杜氏鹽藻促生菌株的分離與鑒定

段露露 杭偉 程宇嬌 崔紅利 王計(jì)平 李潤植

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，太谷 030801）

杜氏鹽藻（Dunaliella salina）是綠藻門，鹽藻屬的一種極度耐鹽的單細(xì)胞真核綠藻［1］，在高鹽等極端環(huán)境中仍然能夠正常生長，因此常作為耐鹽植物中的模式生物［2］。其細(xì)胞形態(tài)通常為橢圓形，具有兩條鞭毛，沒有細(xì)胞壁。鹽藻能夠積累豐富的β-胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、多糖、礦物質(zhì)等活性物質(zhì)，是天然β-胡蘿卜素的主要來源之一［3-4］。此外，還可以作為魚蝦等的飼料，在功能食品、保健等領(lǐng)域具有很好的開發(fā)利用前景。

在水生生態(tài)系統(tǒng)中，微藻和細(xì)菌之間存在密不可分的關(guān)系，它們分別扮演著重要角色，相互影響著彼此的生長及營養(yǎng)物質(zhì)累積，共同參與水環(huán)境中物質(zhì)的循環(huán)［5］。在微藻生長的過程中，藻細(xì)胞周圍會形成一個(gè)特殊的藻際微環(huán)境［6］，在這個(gè)藻際微環(huán)境中，藻細(xì)胞分泌的一些物質(zhì)會吸引周圍微生物在該環(huán)境中生長繁殖，形成了復(fù)雜獨(dú)特的藻際微生物群落。細(xì)菌可以利用微藻光合作用產(chǎn)生的有機(jī)物，微藻可以利用微生物呼吸作用產(chǎn)生的CO2及營養(yǎng)物質(zhì)［7］，形成一個(gè)循環(huán)體系，稱為“藻菌共生”［8］。在微藻的大規(guī)模培養(yǎng)過程中，這些存在于藻際環(huán)境中的細(xì)菌很難去除，且與微藻之間存在復(fù)雜的相互關(guān)系［9-10］。有些細(xì)菌對微藻有抑制作用，能夠產(chǎn)生一些殺死藻細(xì)胞的毒素或者溶藻酶等有害物質(zhì)從而抑制微藻的生長。Wang 等［11］發(fā)現(xiàn)弧菌（Vibrio）能夠產(chǎn)生藻毒素殺死亞歷山大藻（Alexandrium tamarense）。Lee 等［12］發(fā)現(xiàn)交替假單胞菌株（Pseudoalteromonassp.）A28 產(chǎn)生的胞外絲氨酸蛋白酶是殺死中肋骨條藻（Skeletonema costatum）的主要來源。但有些細(xì)菌對微藻的生長及藻細(xì)胞中物質(zhì)的積累有明顯的促進(jìn)作用，細(xì)菌能夠產(chǎn)生吲哚乙酸及維生素B12 促進(jìn)微藻的生長［13］。此外，藻菌共培養(yǎng)體系能夠有效去除廢水中氮、磷及重金屬等污染物，在廢水處理方面有較好的應(yīng)用前景［14-17］。因此，探究微藻與其藻際細(xì)菌之間的相互作用并選擇適當(dāng)?shù)拇偕?xì)菌構(gòu)建共培養(yǎng)體系對微藻的生產(chǎn)及藻菌共生系統(tǒng)的應(yīng)用有重要意義。

