糖［1-2］。β-甘露聚糖酶在飼料、食品、醫(yī)藥、石油開采等方面具有廣泛應用前景［3-4］。然而目前甘露聚糖酶的工業(yè)生產(chǎn)成本較高，使其在實際生產(chǎn)應用中受到一定制約。利用基因工程的方法提高甘露聚糖酶的產(chǎn)量在其工業(yè)化生產(chǎn)中具有十分重要的意義，而共表達分子伴侶是提高外源蛋白表達的有效策略 之一［5-6］。

當?shù)鞍赘咚奖磉_時，未折疊的蛋白質容易在內質網(wǎng)中錯誤折疊和累積，內質網(wǎng)主要通過UPR 調控這一現(xiàn)象，UPR 激活調控因子HAC1 的表達，可促進 UPR 相關蛋白質及分子伴侶的高水平表達，介導蛋白質的正確折疊分泌，及錯誤折疊蛋白在內質網(wǎng)中的相關降解（ERAD）［7-8］。大量研究表明分子伴侶對外源蛋白的分泌表達有著重要意義，其主要作用是輔助蛋白質的正確折疊，減少由于蛋白質錯誤折疊而導致的降解，從而提高蛋白質的分泌表 達［7，9］。ERO1 在內質網(wǎng)中氧化還原態(tài)的蛋白二硫鍵異構酶PDI 成氧化態(tài)，PDI 的氧化活性幫助蛋白形成正確的折疊結構而分泌到胞外，對內質網(wǎng)腔內蛋白質二硫鍵的形成具有促進作用，且ERO1、PDI兩種分子伴侶都負責內質網(wǎng)氧化蛋白的折疊［10-11］。分子伴侶如PDI1，也屬于蛋白二硫化物異構酶，是內質網(wǎng)腔中多功能分子伴侶［12］；CPR5 親環(huán)蛋白，參與蛋白質翻譯后修飾，維持細胞內金屬離子的內穩(wěn)定［13］。BiP / Kar2p，重鏈結合蛋白，防止蛋白質分子內和分子間的相互作用而導致的錯誤折疊或聚集，并與錯誤折疊或未折疊的蛋白質結合，并阻止它們離開內質網(wǎng)［14］。Huang 等［15］通過將HAC1 在分泌α-淀粉酶的畢赤酵母重組菌胞內共表達，使重組菌的α-淀粉酶在搖瓶水平上的酶活提高約2 倍。Zhang 等［16］將內質網(wǎng)中的KAR2（BiP）與PDI 兩種分子伴侶組合，并同時在分泌G-CSF 蛋白的畢赤酵母重組菌胞內共表達，結果重組菌在搖瓶水平分泌的G-CSF 蛋白總量增加6.5 倍。Zhang 等［17］通過在分泌表達β-葡萄糖苷酶的畢赤酵母重組菌中胞內共表達PDI，共表達PDI 的重組菌在3 L 發(fā)酵罐中誘導發(fā)酵時，其發(fā)酵上清液的酶活提高46%，同時發(fā)酵上清液中β-葡萄糖苷酶的比活力提高54%。

本研究將HAC1 及5 種內質網(wǎng)折疊相關分子伴侶分別在分泌表達ManA 的重組菌中胞內共表達，并進一步將HAC1、ERO1、PDI進行兩基因或三基因組合后再進行共表達，以研究HAC1 及不同分子伴侶對ManA 在畢赤酵母GS115 中分泌表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒 分泌表達ManA 的重組菌GS115/pPIC9K-ManA 由實驗室構建并保藏（ManA基因編號為Accession No. KJ806637［18］）。表達載體pPICZA、巴斯德畢赤酵母GS115、大腸桿菌Top10均由實驗室保藏。

1.1.2 主要試劑與儀器 限制性內切酶、Prime STAR Max DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶等工具酶、DNA Marker、TaKaRa Bradford Protein Assay Kit 均購自寶生物工程（大連）有限公司；Prestained protein ladder 購自賽默飛公司。質粒小量提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒、PCR 清潔回收試劑盒等購自上海AxyPrep 公司；SDS-PAGE 凝膠快速配置試劑盒購于碧云天公司；底物角豆膠購于Sigma 公司；Tryptone和Yeast Extract 購自于Oxoid 公司；生物素、無氨基酵母氮源YNB、山梨醇和瓊脂購自Biosharp 公司；博來霉素Zeocin 購自Invitrogen 公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LBL（1 L）：10 g 蛋白胨，5 g NaCl，5 g 酵母提取物（使用時按需要加入zeocin，根據(jù)Invitrogen 使用說明書）

