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    鮮切香菇貯藏過程中質(zhì)構(gòu)變化與自溶自噬分析

    2020-06-09 08:45:50趙爽蘇哲谷彤彤高琪榮成博宋爽劉宇
    生物技術(shù)通報 2020年5期
    關(guān)鍵詞:自溶香菇切片

    趙爽 蘇哲 谷彤彤 高琪 榮成博 宋爽 劉宇

    (北京市農(nóng)林科學院植物保護環(huán)境保護研究所,北京 100097)

    香菇(Lentinula edodes),又名花菇、香蕈、香菌、冬菇,是我國特產(chǎn)及出口量較大的食用菌之一[1],也是市場上重要的食用菌消費品種。香菇富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多種維生素和具有免疫調(diào)節(jié)作用的香菇多糖,可以提高人體免疫力,具有防癌抗癌、降血壓血脂、抗氧化抗炎癥等藥理作用[2-5]。新鮮香菇組織含水量高,新陳代謝旺盛,容易出現(xiàn)老化、褐變等品質(zhì)下降的現(xiàn)象,目前在保鮮加工領(lǐng)域中,研究多集中于整體鮮菇保鮮技術(shù)的開發(fā),如低溫貯藏、涂膜處理、輻照除菌等,葉靜君報導低溫氣調(diào)可以減少香菇的失重率、降低多酚氧化酶的活性,減少褐變[6];李艷杰等[7]報道利用1 μL/L 1-MCP處理香菇可以保持其感官品質(zhì),防止褐變、提高氧化能力,但對于鮮切香菇加工的研究未見報道。

    食用菌鮮切是果蔬鮮切加工領(lǐng)域中的一個分支,相關(guān)的研究較為缺乏,食用菌子實體含水量高,呼吸蒸騰作用強,經(jīng)過鮮切加工后,組織會受到機械損傷,引起一系列生理生化反應,同鮮切果蔬產(chǎn)品類似,發(fā)生組織軟化、氧化褐變、風味下降、腐敗劣變等問題[8-12],同時真菌細胞在受到損傷后激發(fā)自溶自噬的程序,鮮切食用菌在環(huán)境和老化自溶機制的共同作用下,組織結(jié)構(gòu)如何變化,細胞如何消融,這一過程仍然沒有被闡明揭示。

    本研究以香菇作為原材料,根據(jù)鮮切最小加工原則,對其進行處理包裝和貯藏,通過質(zhì)構(gòu)分析結(jié)合鮮切香菇的衰老變化,研究香菇在鮮切加工后品質(zhì)劣變、老化自溶時組織微觀現(xiàn)象以及細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的改變,闡述鮮切香菇貯藏期的自噬過程,旨為鮮切香菇加工技術(shù)的保鮮與應用提供理論分析。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    香菇選用市場上常見的“0912”品種,由北京三寶香農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司提供,采摘當天挑選無機械損傷、菇形大小、菌蓋厚度、重量均一的香菇,清洗、瀝干后切根。將香菇切成3 mm 左右薄片,裝入食品密封包裝袋后封口(每袋10±0.2 g),分別置于低溫(4℃)、常溫(25℃)條件下保存,每個處理設(shè)置3 個重復,每隔2 d 取樣一次至樣品完全腐爛,將每一時間點的樣品進行處理,開展品質(zhì)以及抗氧化能力檢測。

    1.2 方法

    1.2.1 品質(zhì)指標測定

    1.2.1.1 硬度 參照Ye 等[13]的研究方法,略有改動。使用探針直徑為3 mm 的硬度計(FR-5120)測定香菇片菌蓋中心部位的硬度,每個處理進行6 次測定,取其平均值。

    1.2.1.2 失重 采用稱重法[14],記錄同一樣品在整個儲藏過程中質(zhì)量變化。

    失重率 =(貯藏前的重量-貯藏后的重量)/貯藏前的重量 ×100%

    1.2.1.3 褐變 參考王清章等[15]的方法,略有改動。將1 g 樣品加入9 mL 的蒸餾水,破碎勻漿,離心,取上清稀釋液10 倍后,測定410 nm 處的測定吸光度(A),以此用來判斷褐變程度。