迄今，對杜氏鹽藻的培養(yǎng)、鹽藻細(xì)胞生長、β-胡蘿卜素的累積及鹽藻產(chǎn)品等已進(jìn)行諸多研究［18-20］，然而，鮮有關(guān)于鹽藻藻際細(xì)菌及其對鹽藻生長影響的研究報(bào)道。為此，本研究以杜氏鹽藻及其藻液為試材，分離并鑒定鹽藻藻際共生菌群，分別構(gòu)建藻菌共培養(yǎng)體系檢測所分離的共生菌株對杜氏鹽藻藻生長及代謝產(chǎn)物積累的影響，進(jìn)而篩選能促進(jìn)鹽藻生長的優(yōu)異共生菌株，以期為促生菌株在水生態(tài)環(huán)境調(diào)控的應(yīng)用及鹽藻規(guī)模化培養(yǎng)體系優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究中所用的微藻藻株為分離自運(yùn)城鹽湖水樣的杜氏鹽藻藻株Ds-SXYC-2，保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，采用DM 培養(yǎng)基培養(yǎng)鹽藻。

1.2 方法

1.2.1 共生菌株的分離純化 取生長至對數(shù)期的鹽藻藻液，用無菌水稀釋。采用平板劃線法將藻液接種于LB 固體培養(yǎng)基中，置于細(xì)菌培養(yǎng)箱中30℃恒溫倒置培養(yǎng)。待長出單菌落后，根據(jù)菌落的不同形態(tài)特征及時(shí)挑選單菌落，經(jīng)多次平板劃線直至固體培養(yǎng)基上無雜菌生長，并記錄每種共生菌的形態(tài) 特征。

1.2.2 鹽藻共生菌株的鑒定 取各生長至對數(shù)期菌液1.5 mL 離心，采用購自安徽天根生化科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取杜氏鹽藻共生菌的基因組DNA，采用16S rDNA 通用細(xì)菌引物擴(kuò)增基因組DNA。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離20 min，將條帶清晰的PCR 產(chǎn)物送至上海生物工程股份有限公司進(jìn)行DNA 測序。測序獲得的各菌株序列分別在NCBI 中進(jìn)行比對和BLAST 分析，選取相似性較大的序列應(yīng)用MEGA7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，從而鑒定出分離菌株的種、屬分類地位。

1.2.3 微藻生物量的測定 稱量離心管的重量，記作M0。取5 mL 新鮮藻液經(jīng)超聲波破碎30 s，離心，無菌水多次沖洗去除藻液中的細(xì)菌。放入烘箱中烘干，稱量最終重量，記作M1。計(jì)算出藻樣的干重DW=（M1-M0）/V（V 為藻液體積）。

1.2.4 鹽藻色素含量的測定 培養(yǎng)15 d 后，測定鹽藻藻細(xì)胞中葉綠素與β-胡蘿卜素的含量。用甲醇萃取藻細(xì)胞中的色素，取3 mL 藻液，8 000 r/min 離心10 min，棄上清。加入等體積的甲醇在黑暗條件下萃取沉淀24 h。以甲醇為參比，采用分光光度計(jì)分別測定在波長470、653 和666 nm 處藻液中的色素吸光度值，計(jì)算藻細(xì)胞中的葉綠素與β-胡蘿卜素的含量。

1.2.5 鹽藻多糖、蛋白及總脂含量的測定 采用蒽酮硫酸比色法測定鹽藻多糖含量。取5 mL 鹽藻藻液，離心10 min 后，取上清測定胞外糖含量。藻泥中加入等體積PBS 緩沖液，反復(fù)凍融3 次，經(jīng)超聲波破碎120 s，離心。各取2 mL 于試管中，加入8 mL 蒽酮硫酸溶液，沸水浴15 min 后，冷卻至室溫后采用分光光度計(jì)于625 nm 測定吸光值。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出多糖含量。（葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.006 4x-0.212 9，y為吸光值；x為多糖含量，R2=0.992 7）

采用購自南京建成科技有限公司的蛋白定量測定試劑盒測定鹽藻藻細(xì)胞可溶性蛋白質(zhì)含量。

參考馬浩天等［21］的方法測定鹽藻總脂含量。

1.2.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)均設(shè)置3 組生物學(xué)重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 進(jìn)行整理并作圖。應(yīng)用DPS 軟件對所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 鹽藻藻際共生菌落的分離

