共表達(dá)HAC1 和分子伴侶基因?qū)Ω事毒厶敲冈诋叧?酵母中表達(dá)的影響

閔琪 高子涵 姚銀 張華山 熊海容 張莉

（1. 中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074；2 湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，武漢 430068）

β-甘露聚糖酶（β-1，4-mannanase，EC 3.2.1.78）是降解甘露聚糖的關(guān)鍵酶，屬于內(nèi)切水解酶，能降解含 β-1，4-甘露糖苷鍵的甘露寡糖和甘露多 糖［1-2］。β-甘露聚糖酶在飼料、食品、醫(yī)藥、石油開采等方面具有廣泛應(yīng)用前景［3-4］。然而目前甘露聚糖酶的工業(yè)生產(chǎn)成本較高，使其在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中受到一定制約。利用基因工程的方法提高甘露聚糖酶的產(chǎn)量在其工業(yè)化生產(chǎn)中具有十分重要的意義，而共表達(dá)分子伴侶是提高外源蛋白表達(dá)的有效策略 之一［5-6］。

當(dāng)?shù)鞍赘咚奖磉_(dá)時，未折疊的蛋白質(zhì)容易在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊和累積，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要通過UPR 調(diào)控這一現(xiàn)象，UPR 激活調(diào)控因子HAC1 的表達(dá)，可促進(jìn) UPR 相關(guān)蛋白質(zhì)及分子伴侶的高水平表達(dá)，介導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊分泌，及錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的相關(guān)降解（ERAD）［7-8］。大量研究表明分子伴侶對外源蛋白的分泌表達(dá)有著重要意義，其主要作用是輔助蛋白質(zhì)的正確折疊，減少由于蛋白質(zhì)錯誤折疊而導(dǎo)致的降解，從而提高蛋白質(zhì)的分泌表 達(dá)［7，9］。ERO1 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中氧化還原態(tài)的蛋白二硫鍵異構(gòu)酶PDI 成氧化態(tài)，PDI 的氧化活性幫助蛋白形成正確的折疊結(jié)構(gòu)而分泌到胞外，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蛋白質(zhì)二硫鍵的形成具有促進(jìn)作用，且ERO1、PDI兩種分子伴侶都負(fù)責(zé)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化蛋白的折疊［10-11］。分子伴侶如PDI1，也屬于蛋白二硫化物異構(gòu)酶，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中多功能分子伴侶［12］；CPR5 親環(huán)蛋白，參與蛋白質(zhì)翻譯后修飾，維持細(xì)胞內(nèi)金屬離子的內(nèi)穩(wěn)定［13］。BiP / Kar2p，重鏈結(jié)合蛋白，防止蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的相互作用而導(dǎo)致的錯誤折疊或聚集，并與錯誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，并阻止它們離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［14］。Huang 等［15］通過將HAC1 在分泌α-淀粉酶的畢赤酵母重組菌胞內(nèi)共表達(dá)，使重組菌的α-淀粉酶在搖瓶水平上的酶活提高約2 倍。Zhang 等［16］將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的KAR2（BiP）與PDI 兩種分子伴侶組合，并同時在分泌G-CSF 蛋白的畢赤酵母重組菌胞內(nèi)共表達(dá)，結(jié)果重組菌在搖瓶水平分泌的G-CSF 蛋白總量增加6.5 倍。Zhang 等［17］通過在分泌表達(dá)β-葡萄糖苷酶的畢赤酵母重組菌中胞內(nèi)共表達(dá)PDI，共表達(dá)PDI 的重組菌在3 L 發(fā)酵罐中誘導(dǎo)發(fā)酵時，其發(fā)酵上清液的酶活提高46%，同時發(fā)酵上清液中β-葡萄糖苷酶的比活力提高54%。