    1.2.2 抗氧化能力測定 準確稱取5 g 組織樣品,按重量(g)∶體積(mL)=1 ∶9 的比例加入9 倍體積的生理鹽水,冰水浴條件下,制成10%組織勻漿液,4 000 r/min 離心10 min,取上清備用,作為待檢測樣品。

    1.2.2.1 總抗氧化能力(AOC)測定 取低溫貯藏條件下0、2、4、6、8、10、12、14 d 及常溫貯藏條件下0、2、4、6、8 d 的樣品,利用總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒(南京建成生物工程研究所)進行檢測。

    1.2.2.2 超氧化物歧化酶(SOD)測定 取低溫貯藏條件下0、2、4、6、8、10、12、14 d 及常溫貯藏條件下0、2、4、6、8 d 的樣品,利用超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)進行檢測。

    1.2.2.3 過氧化氫酶(CAT)測定 取低溫貯藏條件下0、2、4、6、8、10、12、14 d 及常溫貯藏條件下 0、2、4、6、8 d 的樣品,利用過氧化氫酶(CAT)試劑盒(南京建成生物工程研究所)進行檢測。

    1.2.3 老化自溶結(jié)構(gòu)變化

    1.2.3.1 菌絲結(jié)構(gòu)分析 對鮮切香菇和老化樣品進行取樣,選取香菇片中間、非菌褶部位,用消毒刀片切取小塊組織(0.2 cm×0.2 cm×0.1 cm),加入到2.5%的戊二醛磷酸緩沖液(GA)中固定12 h,固定后的樣品用消毒刀片切成單層組織,置于載玻片上,覆上蓋玻片后輕輕捻壓分散組織,光鏡下觀察組織形態(tài),通過計數(shù)法統(tǒng)計菌絲數(shù)量和菌絲中鎖狀聯(lián)合數(shù)量。

    1.2.3.2 細胞膜結(jié)構(gòu)分析 對鮮切香菇和老化樣品進行取樣,子實體組織用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffered saline PBS)洗滌3 次,去除GA 固定液,用10 μmol/L 細胞膜紅色熒光探針(1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate DiI)標記液浸沒組織切片,避光浸染20 min,用0.1 mol/L PBS 沖洗切片3 次,將切片置于載玻片上,覆上蓋玻片,在熒光顯微鏡下觀察細胞膜的著色情況。

    1.2.3.3 細胞核檢測分析 對鮮切香菇和不同處理的樣品進行取樣,切片,組織用0.1 mol/L PBS 洗滌3 次,用乙醇-乙酸固定液處理組織30 min,在樣品上滴加50 μL 8 mg/L 的DAPI 孵育1 h,滴加抗熒光淬滅封片液50 μL,覆上蓋玻片,在熒光顯微鏡下觀察。

    1.2.3.4 細胞內(nèi)部DNA 碎片分析 對鮮切香菇和不同處理的樣品進行取樣,切片,利用2.5%的戊二醛磷酸緩沖液(GA)固定12 h,去除GA 固定液,用0.3% 的Triton X-100 溶液孵育5 min,再用PBS 洗滌2 次,在樣品上滴加新鮮配置的TUNEL(TdT 酶5 μL,熒光標記液45 μL),37℃避光孵育1 h,用PBS 洗滌3次,滴加抗熒光淬滅封片液50 μL,覆上蓋玻片,在熒光顯微鏡下觀察。

    1.2.3.5 細胞超微結(jié)構(gòu)分析 對鮮切香菇和不同處理的樣品進行取樣,利用2.5%的戊二醛磷酸緩沖液(GA)固定12 h,采用乙醇脫水處理后,包埋于電鏡專用樹脂中,將包埋樣品送往清華大學公共檢測平臺利用透射電鏡(TEM)分析細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)變化。