采用LB 固體培養(yǎng)基經(jīng)多次平板劃線從杜氏鹽藻藻液中共分離獲得5 株共生菌，編號為B1-B5（表1 和圖1）。3 個(gè)菌落為球形，表面光滑，邊緣整齊，顏色分別呈現(xiàn)橘黃色、橘色及白色；1 個(gè)菌落為不規(guī)則形，表面光滑，邊緣褶皺，為淡粉色；1 個(gè)菌落為乳白色球形，表面光滑，邊緣褶皺。

2.2 鹽藻藻際共生菌的鑒定

提取鹽藻藻液分離獲得的5 個(gè)菌落基因組DNA，采用通用引物擴(kuò)增獲得16S rDNA 片段大小約為1 400 bp（圖2）。將測序獲得的各自rDNA 序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast 比對分析序列相似性（表2），并進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），鑒定所測菌株的種屬分類地位。結(jié)果顯示，分離獲得的5 株共生菌分屬于3 個(gè)菌屬：菌株B1 與B2 為涅斯捷連科氏菌（Nesterenkonia），菌株B3 與B4 為鹽單胞菌（Halomonas），菌株B5 為海桿菌（Marinobacter）。

表1 杜氏鹽藻藻際細(xì)菌菌落的形態(tài)及特征

圖1 鹽藻藻際分離的細(xì)菌菌落形態(tài)

圖2 藻際菌落16S rDNA PCR 產(chǎn)物

2.3 共生菌株對鹽藻生長的影響

以不接種任何菌液的杜氏鹽藻純培養(yǎng)為對照，將分離獲得的5 株共生菌分別與與杜氏鹽藻以藻菌接種比為1∶1 構(gòu)建共培養(yǎng)體系，共培養(yǎng)15 d，每隔3 d 測定一次杜氏鹽藻干重。結(jié)果如圖4 顯示，與對照組相比，5 株共生菌株對杜氏鹽藻的生長均有促進(jìn)作用，其中菌株B3 鹽單胞菌對鹽藻的生長促進(jìn)作用顯著。培養(yǎng)15 d 后，鹽藻生物量達(dá)到2.3 g/L，比對照組增加了28.9%；其次為菌株B1 涅斯捷連科氏菌，鹽藻生物量達(dá)到2.19 g/L，相比對照組增加 了22.8%。

表2 五個(gè)鹽藻藻際細(xì)菌16S rDNA 測序結(jié)果

圖3 從鹽藻藻際分離到的5 個(gè)菌群及其他已知菌群16S rDNA 序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖4 五株共生細(xì)菌對鹽藻藻細(xì)胞生物量的影響

2.4 共生菌對鹽藻色素含量的影響

測定了培養(yǎng)15 d 之后共培養(yǎng)體系中鹽藻藻細(xì)胞的色素含量。圖5 表明，與對照相比，菌株B1 與B2 能夠使鹽藻藻細(xì)胞中富集更多葉綠素a 和β-胡蘿卜素，但葉綠素b 含量明顯下降。菌株B4 與B5顯著抑制了鹽藻藻細(xì)胞葉綠素的累積，但對β-胡蘿卜素的積累無明顯作用。菌株B3 使鹽藻藻細(xì)胞中葉綠素b 含量稍有提高，但與對照相比差異不顯著，而葉綠素a、β-胡蘿卜素的含量則顯著增加。培養(yǎng)15 d 后葉綠素a 的含量達(dá)到4.61 mg/L，相比對照組增加了36.3%，β-胡蘿卜素比對照組提高了56.4%，達(dá)到3.34 mg/L。

