重組畢赤酵母產(chǎn)青蛤Mytimacin 抗菌肽的表達(dá)研究

趙震 王莎莎 呂星星 陶妍 謝晶 錢(qián)韻芳

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

抗菌肽是生物機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的一類(lèi)內(nèi)源性陽(yáng)離子小分子多肽，它們?cè)诖蠖鄶?shù)生物抵御病毒、細(xì)菌等病原微生物侵染的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是機(jī)體先天性免疫功能的重要組成成分［1］。大多數(shù)抗菌肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌具有抑制作用，尤為重要的是與抗生素相比，它們無(wú)污染、無(wú)殘留、不易產(chǎn)生抗藥性，并且能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，故被認(rèn)為是開(kāi)發(fā)天然抗菌劑的良好候選者。

軟體動(dòng)物如貝類(lèi)缺乏特異性的免疫系統(tǒng)，其機(jī)體的免疫機(jī)制主要與體液和血淋巴、外套膜和閉殼肌等相關(guān)組織細(xì)胞中存在的抗菌肽、溶菌酶和凝集素等免疫因子有關(guān)，這些免疫因子組成了貝類(lèi)免疫系統(tǒng)的第一道防線［2］。迄今為止，數(shù)貽貝來(lái)源抗菌肽的研究較為多見(jiàn)，它們被分為4 個(gè)家族：貽貝 防 御 素（Defensin）［3］、貽 貝 肽（Myticins）［4］、貽貝素（Mytilins）和具有抗真菌活性的貽貝霉素（Mytimycins）［5-6］。隨著對(duì)軟體動(dòng)物抗菌肽研究的不斷深入，又發(fā)現(xiàn)了一種新的抗菌肽家族Macin，該家族成員包括Theromacin［7］、Hyrmacin［8］、Mytimacin和Neuromacin［9-10］，它們是一類(lèi)帶正電荷的分泌型多肽，富含半胱氨酸，且多在無(wú)脊椎動(dòng)物中表達(dá)；與上述貽貝來(lái)源的抗菌肽不同，Macin 家族的抗菌肽主要在上皮細(xì)胞及周邊的脂肪組織中表達(dá)。2004年，Tasiemski 等［7］首次在環(huán)節(jié)動(dòng)物腸蛭（Theromyzon tessulatum）中發(fā)現(xiàn)Macin 家族的theromacin基因，之后在水蛭（Hirudo medicinalis）和大乳頭水螅（Hydra magnipapillata）中也相繼發(fā)現(xiàn)了Macin 家族的基因［8，11］。2010 年，Xu 等［12］在三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）中發(fā)現(xiàn)了theromaicn基因，這是首次報(bào)道的在貝類(lèi)中發(fā)現(xiàn)的Macin 家族基因；2012 年，Gerdor 等［10］在紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）中發(fā)現(xiàn)了5 個(gè)類(lèi)似Mytimacin的基因序列；之后有學(xué)者又相繼在青蛤中發(fā)現(xiàn)Mytimacin基因以及在背角無(wú)齒蚌（Anodonta woodiana）中發(fā)現(xiàn)Theromacin基因［13-14］。