YPD（1 L）：10 g 酵母提取物，20 g 蛋白胨，20 g 葡萄糖（使用時按需要加入zeocin，根據(jù)Invitrogen使用說明書）

BMGY（1 L）：10 g 酵母提取物，20 g 蛋白胨，13.4 gYNB，1 mL 500×生物素（4×10-4g/L），100 mL 1 mol/L pH 6.0 磷酸鉀緩沖溶液，1%甘油（根據(jù)畢赤酵母表達手冊配置）

BMMY（1 L）：10 g 酵母提取物，20 g 蛋白胨，13.4 gYNB，1 mL 500×生物素（4×10-4g/L），100 mL 1 mol/L pH 6.0 磷酸鉀緩沖溶液，甲醇根據(jù)培養(yǎng)所需添加（根據(jù)畢赤酵母表達手冊配置）。

1.2 方法

1.2.1 HAC1 與5 種分子伴侶胞內表達重組質粒及對應重組菌的構建

1.2.1.1 六種重組質粒的構建 HAC1 與5 種分子伴侶基因序列NCBI 數(shù)據(jù)庫編號分別是CPR5（XM_002489874.1，669 bp）；HAC1（XM_002489994.1，996 bp）；PDI1（XP_002489806.1，1 110 bp）；PDI（AJ302014.1，1 554 bp）；ERO1（XM_002489600.1，1 584 bp）；BiP（XM_002490982.1，2 037 bp）。 以GS115 基因組為模板，分別擴增6 種基因，各PCR擴增引物如表1，下劃線為酶切位點。將PCR 所得的產(chǎn)物與載體pPICZA 分別雙酶切、連接并轉化大腸桿菌Top10，挑取陽性轉化子培養(yǎng)后提取質粒送至武漢擎科生物技術有限公司進行測序驗證。

表1 PCR 擴增引物序列

1.2.1.2 六種重組菌的構建 采用SacI 分別線性化上述構建好的重組質粒，電轉化至已制備成感受態(tài)的宿主菌GS115/pPIC9K-ManA 中，涂布于YPDZ博來霉素抗性篩選平板上，篩選獲得陽性轉化子，并分別命名為GS115/ManA-CPR5、GS115/ManAHAC1、GS115/ManA-PDI1、GS115/ManA-PDI、GS115/ManA-ERO1、GS115/ManA-BiP。

1.2.2 六種重組菌的誘導表達及相關分析

1.2.1 試驗地點 試驗設在涼山州普格縣五道箐鄉(xiāng)采洛洛博村進行，海拔2 000 m，土質為黃棕壤，試驗地肥力中等，前茬作物為玉米，播種前拖拉機旋耕整地耙平。

1.2.2.1 六種重組菌的搖瓶發(fā)酵 將各重組菌接種于10 mL BMGY 培養(yǎng)基中，30℃、250 r/min 培養(yǎng)24 h，離心收集適量菌體，重懸于25 mL BMMY 培養(yǎng)基中，控制起始OD600值約為1.0，在30℃、250 r/min 條件下培養(yǎng)至192 h，每隔24 h 取樣0.25 mL 并補加1%甲醇，檢測各樣品的OD600值（通過測量600 nm 處的OD 值來確定酵母細胞生長狀況）和酶活力，以GS115/pPIC9K-ManA 作為對照。所有實驗數(shù)據(jù)均重復3 次，并通過GraphPad Prism 5 軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析。

甘露聚糖酶酶活力采用DNS 法［19］測定，將收取的樣品離心并收集上清，以pH6.0 的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配置的0.5%角豆膠為底物，酶活力單位定義為在其最適溫度75℃和最適pH 6.0 條件下，1 min 內水解甘露聚糖底物產(chǎn)生1 μmol 甘露糖所需要的甘露聚糖酶的量。

1.2.2.2 六種重組菌胞內滯留酶活檢測 搖瓶發(fā)酵至168 h 時取等量菌體，10 000 r/min 離心，棄上清，用等體積預冷的pH 6.0 的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液重懸，重復洗滌2 次。再用等量的緩沖液重懸，向每管中加入0.73 g 酸性玻璃珠，振蕩器上處理30 min，離心去除細胞碎片，收集上清，測定胞內甘露聚糖酶酶活力。所有實驗數(shù)據(jù)均重復3 次。