    1.2.4 數(shù)據(jù)分析 所得數(shù)據(jù)均由平均值和標準偏差表示,每個處理重復3 次。利用Excel 2016 軟件進行方差分析(ANOVA),P<0.05 表示顯著性差異。

    2 結(jié)果

    2.1 鮮切香菇外觀分析

    鮮切香菇片隨著貯藏期的延長,其表觀形態(tài)明顯發(fā)生劣變。從產(chǎn)品表觀分析新鮮香菇經(jīng)過鮮切加工后貯藏初期會出現(xiàn)菇體褐變、失水干縮、菇體變軟的現(xiàn)象,說明菇體已經(jīng)開始發(fā)生明顯的生理改變以及加速老化進程;隨著貯藏期的延長,菇體表面出現(xiàn)黏膩、出水,氣味物質(zhì)發(fā)生改變的現(xiàn)象,說明此時菇體已經(jīng)開始在多種作用下發(fā)生老化消融的現(xiàn)象。通過觀察發(fā)現(xiàn)貯藏在25℃條件下,香菇切片在第8 天嚴重褐變腐爛劣變,設(shè)為實驗終點;貯藏在4℃條件下,第16 天設(shè)為實驗終點。

    2.2 不同溫度條件下鮮切香菇品質(zhì)的變化

    硬度與香菇片腐敗程度存在直接關(guān)系,是品質(zhì)的屬性之一。鮮切香菇片的硬度隨貯藏期的延長而下降(圖1),各處理組在前2 d 均表現(xiàn)出硬度顯著下降(P<0.01),其后4℃的貯藏條件相對于25℃的貯藏條件菇片軟化進程減緩,在第6 天的時候,4℃處理組硬度顯著高于25℃處理組(P<0.05)。

    圖1 不同溫度對鮮切香菇硬度的影響

    香菇經(jīng)過鮮切加工后增加了表面積,水分蒸發(fā)量增大,失水達到一定程度時,對其品質(zhì)和生理代謝都會產(chǎn)生很大的影響。在4℃和25℃的貯藏條件下,鮮切香菇的失重率隨著貯藏期的延長而增加(圖2)。由于溫度可以影響菇體內(nèi)水分的蒸發(fā),因此25℃的貯藏條件下的失重率顯著高于4℃的貯藏條件下的失重率,在第4 天時25℃處理組的失重率為8.3%,而4℃處理組的失重率僅為3%,在25℃貯藏條件的實驗終點第8 天,失重率達到了21%,4℃貯藏條件的實驗終點第16 天,失重率為14.7%。因此4℃的貯藏條件更有利減少鮮切香菇的水分流失,保持良好的外觀。

    圖2 不同溫度對鮮切香菇失重率的影響

    褐變是評價鮮切香菇品質(zhì)的指標之一。圖3 顯示,25℃貯藏組在第4 天之后褐變出現(xiàn)激增,褐變程度顯著高于4℃貯藏組(P<0.05)。相比較而言, 4℃貯藏組褐變程度平穩(wěn)變化,說明4℃的貯藏條件可以保持香菇片的顏色,減少褐變的發(fā)生。

    圖3 不同溫度對鮮切香菇褐變的影響

    2.3 不同溫度對鮮切香菇品質(zhì)抗氧化活性的影響

    由圖4 可以發(fā)現(xiàn),隨著貯藏期的延長,各種溫度條件下,香菇切片的抗氧化能力都是呈現(xiàn)下降的趨勢,其中在25℃的貯藏條件下,抗氧化能力的損失更為顯著。AOC 活性檢測結(jié)果顯示在第2、4 天時,25℃處理組的總抗氧化活性已經(jīng)顯著低于4℃處理組(P<0.05)。在第2、4 天時,CAT 活性在不同處理組間差異最大(P<0.05),4℃處理組的CAT活性分別是25℃處理組的1.4 倍和2.6 倍。SOD 活性檢測結(jié)果同樣顯示出25℃處理組的酶活性下降為迅速,在第8 天時,其活性僅為4℃處理組SOD 活性的28.5%。