本研究將HAC1 及5 種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊相關(guān)分子伴侶分別在分泌表達(dá)ManA 的重組菌中胞內(nèi)共表達(dá)，并進(jìn)一步將HAC1、ERO1、PDI進(jìn)行兩基因或三基因組合后再進(jìn)行共表達(dá)，以研究HAC1 及不同分子伴侶對ManA 在畢赤酵母GS115 中分泌表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 分泌表達(dá)ManA 的重組菌GS115/pPIC9K-ManA 由實(shí)驗室構(gòu)建并保藏（ManA基因編號為Accession No. KJ806637［18］）。表達(dá)載體pPICZA、巴斯德畢赤酵母GS115、大腸桿菌Top10均由實(shí)驗室保藏。

1.1.2 主要試劑與儀器 限制性內(nèi)切酶、Prime STAR Max DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶等工具酶、DNA Marker、TaKaRa Bradford Protein Assay Kit 均購自寶生物工程（大連）有限公司；Prestained protein ladder 購自賽默飛公司。質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒、PCR 清潔回收試劑盒等購自上海AxyPrep 公司；SDS-PAGE 凝膠快速配置試劑盒購于碧云天公司；底物角豆膠購于Sigma 公司；Tryptone和Yeast Extract 購自于Oxoid 公司；生物素、無氨基酵母氮源YNB、山梨醇和瓊脂購自Biosharp 公司；博來霉素Zeocin 購自Invitrogen 公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LBL（1 L）：10 g 蛋白胨，5 g NaCl，5 g 酵母提取物（使用時按需要加入zeocin，根據(jù)Invitrogen 使用說明書）

YPD（1 L）：10 g 酵母提取物，20 g 蛋白胨，20 g 葡萄糖（使用時按需要加入zeocin，根據(jù)Invitrogen使用說明書）

BMGY（1 L）：10 g 酵母提取物，20 g 蛋白胨，13.4 gYNB，1 mL 500×生物素（4×10-4g/L），100 mL 1 mol/L pH 6.0 磷酸鉀緩沖溶液，1%甘油（根據(jù)畢赤酵母表達(dá)手冊配置）

BMMY（1 L）：10 g 酵母提取物，20 g 蛋白胨，13.4 gYNB，1 mL 500×生物素（4×10-4g/L），100 mL 1 mol/L pH 6.0 磷酸鉀緩沖溶液，甲醇根據(jù)培養(yǎng)所需添加（根據(jù)畢赤酵母表達(dá)手冊配置）。

1.2 方法

1.2.1 HAC1 與5 種分子伴侶胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒及對應(yīng)重組菌的構(gòu)建

1.2.1.1 六種重組質(zhì)粒的構(gòu)建 HAC1 與5 種分子伴侶基因序列NCBI 數(shù)據(jù)庫編號分別是CPR5（XM_002489874.1，669 bp）；HAC1（XM_002489994.1，996 bp）；PDI1（XP_002489806.1，1 110 bp）；PDI（AJ302014.1，1 554 bp）；ERO1（XM_002489600.1，1 584 bp）；BiP（XM_002490982.1，2 037 bp）。 以GS115 基因組為模板，分別擴(kuò)增6 種基因，各PCR擴(kuò)增引物如表1，下劃線為酶切位點(diǎn)。將PCR 所得的產(chǎn)物與載體pPICZA 分別雙酶切、連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，挑取陽性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)后提取質(zhì)粒送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序驗證。

表1 PCR 擴(kuò)增引物序列

1.2.1.2 六種重組菌的構(gòu)建 采用SacI 分別線性化上述構(gòu)建好的重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化至已制備成感受態(tài)的宿主菌GS115/pPIC9K-ManA 中，涂布于YPDZ博來霉素抗性篩選平板上，篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子，并分別命名為GS115/ManA-CPR5、GS115/ManAHAC1、GS115/ManA-PDI1、GS115/ManA-PDI、GS115/ManA-ERO1、GS115/ManA-BiP。

1.2.2 六種重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及相關(guān)分析

1.2.1 試驗地點(diǎn) 試驗設(shè)在涼山州普格縣五道箐鄉(xiāng)采洛洛博村進(jìn)行，海拔2 000 m，土質(zhì)為黃棕壤，試驗地肥力中等，前茬作物為玉米，播種前拖拉機(jī)旋耕整地耙平。