1.2.2.3 六種重組菌發(fā)酵上清液蛋白濃度的測定及SDS-PAGE 電泳 搖瓶發(fā)酵至168 h 時，取等體積的發(fā)酵上清液進行SDS-PAGE 電泳分析，并根據(jù)TaKaRa Bradford Protein Assay Kit 使用說明檢測發(fā)酵上清液總蛋白含量。所有實驗數(shù)據(jù)均重復3 次。

1.2.3 HAC1、ERO1、PDI 組合重組質粒及對應重組菌的構建

1.2.3.1 四種組合重組質粒的構建 胞內共表達HAC1、ERO1 和PDI 的重組菌發(fā)酵上清液中的ManA酶活力分別有不同程度的提升，因此選擇HAC1、ERO1 和PDI 構 建4 種 組 合 質 粒pPICZA/HAC1-ERO1、pPICZA/HAC1-PDI、pPICZA/ERO1-PDI、pPICZA/HAC1-ERO1-PDI。首先采用重疊延伸PCR將HAC1、ERO1 和PDI 基因中的BglII 和BamH I位點在不影響翻譯后蛋白序列的條件下定點突變，去除各基因中的BglII 和BamH I 位點，重疊延伸PCR 引物見表2。然后根據(jù)同尾酶法構建各兩基因組合重組質粒，以pPICZA/HAC1-ERO1 為例，流程圖如圖1 所示。在已構建好的pPICZA/HAC1-ERO1的基礎上進一步構建pPICZA/HAC1-ERO1-PDI，方法同上。

表2 重疊延伸引物序列

1.2.3.2 四種重組菌的構建 將4 種組合重組質粒分別電轉化至已制備成感受態(tài)的宿主菌GS115/pPIC9K-ManA 中，篩選陽性轉化子，并分別命名為GS115/ManA-HAC1-ERO1、GS115/ManA-HAC1-PDI、GS115/ManA-ERO1-PDI、GS115/ManA-HAC1-ERO1-PDI。

1.2.4 四種重組菌的誘導表達及相關分析 各重組菌搖瓶發(fā)酵及相關分析實驗同1.2.2。

2 結果

2.1 HAC1與5種分子伴侶重組質粒及對應重組菌的構建

以提取的GS115 基因組為模板，PCR 擴增獲得6 種 基 因，CPR5（669 bp），HAC1（996 bp），PDI1（1 110 bp），PDI（1 554 bp），ERO1（1 584 bp），BiP（2 037 bp），擴增結果如圖2，大小與預期一致。將目的基因分別與載體pPICZA 連接獲得6 種重組質粒，測序結果表明6 種重組質粒均構建成功。然后將各重組質粒電轉化至GS115/pPIC9K-ManA 中，篩選獲得陽性轉化子。

圖1 pPICZA/HAC1-ERO1 質粒構建示意圖

圖2 六種基因的PCR 產(chǎn)物電泳圖

2.2 六種重組菌的誘導表達及相關分析

2.2.1 六種重組菌的生長曲線及酶活曲線 各重組菌發(fā)酵生長曲線及酶活曲線如圖3 所示，從圖3-A可以看出各重組菌的生長趨勢一致，表明HAC1 及5 種分子伴侶的胞內共表達不會影響重組菌的正常生長。從圖3-B 中發(fā)現(xiàn)各重組菌搖瓶發(fā)酵至168 h 時，上清的酶活力達到最高，其中GS115/ManA-HAC1、GS115/ManA-ERO1、GS115/ManA-PDI 的酶活水平相比GS115/ManA 分別提高26%、15%、20%，分別達到1 014 U/mL、925 U/mL、965 U/mL。

2.2.2 六種重組菌酶活力的比較 搖瓶發(fā)酵至168 h時，檢測各重組菌上清的酶活及胞內滯留酶活，并計算各重組菌的總酶活見圖4。重組菌GS115/ManAHAC1、GS115/ManA-ERO1、GS115/ManA-PDI 分 泌至上清液的酶活分別提高26%、15%、20%，而GS115/ManA-HAC1 胞內滯留的酶活力下降34%，且GS115/ManA-ERO1 和GS115/ManA-PDI 胞內滯 留 酶活力也略有下降，同時3 種重組菌發(fā)酵產(chǎn)生的總酶活分別提高了22%、13%、18%；重組菌GS115/ManA-PDI1 和GS115/ManA-CPR5 發(fā)酵上清液的酶活及發(fā)酵產(chǎn)生的總酶活力相對GS115/ManA 無明顯變化；而重組菌GS115/ManA-BiP 發(fā)酵上清液的酶活下降了22%，胞內滯留酶活反而上升了42%，總酶活力下降17%。