關(guān)于貝類(lèi)抗菌肽的重組DNA 表達(dá)亦有不少報(bào)道，尤其是對(duì)于防御素的外源表達(dá)研究，如Zhao等［15］在畢赤酵母（Pichia pastoris）中表達(dá)海灣扇貝（Argopecten irradians）的防御素基因AiBD；之后，他們又報(bào)道了在大腸桿菌（Escherichia coli）中表達(dá)菲律賓蛤仔（Venerupis philippinarum）的防御素基因VpBD［16］。近幾年來(lái)，我們相繼研究了斑馬魚(yú)（Danio rerio）、太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）和菲律賓蛤仔的防御素在畢赤酵母X-33 中的重組DNA 表 達(dá)［17-19］，獲得的重組蛋白均顯示了對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌的抑菌活性。值得關(guān)注的是繼上述Macin 抗菌肽家族被發(fā)現(xiàn)之后，有學(xué)者將來(lái)源于三角帆蚌和紫貽貝的Macin 家族的相關(guān)基因在大腸桿菌中表達(dá)，但他們獲得的重組蛋白須經(jīng)過(guò)梯度透析復(fù)性、脫鹽、濃縮處理后，才顯示抑菌活性［20-21］；而關(guān)于Macin 家族的真核表達(dá)研究迄今還是空白。眾所周知，使用畢赤酵母作為外源蛋白表達(dá)的真核宿主，因其可以對(duì)新生肽鏈進(jìn)行翻譯后折疊而能夠賦予重組蛋白生物學(xué)活性，并可實(shí)現(xiàn)目的蛋白的胞外表達(dá)以方便后續(xù)分離純化。據(jù)此，本研究在上述學(xué)者對(duì)青蛤Mytimacin基因進(jìn)行克隆及其組織表達(dá)分析的基礎(chǔ)上［13］，擬通過(guò)構(gòu)建重組畢赤酵母菌株獲得具有良好抑菌活性的重組Mytimacin，以期為開(kāi)發(fā)貝類(lèi)來(lái)源的天然抗菌劑提供技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、載體和菌株 鮮活青蛤購(gòu)自海鮮市場(chǎng)；克隆載體pMD-19T 購(gòu)自TaKaRa 公司（日本）；大腸桿菌DH5α 購(gòu)自天根生物科技有限公司（北京）；表達(dá)載體 pPICZαA 和畢赤酵母X-33 購(gòu)自Invitrogen公司（美國(guó)）；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌和副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑 RNAiso plus、TaqDNA 聚合酶、T4DNA 連接酶和限制性內(nèi)切酶（SacI、XhoI 和XbaI）均購(gòu)自TaKaRa 公司（日本）；DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)、DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和酵母基因組提取試劑盒均購(gòu)自天根生物科技有限公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自中科瑞泰生物科技有限公司（北京）；Western Blot 試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司（北京）；其它試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。引物合成和 DNA 測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成；MALDI-TOF-TOF 質(zhì)譜分析由上海中科新生命生物科技有限公司完成。大腸桿菌培養(yǎng)基LB、畢赤酵母培養(yǎng)基YPD、選擇培養(yǎng)基MM 和MD、誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基BMG 和BMM 見(jiàn)Invitrogen 公司畢赤酵母操作手冊(cè)。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 擴(kuò)增Mytimacin基因 鮮活青蛤運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后，取其閉殼肌，使用RNAiso Plus、根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取總RNA；第一鏈 cDNA 合成的反應(yīng)體系如下：總RNA 1 μL、Adaptor primer（5 μmol/L）1 μL、5×PrimeScript Buffer 2 μL、dNTP Mixture（10 mmol/L each）1 μL、RNase Inhibitor（40 U/μL）0.25 μL、PrimeScript RTase（200 U/μL）0.25 μL， 用RNase Free dH2O 調(diào) 至10 μL；42℃ 60 min、70℃ 15 min，獲得第一鏈cDNA。