1.2.2.1 六種重組菌的搖瓶發(fā)酵 將各重組菌接種于10 mL BMGY 培養(yǎng)基中，30℃、250 r/min 培養(yǎng)24 h，離心收集適量菌體，重懸于25 mL BMMY 培養(yǎng)基中，控制起始OD600值約為1.0，在30℃、250 r/min 條件下培養(yǎng)至192 h，每隔24 h 取樣0.25 mL 并補(bǔ)加1%甲醇，檢測各樣品的OD600值（通過測量600 nm 處的OD 值來確定酵母細(xì)胞生長狀況）和酶活力，以GS115/pPIC9K-ManA 作為對照。所有實(shí)驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次，并通過GraphPad Prism 5 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

甘露聚糖酶酶活力采用DNS 法［19］測定，將收取的樣品離心并收集上清，以pH6.0 的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配置的0.5%角豆膠為底物，酶活力單位定義為在其最適溫度75℃和最適pH 6.0 條件下，1 min 內(nèi)水解甘露聚糖底物產(chǎn)生1 μmol 甘露糖所需要的甘露聚糖酶的量。

1.2.2.2 六種重組菌胞內(nèi)滯留酶活檢測 搖瓶發(fā)酵至168 h 時取等量菌體，10 000 r/min 離心，棄上清，用等體積預(yù)冷的pH 6.0 的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液重懸，重復(fù)洗滌2 次。再用等量的緩沖液重懸，向每管中加入0.73 g 酸性玻璃珠，振蕩器上處理30 min，離心去除細(xì)胞碎片，收集上清，測定胞內(nèi)甘露聚糖酶酶活力。所有實(shí)驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次。

1.2.2.3 六種重組菌發(fā)酵上清液蛋白濃度的測定及SDS-PAGE 電泳 搖瓶發(fā)酵至168 h 時，取等體積的發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析，并根據(jù)TaKaRa Bradford Protein Assay Kit 使用說明檢測發(fā)酵上清液總蛋白含量。所有實(shí)驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次。

1.2.3 HAC1、ERO1、PDI 組合重組質(zhì)粒及對應(yīng)重組菌的構(gòu)建

1.2.3.1 四種組合重組質(zhì)粒的構(gòu)建 胞內(nèi)共表達(dá)HAC1、ERO1 和PDI 的重組菌發(fā)酵上清液中的ManA酶活力分別有不同程度的提升，因此選擇HAC1、ERO1 和PDI 構(gòu) 建4 種 組 合 質(zhì) 粒pPICZA/HAC1-ERO1、pPICZA/HAC1-PDI、pPICZA/ERO1-PDI、pPICZA/HAC1-ERO1-PDI。首先采用重疊延伸PCR將HAC1、ERO1 和PDI 基因中的BglII 和BamH I位點(diǎn)在不影響翻譯后蛋白序列的條件下定點(diǎn)突變，去除各基因中的BglII 和BamH I 位點(diǎn)，重疊延伸PCR 引物見表2。然后根據(jù)同尾酶法構(gòu)建各兩基因組合重組質(zhì)粒，以pPICZA/HAC1-ERO1 為例，流程圖如圖1 所示。在已構(gòu)建好的pPICZA/HAC1-ERO1的基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建pPICZA/HAC1-ERO1-PDI，方法同上。

表2 重疊延伸引物序列

1.2.3.2 四種重組菌的構(gòu)建 將4 種組合重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化至已制備成感受態(tài)的宿主菌GS115/pPIC9K-ManA 中，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并分別命名為GS115/ManA-HAC1-ERO1、GS115/ManA-HAC1-PDI、GS115/ManA-ERO1-PDI、GS115/ManA-HAC1-ERO1-PDI。

1.2.4 四種重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及相關(guān)分析 各重組菌搖瓶發(fā)酵及相關(guān)分析實(shí)驗同1.2.2。

2 結(jié)果

2.1 HAC1與5種分子伴侶重組質(zhì)粒及對應(yīng)重組菌的構(gòu)建

以提取的GS115 基因組為模板，PCR 擴(kuò)增獲得6 種 基 因，CPR5（669 bp），HAC1（996 bp），PDI1（1 110 bp），PDI（1 554 bp），ERO1（1 584 bp），BiP（2 037 bp），擴(kuò)增結(jié)果如圖2，大小與預(yù)期一致。將目的基因分別與載體pPICZA 連接獲得6 種重組質(zhì)粒，測序結(jié)果表明6 種重組質(zhì)粒均構(gòu)建成功。然后將各重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至GS115/pPIC9K-ManA 中，篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子。