圖3 六種重組菌生長曲線（A）及酶活力曲線（B）

2.2.3 六種重組菌發(fā)酵上清液蛋白濃度的測定及SDS-PAGE 電泳 搖瓶發(fā)酵至168 h 時，對各重組菌上清液進行SDS-PAGE 電泳（圖5），測定各重組菌上清液總蛋白含量并計算出比活力（表3），結果發(fā)現(xiàn)胞內共表達HAC1、ERO1、PDI 基因的重組菌，發(fā)酵上清液中的比活力分別提高了65%、55%、44%，說明上清液中外源蛋白ManA 的純度相對 提高。

2.3 HAC1、ERO1、PDI組合重組質粒及對應重組菌的構建

將HAC1 ERO1 和PDI 進行兩基因或三基因組合，按照圖1 流程構建4 種組合重組質粒，使用BglII 與BamH I 進行雙酶切鑒定結果如圖6，雙酶切鑒定大小與預期一致。將各組合重組質粒電轉化至GS115/pPIC9K-ManA 中，篩選各重組菌陽性轉化子進行后續(xù)實驗。

圖4 六種重組菌酶活力分析（168 h）

圖5 六種重組菌發(fā)酵上清液的SDS-PAGE 分析（168 h）

表3 六種重組菌ManA 發(fā)酵上清液蛋白含量及比活力 分析（168 h）

圖6 四種重組質粒雙酶切鑒定

2.4 四種重組菌誘導表達及相關分析

2.4.1 四種重組菌的生長曲線及酶活曲線 各重組菌生長曲線與酶活曲線見圖7。圖7-A 顯示各重組菌生長趨勢無明顯差異，表明各重組菌均生長正常。從圖7-B 可以看出，各重組菌搖瓶發(fā)酵至168 h 時，GS115/ManA-HAC1-PDI 上清 酶 活 比GS115/ManA 提高10%，達到884 U/mL，而其它重組菌上清酶活力與GS115/ManA 相比均無明顯變化。

圖7 四種重組菌生長曲線（A）及酶活曲線（B）

2.4.2 四種重組菌酶活力的比較 搖瓶發(fā)酵至168 h 時，測定各重組菌上清酶活及胞內滯留酶活，并計算各重組菌的總酶活力見圖8。從圖8 可以看出，GS115/ManA-HAC1-PDI 發(fā)酵上清液酶活提高10%，且發(fā)酵產(chǎn)生的總酶活力提高10%，而其它3 種重組菌的上清酶活、胞內滯留酶活及總酶活都無明顯變化。基于各重組菌的酶活力比較，GS115/ManAHAC1-PDI 對ManA 的分泌表達有一定促進作用，但相 較 于GS115/ManA-HAC1、GS115/ManA-ERO1 和GS115/ManA-PDI 卻并沒有進一步的提升。

圖8 四種重組菌酶活力分析（168 h）

2.4.3 四種重組菌發(fā)酵上清液蛋白濃度的測定及比活力計算 搖瓶發(fā)酵至168 h 時，檢測各重組菌發(fā)酵上清液的總蛋白含量并計算比活力，結果見表4，同時對各上清液進行SDS-PAGE 電泳分析見圖9。對 比GS115/ManA，GS115/ManA-HAC1-PDI 比活 力提高39%，GS115/ManA-HAC1-ERO1-PDI 比活力提高27%，而其它3 種重組菌發(fā)酵上清液的比活力無明顯變化。但GS115/ManA-HAC1-PDI 發(fā)酵上清液的ManA 比活力相比 GS115/ManA-HAC1、GS115/ManAERO1、GS115/ManA-PDI 卻沒有進一步提高。