目的基因的PCR 擴(kuò)增策略如圖1 所示。參考青蛤Mytimacin基因序列［13］（GenBank 登錄號(hào)：JN 806097）設(shè)計(jì)引物CsM-F1 和CsM-R1（表1），以青蛤閉殼肌的第一鏈cDNA 為模板，通過(guò)PCR 擴(kuò)增編碼Mytimacin抗菌肽的全長(zhǎng)cDNA，PCR 反應(yīng)體系和條件如下：10×TaqBuffer 2 μL、dNTP（2.5 μmol/L each）1.6 μL、CsM-F1 和 CsM-R1（10 μmol/L）各0.8 μL、第一鏈cDNA 0.2 μL、TaqDNA 聚合酶（2.5 U/μL）0.2 μL，用無(wú)菌水調(diào)至20 μL；94℃預(yù)變性3 min，94℃變性40 s、53.8℃退火30 s、72℃延伸1 min，反應(yīng)進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。將該片段與pMD-19T 載體連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后挑選陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行DNA 測(cè)序。以該P(yáng)CR 產(chǎn)物為模板、CsM-F2 和CsM-R2 為引物（表1），進(jìn)行第2 次PCR以獲得5′端含XhoI 酶切位點(diǎn)和Kex2 信號(hào)肽酶識(shí)別位點(diǎn)、3′端含6×His 標(biāo)簽的編碼Mytimacin成熟肽的cDNA 片段，反應(yīng)體系和條件同上，除退火溫度改為58.3℃。再以第二次PCR 產(chǎn)物為模板、CsM-F2和CsM-R3 為引物（表1），進(jìn)行第3 次PCR 以獲得3′端添加終止密碼子和XbaI 酶切位點(diǎn)的目的基因“CsMm”，反應(yīng)體系和條件同第一次PCR，除退火溫度改為58.1℃。最終獲得的目的基因“CsMm”同上進(jìn)行DNA 測(cè)序。通過(guò)ExPASy 軟件（http：//web.expasy.org /compute.pi/）預(yù)測(cè)目的蛋白的分子量。

圖1 PCR 擴(kuò)增目的基因的策略圖

表1 引物序列

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及電轉(zhuǎn)至畢赤酵母X-33 使用XhoI 和XbaI 對(duì)重組克隆質(zhì)?！皃MD-19T-CsMm”進(jìn)行雙酶切后獲得目的片段CsMm；在T4 DNA 連接酶作用下，將其與經(jīng)同樣酶處理過(guò)的表達(dá)載體 pPICZαA 按1∶1（V/V）連接（16℃，1 h）（圖2），轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞后通過(guò)雙酶切和DNA 測(cè)序驗(yàn)證重組表達(dá)載體pPICZαA-CsMm。經(jīng)SacI 處理后的線性化pPICZαA-CsMm與畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞按1∶8（V/V）混合后轉(zhuǎn)入0.2 cm 電轉(zhuǎn)杯中冰浴5 min；電轉(zhuǎn)條件如下：2 000 V、25 μF、200 ? 條件下電擊5 ms 后立即加入1 mL 預(yù)冷的1 mol/L 山梨醇。在同樣條件下將pPICZαA 電轉(zhuǎn)至畢赤酵母X-33 作為陰性對(duì)照。在電轉(zhuǎn)液中加入1 mL YPD 培養(yǎng)基，于28℃、150 r/min 培養(yǎng)1.5 h；離心后將菌體涂布于含100 μg/mL 博來(lái)霉素的YPD 平板，28℃培養(yǎng)2 d。

圖2 重組表達(dá)載體pPICZαA-CsMm 的構(gòu)建

1.2.3 酵母轉(zhuǎn)化子的篩選 挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落依次接種在MM 平板、MD 平板和含1 000 μg/mL 博來(lái)霉素的YPD 平板上，28℃培養(yǎng)12 h，以篩選高拷貝甲醇利用快速型酵母轉(zhuǎn)化子。對(duì)篩選到的轉(zhuǎn)化子提取酵母基因組DNA，并以此為模板，使用表達(dá)載體上的通用引物5′AOX1 和3′AOX1（表1）進(jìn)行PCR 鑒定。

1.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件的篩選 挑取1株酵母轉(zhuǎn)化子接種于5 mL的YPD液體培養(yǎng)基中，28℃、250 r/min 培養(yǎng)18 h 后取500 μL 轉(zhuǎn)接入50 mL的BMG 培養(yǎng)基，28℃、250 r/min 培養(yǎng)24 h；離心后將菌體轉(zhuǎn)入BMM 培養(yǎng)基，28℃、250 r/min 培養(yǎng)72 h；培養(yǎng)液離心后取上清用于Tricine-SDS-PAGE 分析（4%濃縮膠、10%夾層膠、16.5%分離膠、0.1 mol/L Tricine）。此外，在其他條件不變的情況下，將甲醇濃度設(shè)置為 0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%和3%，以確定最適甲醇濃度；將培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置為0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 和144 h，以確定最適表達(dá)時(shí)間；將培養(yǎng)溫度設(shè)置為25、26、27、28、29 和30℃，以確定最適表達(dá)溫度。