圖1 pPICZA/HAC1-ERO1 質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

圖2 六種基因的PCR 產(chǎn)物電泳圖

2.2 六種重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及相關(guān)分析

2.2.1 六種重組菌的生長曲線及酶活曲線 各重組菌發(fā)酵生長曲線及酶活曲線如圖3 所示，從圖3-A可以看出各重組菌的生長趨勢一致，表明HAC1 及5 種分子伴侶的胞內(nèi)共表達(dá)不會影響重組菌的正常生長。從圖3-B 中發(fā)現(xiàn)各重組菌搖瓶發(fā)酵至168 h 時，上清的酶活力達(dá)到最高，其中GS115/ManA-HAC1、GS115/ManA-ERO1、GS115/ManA-PDI 的酶活水平相比GS115/ManA 分別提高26%、15%、20%，分別達(dá)到1 014 U/mL、925 U/mL、965 U/mL。

2.2.2 六種重組菌酶活力的比較 搖瓶發(fā)酵至168 h時，檢測各重組菌上清的酶活及胞內(nèi)滯留酶活，并計算各重組菌的總酶活見圖4。重組菌GS115/ManAHAC1、GS115/ManA-ERO1、GS115/ManA-PDI 分 泌至上清液的酶活分別提高26%、15%、20%，而GS115/ManA-HAC1 胞內(nèi)滯留的酶活力下降34%，且GS115/ManA-ERO1 和GS115/ManA-PDI 胞內(nèi)滯 留 酶活力也略有下降，同時3 種重組菌發(fā)酵產(chǎn)生的總酶活分別提高了22%、13%、18%；重組菌GS115/ManA-PDI1 和GS115/ManA-CPR5 發(fā)酵上清液的酶活及發(fā)酵產(chǎn)生的總酶活力相對GS115/ManA 無明顯變化；而重組菌GS115/ManA-BiP 發(fā)酵上清液的酶活下降了22%，胞內(nèi)滯留酶活反而上升了42%，總酶活力下降17%。

圖3 六種重組菌生長曲線（A）及酶活力曲線（B）

2.2.3 六種重組菌發(fā)酵上清液蛋白濃度的測定及SDS-PAGE 電泳 搖瓶發(fā)酵至168 h 時，對各重組菌上清液進(jìn)行SDS-PAGE 電泳（圖5），測定各重組菌上清液總蛋白含量并計算出比活力（表3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)共表達(dá)HAC1、ERO1、PDI 基因的重組菌，發(fā)酵上清液中的比活力分別提高了65%、55%、44%，說明上清液中外源蛋白ManA 的純度相對 提高。

2.3 HAC1、ERO1、PDI組合重組質(zhì)粒及對應(yīng)重組菌的構(gòu)建

將HAC1 ERO1 和PDI 進(jìn)行兩基因或三基因組合，按照圖1 流程構(gòu)建4 種組合重組質(zhì)粒，使用BglII 與BamH I 進(jìn)行雙酶切鑒定結(jié)果如圖6，雙酶切鑒定大小與預(yù)期一致。將各組合重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至GS115/pPIC9K-ManA 中，篩選各重組菌陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

圖4 六種重組菌酶活力分析（168 h）

圖5 六種重組菌發(fā)酵上清液的SDS-PAGE 分析（168 h）

表3 六種重組菌ManA 發(fā)酵上清液蛋白含量及比活力 分析（168 h）

圖6 四種重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.4 四種重組菌誘導(dǎo)表達(dá)及相關(guān)分析

2.4.1 四種重組菌的生長曲線及酶活曲線 各重組菌生長曲線與酶活曲線見圖7。圖7-A 顯示各重組菌生長趨勢無明顯差異，表明各重組菌均生長正常。從圖7-B 可以看出，各重組菌搖瓶發(fā)酵至168 h 時，GS115/ManA-HAC1-PDI 上清 酶 活 比GS115/ManA 提高10%，達(dá)到884 U/mL，而其它重組菌上清酶活力與GS115/ManA 相比均無明顯變化。