表4 四種重組菌ManA 發(fā)酵上清液蛋白含量及比活力分析（168 h）

圖9 四種重組菌發(fā)酵上清液的SDS-PAGE 分析（168 h）

3 討論

外源蛋白的大量表達可能會使ER 折疊和分泌外源蛋白質的能力造成負擔，進而錯誤折疊或未折疊的蛋白在ER 中大量積聚，導致未折疊蛋白應答（UPR）途徑的激活，該途徑通過誘導參與蛋白折疊的分子伴侶和ER 相關降解（ERAD）途徑的基因來減輕ER 的壓力［7-8］。分泌表達ManA 的重組菌胞內共表達HAC1、ERO1 和PDI 時，各重組菌發(fā)酵上清液的酶活水平分別提高26%、15%和20%，且胞內滯留酶活分別下降，表明了HAC1 及分子伴侶ERO1和PDI 的共表達對甘露聚糖酶ManA 的正確折疊及分泌表達具有一定的促進效果，說明其中HAC1 的表達，可能是其介導的UPR 途徑，輔助外源蛋白ManA 的正確折疊及分泌，減少由于ManA 錯誤折疊而導致的ER 相關降解途徑（ERAD）的降解，從而提高ManA 的分泌表達［7-8］。而分子伴侶如ERO1，PDI 的共表達，主要是直接或間接通過其蛋白的分子伴侶活性介導未折疊的蛋白質正確折疊，及錯誤折疊蛋白的再折疊來輔助表達ManA［5］。在分泌表達ManA 的重組菌胞內共表達PDI1、CPR5 和BiP 時，各重組菌發(fā)酵液的酶活力沒有明顯提高，表明并非所有的內質網(wǎng)分子伴侶都能輔助ManA 的正確折疊及分泌表達。對于HAC1 與分子伴侶組合并在分泌表達ManA 的重組菌，其分泌表達ManA 的酶活力沒有進一步提升，研究發(fā)現(xiàn)外源蛋白的正確折疊與不同的分子伴侶，或者不同的分子伴侶組合之間沒有特別對應的規(guī)律。已報道的研究中，不同的分子伴侶的組合協(xié)同表達外源蛋白，有時比單獨一種分子伴侶與外源蛋白共表達的效果要更明顯［16，20］，但也有不同分子伴侶的組合與外源蛋白共表達時，效果反而不明顯的現(xiàn)象［21］。分子伴侶相互之間的影響仍有待進一步研究，針對分子伴侶對酵母表達系統(tǒng)進行優(yōu)化，應該根據(jù)目的蛋白的分子結構特征而區(qū)別對待，構建相對最適合的表達工程菌［22］。

在胞內共表達HAC1、ERO1 和PDI 后，各重組菌ManA 發(fā)酵上清液的比活力分別提高了65%、55%和44%，表明ManA 發(fā)酵上清液的質量也相應得到提高，對工業(yè)上生產(chǎn)甘露聚糖酶的過程中簡化生產(chǎn)流程以及降低生產(chǎn)成本有著一定的實際意義，但HAC1 及分子伴侶對畢赤酵母分泌表達上清中ManA 的比活力的變化還需要進一步純化論證。在提高甘露聚糖酶表達量的相關研究中，其它研究策略如改變啟動子［23］、信號肽［24］等，雖然對酶活的提升都有一定作用，但同時也可能會導致胞內滯留酶活的積累，增加內質網(wǎng)蛋白折疊的壓力，若同時共表達HAC1 及分子伴侶ERO1、PDI 等基因，能協(xié)同分泌表達甘露聚糖酶，從而構建高效分泌表達甘露聚糖酶的工程菌。

蛋白質分泌的限制可能是由低折疊率造成，原因可能是內質網(wǎng)相關蛋白折疊分子伴侶的表達水平不足［25］。已報道的研究中發(fā)現(xiàn)，HAC1 或者分子伴侶基因以多拷貝的形式在畢赤酵母重組菌胞內共表達可以進一步提高其重組菌外源蛋白的分泌產(chǎn)量，如Huang 等［15］在分泌表達不同拷貝α-淀粉酶基因的畢赤酵母重組菌胞內共表達HAC1，并隨著HAC1拷貝數(shù)在一定范圍的增加，分泌表達不同拷貝α-淀粉酶基因的重組菌在搖瓶發(fā)酵水平分泌表達α-淀粉酶酶活都不斷提高，其中分泌表達12 拷貝α-淀粉酶基因，并在胞內共表達6 拷貝HAC1的重組菌酶活達到最大值，相比分泌表達12 拷貝α-淀粉酶基因，并在胞內共表達1拷貝HAC1的重組菌提高了約1倍。故本研究中的HAC1 及分子伴侶ERO1、PDI 還可以進一步研究其多拷貝基因在分泌表達不同拷貝ManA的畢赤酵母重組菌胞內共表達，從而構建高效分泌表達ManA 的工程菌。

4 結論

本研究在工程菌GS115/pPIC9K-ManA 的基礎上，分別同時共表達HAC1、ERO1、PDI，各重組菌在搖瓶發(fā)酵水平，發(fā)酵上清液的ManA 酶活力都有所提高，其中整合HAC1 基因的重組菌最高提高了26%。進一步將HAC1、ERO1、PDI進行兩基因或三基因組合后再進行共表達，但其重組菌發(fā)酵上清液酶活力并沒有進一步提升。