    從生理生化指標分析結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn),低溫貯藏條件有利于鮮切香菇的品質(zhì)保持,低溫環(huán)境可以減少蒸騰作用,減少微生物的繁殖,減緩組織氧化的進程,從而降低了菇體的軟化、褐變和腐敗,是延長鮮切香菇貨架期的重要儲存條件。

    2.4 組織微觀結(jié)構(gòu)變化及自噬現(xiàn)象

    香菇在采收后仍然處于生命旺盛期,切片鏡下可觀測到細胞間的鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu),通過計算相同菌絲數(shù)中鎖狀聯(lián)合的比例發(fā)現(xiàn),鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)在所有細胞中占比約為25%(圖5-A)。而在老化切片中,菌絲邊緣壁膜結(jié)構(gòu)模糊不清,推測開始發(fā)生自溶自噬現(xiàn)象,未見到菌絲細胞間存在鎖狀聯(lián)合的結(jié)構(gòu),說明此時切片組織已經(jīng)老化(圖5-B)。

    圖4 不同溫度對鮮切香菇抗氧化活性的影響

    圖5 菌絲體鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)消失(400×)

    利用DiI 探針對貯藏末期的香菇片進行染色,對比光鏡下的細胞結(jié)構(gòu),可以發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)斷裂,細胞膜發(fā)生消融,已經(jīng)呈現(xiàn)出不完整的狀態(tài)(圖6),推測細胞膜的缺失與香菇片的軟化具有一定的關(guān)聯(lián)。

    圖6 DiI 標記細胞膜的缺失現(xiàn)象(400×)

    細胞在發(fā)生凋亡時,會激活一些DNA 內(nèi)切酶,這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA?;蚪MDNA 斷裂時,暴露的3′-OH 可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)的催化下加上綠色熒光探針熒光素進行標記,TUNEL 染色法也是基于此,從而標記了細胞內(nèi)斷裂的DNA 片段,通過激發(fā)后,可在515-565 nm 處檢測到綠色熒光,利用熒光顯微鏡可以觀察到細胞內(nèi)DNA 斷裂的情況。DAPI 是一種能夠與雙鏈DNA 結(jié)合的藍色熒光染料,它標記的是細胞核內(nèi)完整的DNA,此染料需要在紫外光下激活,在460 nm處檢測藍色熒光,用以表示細胞核的狀態(tài)。

    如圖7 所示,對比光鏡菌絲形態(tài),經(jīng)過TUNEL染色后,菌絲內(nèi)出現(xiàn)很多綠色的熒光亮點,說明此時菌絲體中存在大量的DNA 碎片,而DAPI 染色后,未在菌絲體中發(fā)現(xiàn)明顯的核狀著色體,說明此時的細胞中不存在細胞核。結(jié)果暗示細胞內(nèi)伴隨著DNA的斷裂,細胞核已經(jīng)消融,細胞進入到自溶自噬進程。

    圖7 熒光標記細胞核和DNA 的斷裂現(xiàn)象(400×)

    通過透射電鏡的檢測,可以直觀的觀察到細胞宏觀以及內(nèi)部的結(jié)構(gòu)形態(tài)變化,從圖8-A 中可以觀察到新鮮香菇切片細胞外層具有厚實的細胞壁,細胞內(nèi)部細胞器清晰,胞質(zhì)均勻。對比圖8-B 顯示的老化細胞,可明顯發(fā)現(xiàn)衰老細胞內(nèi)胞質(zhì)消融,胞內(nèi)液泡增大,胞壁變薄,細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。

    圖8 透射電鏡下新鮮香菇和老化香菇細胞比較

    進一步從微觀角度分析細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)變化,圖9 顯示的是細胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)。新鮮香菇切片細胞中可觀測到細胞壁厚實,胞質(zhì)均勻,內(nèi)部細胞器結(jié)構(gòu)清晰,液泡大小正常。而老化細胞形態(tài)差異較大,可見胞壁消融、缺失的現(xiàn)象,細胞發(fā)生破損,同時胞內(nèi)可見褐色沉淀,細胞顏色加深(圖9-B),部分細胞中出現(xiàn)吞噬泡,發(fā)生自體自噬現(xiàn)象(圖9-C),最終胞內(nèi)只存有大量的空泡體,細胞器消失,胞壁裂解的現(xiàn)象(圖9-D)。