圖7 四種重組菌生長曲線（A）及酶活曲線（B）

2.4.2 四種重組菌酶活力的比較 搖瓶發(fā)酵至168 h 時，測定各重組菌上清酶活及胞內(nèi)滯留酶活，并計算各重組菌的總酶活力見圖8。從圖8 可以看出，GS115/ManA-HAC1-PDI 發(fā)酵上清液酶活提高10%，且發(fā)酵產(chǎn)生的總酶活力提高10%，而其它3 種重組菌的上清酶活、胞內(nèi)滯留酶活及總酶活都無明顯變化?；诟髦亟M菌的酶活力比較，GS115/ManAHAC1-PDI 對ManA 的分泌表達(dá)有一定促進(jìn)作用，但相 較 于GS115/ManA-HAC1、GS115/ManA-ERO1 和GS115/ManA-PDI 卻并沒有進(jìn)一步的提升。

圖8 四種重組菌酶活力分析（168 h）

2.4.3 四種重組菌發(fā)酵上清液蛋白濃度的測定及比活力計算 搖瓶發(fā)酵至168 h 時，檢測各重組菌發(fā)酵上清液的總蛋白含量并計算比活力，結(jié)果見表4，同時對各上清液進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析見圖9。對 比GS115/ManA，GS115/ManA-HAC1-PDI 比活 力提高39%，GS115/ManA-HAC1-ERO1-PDI 比活力提高27%，而其它3 種重組菌發(fā)酵上清液的比活力無明顯變化。但GS115/ManA-HAC1-PDI 發(fā)酵上清液的ManA 比活力相比 GS115/ManA-HAC1、GS115/ManAERO1、GS115/ManA-PDI 卻沒有進(jìn)一步提高。

表4 四種重組菌ManA 發(fā)酵上清液蛋白含量及比活力分析（168 h）

圖9 四種重組菌發(fā)酵上清液的SDS-PAGE 分析（168 h）

3 討論

外源蛋白的大量表達(dá)可能會使ER 折疊和分泌外源蛋白質(zhì)的能力造成負(fù)擔(dān)，進(jìn)而錯誤折疊或未折疊的蛋白在ER 中大量積聚，導(dǎo)致未折疊蛋白應(yīng)答（UPR）途徑的激活，該途徑通過誘導(dǎo)參與蛋白折疊的分子伴侶和ER 相關(guān)降解（ERAD）途徑的基因來減輕ER 的壓力［7-8］。分泌表達(dá)ManA 的重組菌胞內(nèi)共表達(dá)HAC1、ERO1 和PDI 時，各重組菌發(fā)酵上清液的酶活水平分別提高26%、15%和20%，且胞內(nèi)滯留酶活分別下降，表明了HAC1 及分子伴侶ERO1和PDI 的共表達(dá)對甘露聚糖酶ManA 的正確折疊及分泌表達(dá)具有一定的促進(jìn)效果，說明其中HAC1 的表達(dá)，可能是其介導(dǎo)的UPR 途徑，輔助外源蛋白ManA 的正確折疊及分泌，減少由于ManA 錯誤折疊而導(dǎo)致的ER 相關(guān)降解途徑（ERAD）的降解，從而提高M(jìn)anA 的分泌表達(dá)［7-8］。而分子伴侶如ERO1，PDI 的共表達(dá)，主要是直接或間接通過其蛋白的分子伴侶活性介導(dǎo)未折疊的蛋白質(zhì)正確折疊，及錯誤折疊蛋白的再折疊來輔助表達(dá)ManA［5］。在分泌表達(dá)ManA 的重組菌胞內(nèi)共表達(dá)PDI1、CPR5 和BiP 時，各重組菌發(fā)酵液的酶活力沒有明顯提高，表明并非所有的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶都能輔助ManA 的正確折疊及分泌表達(dá)。對于HAC1 與分子伴侶組合并在分泌表達(dá)ManA 的重組菌，其分泌表達(dá)ManA 的酶活力沒有進(jìn)一步提升，研究發(fā)現(xiàn)外源蛋白的正確折疊與不同的分子伴侶，或者不同的分子伴侶組合之間沒有特別對應(yīng)的規(guī)律。已報道的研究中，不同的分子伴侶的組合協(xié)同表達(dá)外源蛋白，有時比單獨(dú)一種分子伴侶與外源蛋白共表達(dá)的效果要更明顯［16，20］，但也有不同分子伴侶的組合與外源蛋白共表達(dá)時，效果反而不明顯的現(xiàn)象［21］。分子伴侶相互之間的影響仍有待進(jìn)一步研究，針對分子伴侶對酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，應(yīng)該根據(jù)目的蛋白的分子結(jié)構(gòu)特征而區(qū)別對待，構(gòu)建相對最適合的表達(dá)工程菌［22］。