圖5 五株共生細(xì)菌對鹽藻藻細(xì)胞色素含量的影響

2.5 共生菌對鹽藻多糖含量的影響

測定了共培養(yǎng)體系中鹽藻多糖（胞外多糖與胞內(nèi)多糖）的含量。結(jié)果（圖6）顯示，菌株B1 與B2 使鹽藻中胞外多糖含量有所下降，但總糖含量比對照組略高。鹽藻與菌株B4 共培養(yǎng)能夠產(chǎn)生更多的胞內(nèi)多糖，胞外多糖無顯著提高。菌株B3 與B5 能顯著促進(jìn)鹽藻胞外及胞內(nèi)多糖的分泌。培養(yǎng)15 d 后，鹽藻多糖分別達(dá)到97.3 mg/L 和90.38 mg/L，比對照組分別提高了34.8%和25.2%。

圖6 五株共生細(xì)菌對鹽藻多糖含量的影響

2.6 共生菌對鹽藻可溶性蛋白含量的影響

測定鹽藻細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量（圖7）表明，菌株B5 對鹽藻蛋白質(zhì)的產(chǎn)生無顯著作用，其余4 株共生菌都能夠顯著促進(jìn)杜氏鹽藻蛋白質(zhì)的積累，其中菌株B3（鹽單胞菌）的促進(jìn)效果最佳，培養(yǎng)15 d后，蛋白質(zhì)含量達(dá)到21.89 mg/L，比對照組增加了71.2%；其次為菌株B2，蛋白質(zhì)含量為20.42 mg/L。

2.7 共生菌對鹽藻總脂含量的影響

圖8 結(jié)果表明，有4 株共生菌對鹽藻油脂積累的促進(jìn)作用顯著，其中菌株B3 能夠使鹽藻積累更多的油脂。共培養(yǎng)15 d 之后，與不添加任何菌株培養(yǎng)的對照組相比，與菌株B3 共培養(yǎng)的體系中，鹽藻總脂含量提高了37.6%，達(dá)到21.9%。

圖7 五株共生細(xì)菌對鹽藻蛋白質(zhì)含量的影響

圖8 五株共生細(xì)菌對鹽藻總脂含量的影響

3 討論

在水生環(huán)境中，微藻是重要的初級生產(chǎn)者，而微藻在生長過程中常常伴隨著藻際微生物的存在［22］。不同的微藻其藻際微生物各不相同，同一種微藻在不同的環(huán)境中其藻際微生物也存在差異。目前，許多研究者嘗試探究微藻與其藻際微生物的相互關(guān)系及作用機(jī)制。本研究分離并鑒定了杜氏鹽藻藻際細(xì)菌菌群，從杜氏鹽藻中共分離獲得5 株共生菌株，經(jīng)鑒定分屬于3 個(gè)菌屬：菌株B1 和B2 為涅斯捷連科氏菌、菌株B3 與B4 為鹽單胞菌和菌株B5為海桿菌。Wang 等［23］從鹽藻中分離獲得一株麥?zhǔn)辖惶鎲伟ˋlteromonas macleodii）。Song 等［24］分析發(fā)現(xiàn)杜氏鹽藻中的優(yōu)勢菌株為Winogradskyella algicolasp.。本研究未從杜氏鹽藻中分離獲得這兩株共生菌株，這可能與鹽藻及菌株的生長環(huán)境及培養(yǎng)條件不同有關(guān)。

細(xì)菌對微藻的影響存在很大差異。曹延群等［25］發(fā)現(xiàn)赤細(xì)菌（Erythrobacter citreus）能顯著促進(jìn)三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）的生長。許平平等［26］從鹽生小球藻（Chlorella salina）中分離獲得一株鹽單胞菌Halomonassp.，發(fā)現(xiàn)鹽單胞菌能有效促進(jìn)鹽生小球藻對砷的富集。季方等［27］從黃化的螺旋藻中分離得到一株鹽單胞菌，該菌能抑制螺旋藻的生長，對螺旋藻有較好的溶解作用。胡修貴等［28］從對蝦養(yǎng)殖池的生物絮團(tuán)中篩選獲得2 株鹽單胞菌，發(fā)現(xiàn)勝利鹽單胞菌Halomonas shengliensis對氨氮有較高的轉(zhuǎn)化率。本研究發(fā)現(xiàn)5 株共生菌均能促進(jìn)杜氏鹽藻的生長，其中菌株B3 鹽單胞菌對鹽藻生長的促進(jìn)作用最顯著。共培養(yǎng)15 d 后，杜氏鹽藻生物量達(dá)到2.3 g/L，比對照組增加了28.9%。其次為菌株B1 涅斯捷連科氏菌。而鹽單胞菌菌株B4對鹽藻生長促進(jìn)作用不明顯，且抑制藻液中葉綠素的積累。