1.2.5 重組蛋白的純化及鑒定 在最適培養(yǎng)條件下對(duì)上述酵母轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)至1 L，經(jīng)離心后收集的培養(yǎng)液上清通過(guò)超濾膜包（賽多利斯VIVAFLOW200）對(duì)其進(jìn)行濃縮；使用Profina 蛋白質(zhì)自動(dòng)純化儀（BIO-RAD，美國(guó)）對(duì)濃縮液進(jìn)行固化金屬離子親和層析（IMAC）；獲得的純化產(chǎn)物經(jīng)Tricine-SDS-PAGE 分析后進(jìn)行Western blot 和MALDI-TOF-TOF 質(zhì)譜分析。Western blot 按說(shuō)明書(shū)操作：電泳后的凝膠電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，加5%脫脂牛奶（封閉液）反應(yīng)2 h 后用1×TBST 洗膜，然后加入抗His 的鼠單克隆抗體室溫孵育2 h；洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 室溫孵育1 h；洗膜后使用HRP-DAB 顯色試劑盒進(jìn)行顯色。另一方面，將 Tricine-SDS-PAGE 分析后的目的條帶切下，由上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行MALDI-TOF-TOF 質(zhì)譜分析。使用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.6 重組蛋白的抑菌活性測(cè)定 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的枯草芽孢桿菌、副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌稀釋100 倍后，各取1 μL 分別與100 μL 的含重組CsMm 的培養(yǎng)液上清混合，37℃孵育2 h 后取30 μL 涂布于LB 平板上，再37℃培養(yǎng)12 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況；以含pPICZαA 的酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液上清作為陰性對(duì)照。另一方面，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌分別稀釋1 000 倍后，各取40 μL 加入96孔板中，再分別加入80 μL 的含重組CsMm 的培養(yǎng)液上清混合，37℃孵育24 h 后測(cè)OD600值以檢測(cè)重組CsMm 對(duì)細(xì)菌的抑制率，陰性對(duì)照同上，抑制率%=（陰性對(duì)照吸光值-試驗(yàn)組吸光值）/（陰性對(duì)照吸光值）×100%［22］；以溶解于陰性對(duì)照的50 μg/mL的氨芐青霉素作為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 添加相關(guān)位點(diǎn)的目的基因CsMm的擴(kuò)增結(jié)果

如圖3 所示，通過(guò)3 次PCR 依次擴(kuò)增到372、216 和228 bp 的cDNA 片 段，第3 次PCR 產(chǎn) 物 的DNA 測(cè)序結(jié)果顯示（圖4）：兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)、Kex2 信號(hào)肽酶識(shí)別位點(diǎn)和6×His 標(biāo)簽均添加成功；除去這些位點(diǎn)，CsMm編碼了由68 個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，內(nèi)含8 個(gè)保守的半胱氨酸殘基，它們?cè)诳臻g上可形成4 對(duì)二硫鍵，與Mytimacin 的生物學(xué)活性相關(guān)。軟件預(yù)測(cè)顯示，該多肽的理論分子量為7.8 kD，等電點(diǎn)為7.2。

圖3 PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

圖4 目的基因CsMm 的核苷酸及其推斷的氨基酸序列

2.2 X-33/pPICZαA-CsMm表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及鑒定

首先使用pPICZαA 載體上的通用引物5′AOX1和3′AOX1 對(duì)構(gòu)建的重組表達(dá)載體pPICZαA-CsMm進(jìn)行菌落PCR 鑒定，結(jié)果如圖5-A 所示：除了含空載體的陰性對(duì)照，其余9 個(gè)克隆均在大于700 bp 處有明顯條帶，與717 bp 的理論分子量相符；選擇4 號(hào)克隆進(jìn)行DNA 測(cè)序，結(jié)果表明pPICZαA 與目的基因CsMm正確連接、未發(fā)生任何堿基突變。