在胞內(nèi)共表達(dá)HAC1、ERO1 和PDI 后，各重組菌ManA 發(fā)酵上清液的比活力分別提高了65%、55%和44%，表明ManA 發(fā)酵上清液的質(zhì)量也相應(yīng)得到提高，對工業(yè)上生產(chǎn)甘露聚糖酶的過程中簡化生產(chǎn)流程以及降低生產(chǎn)成本有著一定的實(shí)際意義，但HAC1 及分子伴侶對畢赤酵母分泌表達(dá)上清中ManA 的比活力的變化還需要進(jìn)一步純化論證。在提高甘露聚糖酶表達(dá)量的相關(guān)研究中，其它研究策略如改變啟動子［23］、信號肽［24］等，雖然對酶活的提升都有一定作用，但同時也可能會導(dǎo)致胞內(nèi)滯留酶活的積累，增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊的壓力，若同時共表達(dá)HAC1 及分子伴侶ERO1、PDI 等基因，能協(xié)同分泌表達(dá)甘露聚糖酶，從而構(gòu)建高效分泌表達(dá)甘露聚糖酶的工程菌。

蛋白質(zhì)分泌的限制可能是由低折疊率造成，原因可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白折疊分子伴侶的表達(dá)水平不足［25］。已報道的研究中發(fā)現(xiàn)，HAC1 或者分子伴侶基因以多拷貝的形式在畢赤酵母重組菌胞內(nèi)共表達(dá)可以進(jìn)一步提高其重組菌外源蛋白的分泌產(chǎn)量，如Huang 等［15］在分泌表達(dá)不同拷貝α-淀粉酶基因的畢赤酵母重組菌胞內(nèi)共表達(dá)HAC1，并隨著HAC1拷貝數(shù)在一定范圍的增加，分泌表達(dá)不同拷貝α-淀粉酶基因的重組菌在搖瓶發(fā)酵水平分泌表達(dá)α-淀粉酶酶活都不斷提高，其中分泌表達(dá)12 拷貝α-淀粉酶基因，并在胞內(nèi)共表達(dá)6 拷貝HAC1的重組菌酶活達(dá)到最大值，相比分泌表達(dá)12 拷貝α-淀粉酶基因，并在胞內(nèi)共表達(dá)1拷貝HAC1的重組菌提高了約1倍。故本研究中的HAC1 及分子伴侶ERO1、PDI 還可以進(jìn)一步研究其多拷貝基因在分泌表達(dá)不同拷貝ManA的畢赤酵母重組菌胞內(nèi)共表達(dá)，從而構(gòu)建高效分泌表達(dá)ManA 的工程菌。

4 結(jié)論

本研究在工程菌GS115/pPIC9K-ManA 的基礎(chǔ)上，分別同時共表達(dá)HAC1、ERO1、PDI，各重組菌在搖瓶發(fā)酵水平，發(fā)酵上清液的ManA 酶活力都有所提高，其中整合HAC1 基因的重組菌最高提高了26%。進(jìn)一步將HAC1、ERO1、PDI進(jìn)行兩基因或三基因組合后再進(jìn)行共表達(dá)，但其重組菌發(fā)酵上清液酶活力并沒有進(jìn)一步提升。