本研究發(fā)現(xiàn)篩選獲得的菌株B3 鹽單胞菌不僅可以促進(jìn)鹽藻藻細(xì)胞生長，還可以顯著促進(jìn)鹽藻代謝產(chǎn)物的積累。共培養(yǎng)體系中，杜氏鹽藻葉綠素a的含量達(dá)到4.61 mg/L，相比對照組增加了36.3%，β-胡蘿卜素比對照組提高了56.4%。Ji 等［29］構(gòu)建了小球藻（Chlorella vulgaris）與地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）共培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌能促進(jìn)藻細(xì)胞生長及葉綠素a 積累。王書亞等［30］研究發(fā)現(xiàn)微小桿菌、枯草芽孢桿菌和假單胞菌明顯促進(jìn)小球藻的生長，葉綠素a 的含量比小球藻純培養(yǎng)時(shí)分別提高了1.79 倍、1.58 倍和1.49 倍。與鹽藻純培養(yǎng)對照相比，與菌株B3 共培養(yǎng)，鹽藻多糖、蛋白質(zhì)、總脂含量達(dá)到最高，分別比對照組增加了34.8%、71.2%和37.6%。一些研究也表明細(xì)菌對微藻代謝產(chǎn)物積累有促進(jìn)作用。Toyama 等［31］發(fā)現(xiàn)與Emticiciasp. EG3 共培養(yǎng)能夠提高纖細(xì)裸藻（Euglena gracilis）的生物量及油脂含量。衛(wèi)治金等［32］構(gòu)建了小球藻與固氮菌共培養(yǎng)體系，研究發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系中小球藻的生物量及油脂含量顯著提高。施華升［33］研究表明污泥細(xì)菌與小球衣藻形成的菌藻聚集體胞外分泌多糖比微藻純培養(yǎng)增加60.41 mg/L。Ban 等［34］發(fā)現(xiàn)假單胞菌能夠使萊茵衣藻的蛋白質(zhì)含量保持在較高水平。史玉倩等［35］發(fā)現(xiàn)水稻內(nèi)生泛菌能夠顯著提高小球藻生長及油脂含量且藻細(xì)胞可溶性蛋白產(chǎn)量比對照顯著增加了30.91%。鹽單胞菌對鹽藻生長及代謝產(chǎn)物積累的促進(jìn)作用，可能是在共培養(yǎng)過程中，鹽單胞菌產(chǎn)生或分泌更多調(diào)控微藻代謝產(chǎn)物積累相關(guān)基因的物質(zhì)，具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)為研究鹽藻與其藻際菌群互作機(jī)制和在杜氏鹽藻規(guī)?；囵B(yǎng)中應(yīng)用優(yōu)勢促生菌提高鹽藻生產(chǎn)效益提供了科學(xué)參考。

4 結(jié)論

從杜氏鹽藻藻際分離獲得5 個(gè)細(xì)菌菌群/株（B1-B5），構(gòu)建藻菌1∶1 共培體系測試表明這5 個(gè)細(xì)菌能不同程度促進(jìn)鹽藻生長，其中鹽單胞菌菌株B3 為顯著促進(jìn)鹽藻生長及β-胡蘿卜素等代謝產(chǎn)物積累的優(yōu)勢菌株。