4 號(hào)克隆經(jīng)培養(yǎng)提取其重組表達(dá)載體pPICZαACsMm，電轉(zhuǎn)至畢赤酵母X-33 后經(jīng)高濃度博來(lái)霉素和MM 平板篩選到4 株長(zhǎng)勢(shì)良好的酵母轉(zhuǎn)化子，提取它們的基因組DNA 為模板，使用5′AOX1 和3′AOX1進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果如圖5-B 所示：除了含空載體的1 號(hào)轉(zhuǎn)化子，其他4 株轉(zhuǎn)化子均在略大于700 bp處有明顯條帶，與717 bp 的理論分子量相符，由此證明重組表達(dá)載體 pPICZαA-CsMm成功嵌合入畢赤酵母X-33 基因組中。

圖5 重組表達(dá)載體pPICZαA-CsMm 的菌落PCR 鑒定（A）及酵母轉(zhuǎn)化子的篩選（B）

2.3 不同培養(yǎng)條件下重組CsMm在畢赤酵母中的 表達(dá)

選擇4 號(hào)轉(zhuǎn)化子，首先在28℃、250 r/min 和0.5%甲醇的條件下預(yù)表達(dá)72 h，其培養(yǎng)液上清的Tricine-SDS-PAGE 分析顯示了在略高于7.8 kD 處有明顯的蛋白質(zhì)條帶，與重組CsMm的理論分子量7.8 kD相符；通過(guò)IMAC 法對(duì)培養(yǎng)液上清進(jìn)行純化后獲得單一條帶（圖6），初步證明重組CsMm 被表達(dá)。

在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察不同甲醇濃度對(duì)重組CsMm 表達(dá)的影響，由圖7-A 所示：與0.5%、1%和2.5%、3%的甲醇濃度相比，在1.5%和2%的甲醇濃度下雜蛋白的條帶明顯減少，故選擇1.5%作為下述實(shí)驗(yàn)時(shí)的甲醇誘導(dǎo)濃度。圖7-B 顯示了不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)重組CsMm 表達(dá)的影響，可以發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)72-144 h 時(shí)的目的蛋白條帶及雜蛋白條帶基本上相似，故選擇72 h 為最適培養(yǎng)時(shí)間。在上述對(duì)甲醇濃度和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察不同培養(yǎng)溫度對(duì)重組CsMm 表達(dá)的影響，結(jié)果如圖7-C 所示：與其他溫度條件相比，28℃的培養(yǎng)溫度顯示了最高的蛋白質(zhì)表達(dá)量。綜上，重組CsMm 的最適表達(dá)條件為甲醇濃度1.5%、培養(yǎng)時(shí)間72 h、培養(yǎng)溫度28℃、轉(zhuǎn)速250 r/min。

圖6 重組CsMm 的預(yù)表達(dá)結(jié)果

圖7 不同甲醇濃度（A）、不同時(shí)間（B）和不同溫度（C）的表達(dá)條件下酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液上清的Tricine-SDS-PAGE 分析

2.4 基于Western blot和MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析的純化產(chǎn)物的鑒定

在上述優(yōu)化條件下進(jìn)行1 L 發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)液上清經(jīng)IMAC 法純化后測(cè)得蛋白質(zhì)濃度為0.32 mg/mL，推算至重組蛋白的表達(dá)量為25.6 mg/L。對(duì)該純化產(chǎn)物的Western blot 分析顯示（圖8）：在10 kD處有明顯單一雜交條帶，但高于理論分子量7.8 kD，其原因可能是用于Western blot 分析的彩虹蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)不同于上述Tricine-SDS-PAGE 分析時(shí)使用的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，它在凝膠上的遷移速度較快，致使目的條帶對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)分子量偏大，進(jìn)一步的MALDI-TOF-TOF 質(zhì)譜分析證明了此條帶為目的蛋白。由圖9 所示：在m/z 799.0-4 013.0 之間共捕捉到9 個(gè)由11-16 個(gè)氨基酸殘基組成的肽段，其覆蓋的氨基酸殘基數(shù)占重組CsMm 全長(zhǎng)氨基酸序列的78.6%；其中最明顯的m/z 為 842.506 4、1 290.671 9和1 455.634 8 的3 個(gè)峰分別代表自N 端起氨基酸殘基位于63-68（HHHHHH）、16-26（WSNFLTGVLWK）和1-12（GFIGDCWATWSR）的肽段，這3 段序列分別與相應(yīng)位置的理論序列相符，由此證明純化產(chǎn)物即為預(yù)期的重組CsMm。