    圖9 透射電鏡下超微觀結(jié)構(gòu)觀察

    3 討論

    鮮切加工技術(shù)的發(fā)展為市場提供了新鮮、營養(yǎng)、方便的食品,目前鮮切對象分為鮮切蔬菜、鮮切水果及鮮切中藥材3 大類,涉及的品種主要有生菜、馬鈴薯、西蘭花、黃瓜、菠蘿、蘋果、三七、延胡索等[16-20]。對于鮮切食用菌的研究報道為數(shù)不多,陳學玲[21]研究了次氯酸鈉、二氧化氯、過氧化氫、乙醇4 種殺菌劑對鮮切香菇品質(zhì)的影響發(fā)現(xiàn),150 mg/L NaClO 抑菌效果最佳;趙春霞[22-23]研究發(fā)現(xiàn)90%高體積分數(shù)氬氣能維持香菇的可溶性固形物含量,保持硬度和白度,同時0.5%殼聚糖+1.5%海藻酸鈉涂膜處理能夠提高氬氣的效果。目前鮮切果蔬加工技術(shù)的研究側(cè)重于清洗除菌、物理保鮮、化學涂膜保護、氣調(diào)包裝等方面的研究。針對食用菌組織脆嫩、含水量高、代謝旺盛易老化的特點,相關(guān)的基礎(chǔ)和技術(shù)研究未見報道。

    本研究通過加工破壞了香菇子實體的整體結(jié)構(gòu),增加了菌肉和菌絲與外界環(huán)境的接觸。外界的不利因素,如微生物的浸染、氧氣的氧化等,伴隨著菌體的應激自噬機制,加速了一系列的生理生化反應,使裸露組織加速劣變。品質(zhì)及抗氧化能力檢測發(fā)現(xiàn)低溫貯藏環(huán)境可以保持鮮切香菇的品質(zhì),減緩褐變的速度,降低菇體抗氧化能力的損失,延長貨架期,這一研究結(jié)果與寇莉萍等的研究一致[6]。研究發(fā)現(xiàn)在儲藏前期菇體會發(fā)生明顯的軟化,這與組織的應激損傷機制有一定的關(guān)系,激活了體內(nèi)的自噬水解酶,組織啟動了進入自噬凋亡程序,利用顯微技術(shù)也印證了自噬的特征現(xiàn)象,觀察發(fā)現(xiàn)組織細胞內(nèi)的正常生理結(jié)構(gòu)發(fā)生劣變,出現(xiàn)胞壁斷裂、胞膜消融、自噬體吞噬細胞器、大量DNA 斷裂、細胞核消失以及細胞解體等現(xiàn)象,進一步結(jié)合細胞凋亡的相關(guān)分析可以對鮮切香菇自溶自噬的現(xiàn)象進行機理層面的揭示。

    4 結(jié)論

    本研究結(jié)果顯示香菇切片在貯藏期出現(xiàn)的最主要問題是切片軟化、褐變和抗氧化活性降低,從而降低了貨架期的產(chǎn)品品質(zhì)。微觀結(jié)構(gòu)研究顯示鮮切香菇經(jīng)過機械損傷后激發(fā)了自溶自噬機制,細胞內(nèi)出現(xiàn)胞壁斷裂、胞膜消融、自噬體吞噬細胞器、大量DNA 斷裂、細胞核消失以及細胞解體等現(xiàn)象,是引發(fā)香菇片軟化重要原因之一。本研究結(jié)果展示了鮮切香菇在不同貯藏溫度下的生理生化的改變,揭示了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)需要面臨的技術(shù)問題,鮮切香菇工廠化生產(chǎn)需要在減少微生物污染、抗氧化、失水等問題上加大攻關(guān),從而提高鮮切產(chǎn)品的品質(zhì),延長產(chǎn)品的貨架期。

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