圖8 純化產(chǎn)物的Western blot 分析

2.5 重組CsMm的抑菌活性

圖9 純化產(chǎn)物的MALDI-TOF-TOF 質(zhì)譜分析

基于涂布法的檢測(cè)結(jié)果如圖10-A 所示：與陰性對(duì)照（含pPICZαA 空載體的酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液上清與3 種細(xì)菌作用）相比，含重組CsMm 的培養(yǎng)液上清分別與革蘭氏陰性的副溶血性弧菌和革蘭氏陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌作用2 h 后，3種細(xì)菌的菌落數(shù)量均明顯減少，表明重組CsMm 對(duì)上述3 種細(xì)菌具有明顯的抑菌活性。另一方面，通過(guò)濁度法測(cè)定重組CsMm 對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制率，結(jié)果如圖10-B 所示：含重組CsMm 的培養(yǎng)液上清分別與4 種細(xì)菌混合、于37℃孵育24 h 后，發(fā)現(xiàn)重組CsMm 對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制率分別為65%和64%，高于對(duì)副溶血性弧菌（42%）和枯草芽孢桿菌（51%）的抑制率；與陽(yáng)性對(duì)照氨芐青霉素的抑菌效果相比，除了對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制率明顯低于陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)其他3 種菌的抑制率與陽(yáng)性對(duì)照之間并未顯示特別明顯的差異。

3 討論

圖10 基于涂布法（A）和濁度法（B）的培養(yǎng)液上清的抑 菌活性

貝類(lèi)等軟體動(dòng)物的棲息環(huán)境復(fù)雜，且大多數(shù)為濾食性進(jìn)食，致使其比其他物種容易遭受病原微生物的侵染，因而必須擁有更強(qiáng)大和完善的免疫系統(tǒng)才能抵御環(huán)境的污染；而它們機(jī)體細(xì)胞中表達(dá)的各種抗菌肽則是其內(nèi)源性的重要免疫因子，必然成為開(kāi)發(fā)天然抗菌劑的良好候選者。本研究以編碼青蛤抗菌肽Mytimacin 成熟肽的基因CsMm為重組DNA表達(dá)的目的基因，通過(guò)構(gòu)建重組畢赤酵母菌株成功獲得了具有明顯抑菌活性的重組CsMm。在外源蛋白的表達(dá)過(guò)程中，通過(guò)對(duì)甲醇濃度、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度等表達(dá)條件的優(yōu)化，獲得了表達(dá)量為25.6 mg/L 的重組CsMm，較我們之前報(bào)道的斑馬魚(yú)β-防御素［17］和太平洋牡蠣大防御素［18］的表達(dá)量（2.3 mg/L）提高了10 倍以上。究其原因可能與表達(dá)的外源蛋白質(zhì)在分子量上的差異有關(guān)，本研究的重組CsMm 的分子量為7.8 kD，較斑馬魚(yú)β-防御素和太平洋牡蠣大防御素的分子量（分別為5.9 和5.8 kD）大。通常，外源蛋白質(zhì)分子量越小，越容易對(duì)宿主菌產(chǎn)生潛在的危害，導(dǎo)致其經(jīng)歷“自殺”現(xiàn)象，并且小分子蛋白質(zhì)易被宿主自身產(chǎn)生的酶降解［23］，因此，較難獲得表達(dá)量高的重組蛋白質(zhì)。最近，我們報(bào)道了重組畢赤酵母產(chǎn)鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）c 型溶菌酶的表達(dá)研究［24］，其表達(dá)量達(dá)到40 mg/L，是重組CsMm 的1.6 倍，而鯉魚(yú)c 型溶菌酶的分子量為15.4 kD，是CsMm 的近2 倍。關(guān)于提高蛋白質(zhì)表達(dá)量（尤其是分子量小于10 kD）的研究有多個(gè)報(bào)道，有學(xué)者構(gòu)建了含8拷貝的腐生子囊菌（Pseudoplectania nigrella）防御素基因plectasin的表達(dá)載體，使其在畢赤酵母中的表達(dá)量較單拷貝的提高了1.63 倍［25］；另有學(xué)者將小分子的鯰魚(yú)抗菌肽基因parasinⅠ與人溶菌酶基因hLY串聯(lián)，在畢赤酵母X-33 中進(jìn)行融合表達(dá)，獲得表達(dá)量為86 mg/L 的重組融合蛋白hLYPI［26］。因此，若將CsMm作為開(kāi)發(fā)天然抗菌劑的候選者，則進(jìn)一步的研究擬構(gòu)建含多拷貝CsMm基因的表達(dá)載體或與其他分子量較大的抗菌肽基因進(jìn)行融合表達(dá)，以使其表達(dá)量達(dá)到一個(gè)更高的水平。另一方面，本研究使用的CsMm基因是經(jīng)RT-PCR 獲得的天然cDNA， 經(jīng)JAVA Codon Adaption Tool（http：//www.jcat.de/Start.jsp）檢測(cè)，該基因中存在14 個(gè)于畢赤酵母而言的低頻密碼子。劉朔等［27］根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛(ài)性，對(duì)編碼納豆激酶成熟肽的基因nkD進(jìn)行了優(yōu)化，使重組nkD 的表達(dá)量提高了3.5 倍；Yang 等［28］對(duì)黑曲霉脂肪酶成熟肽lip2基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化后，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量提高了11.6 倍。據(jù)此，后續(xù)研究有必要對(duì)青蛤抗菌肽Mytimacin 成熟肽基因CsMm進(jìn)行密碼子優(yōu)化。

本研究旨在為開(kāi)發(fā)貝類(lèi)來(lái)源抗菌肽提供重組畢赤酵母表達(dá)技術(shù)，考慮到在實(shí)際生產(chǎn)時(shí)對(duì)發(fā)酵液上清的后續(xù)處理、操作上的可行性和生產(chǎn)成本，是不宜對(duì)其進(jìn)行純化處理的，故發(fā)酵液上清是否具有抑菌活性顯得尤為重要。據(jù)此，本研究通過(guò)涂布法和濁度法考察了含重組CsMm 的培養(yǎng)液上清的抑菌活性，證明其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌以及革蘭氏陰性的大腸桿菌和副溶血性弧菌都具有明顯的抑菌活性，該結(jié)果對(duì)于今后使用發(fā)酵罐大規(guī)模制備重組CsMm 意義重大，也預(yù)示了含重組CsMm 的發(fā)酵液上清可直接作為生產(chǎn)天然抗菌劑的原液而無(wú)需對(duì)其進(jìn)行繁瑣的純化處理。

4 結(jié)論

本研究經(jīng)RT-PCR 獲得編碼青蛤抗菌肽Mytimacin 成熟肽的基因CsMm，通過(guò)構(gòu)建X-33/pPICZαA-CsMm畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，在28℃、250 r/min的條件下，使用1.5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)72 h；表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)IMAC 純化后，MALDI-TOF-TOF 質(zhì)譜分析證明其為預(yù)期的分子量7.8 kD 的重組CsMm。抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示重組CsMm 對(duì)革蘭氏陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌以及革蘭氏陰性的大腸桿菌和副溶血性弧菌都具有明顯的抑菌活性。