• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    姜黃素通過(guò)激活肝細(xì)胞自噬減輕脂多糖/D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷*

    2020-06-09 02:42:02謝一瀲楊乃彬王麗萍宣艷艷鄔怡怡錢國(guó)清石潔君史光俠李國(guó)祥
    中國(guó)病理生理雜志 2020年5期
    關(guān)鍵詞:素組姜黃肝臟

    謝一瀲, 楊乃彬, 王麗萍, 宣艷艷, 鄔怡怡, 錢國(guó)清, 石潔君, 史光俠, 李國(guó)祥

    (寧波市第一醫(yī)院感染科,浙江寧波315000)

    由缺血、藥物、外源性毒物及其代謝產(chǎn)物和感染等各種病因引起的急性肝損傷(acute hepatic injury,AHI)臨床上十分常見(jiàn),其病情發(fā)展迅速、兇險(xiǎn),如果未得到及時(shí)的控制和治療,將會(huì)發(fā)展為急性肝衰竭,成為危及人類生命的重要疾病之一。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)/D-氨基半乳糖(D-galactosamine,DGalN)聯(lián)合注射更能模仿人類的急性爆發(fā)性肝衰竭的發(fā)生,因此LPS/D-GalN誘導(dǎo)的動(dòng)物模型是研究急性肝損傷最常用的模型[1]。

    姜黃素(curcumin,CUR)是從香料姜黃的根莖中提取的一種酚類化合物,其藥理作用廣泛,具有抗氧化、抗炎、抗纖維化、抗腫瘤、抗菌以及調(diào)節(jié)免疫的功能,對(duì)于各類肝損傷有不同的預(yù)防或治療效果[2]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),姜黃素可通過(guò)調(diào)節(jié)自噬發(fā)揮作用。Guo等[3]報(bào)道,姜黃素能激活自噬保護(hù)細(xì)胞免受過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的損傷和減緩細(xì)胞凋亡。Yao等[4]認(rèn)為,姜黃素可通過(guò)增強(qiáng)自噬、減輕凋亡,從而改善糖尿病相關(guān)心肌病變。張豪杰等[5]研究發(fā)現(xiàn),姜黃素減輕小鼠腎臟再灌注損傷的作用可能與其促進(jìn)再灌注后細(xì)胞自噬相關(guān)。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于姜黃素對(duì)LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷影響的研究較少,我們既往的研究顯示姜黃素對(duì)LPS/D-GalN誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷有一定治療作用[6],基于此,本實(shí)驗(yàn)擬從細(xì)胞自噬的角度,探討姜黃素減輕LPS/D-GalN誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷的機(jī)制。

    材料和方法

    1 動(dòng)物

    SPF級(jí)雄性SD大鼠,購(gòu)入時(shí)6周齡,實(shí)驗(yàn)時(shí)體重為180 g左右,購(gòu)自上海斯萊克公司,購(gòu)入后在SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

    2 主要試劑

    LPS、D-GalN、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)和姜黃素均購(gòu)自Sigma;兔抗小鼠微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和beclin 1抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology;ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自eBioscience。

    3 主要方法

    3.1 急性肝損傷動(dòng)物模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 采用腹腔注射800μL的LPS(8μg/kg)及D-GalN(800 mg/kg)制造急性肝損傷動(dòng)物模型,劑量根據(jù)我們既往的研究得出[6]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組,分別為對(duì)照(control)組、AHI組、CUR組、3-MA組和3-MA+CUR組,每組6只。對(duì)照組給予等體積生理鹽水腹腔注射,其余各組均建立急性肝損傷模型;姜黃素組每天給予姜黃素溶液120 mg/kg(溶于0.5%CMC-Na),5 mL/kg灌飼大鼠1次,連續(xù)5 d后建立急性肝損傷模型,對(duì)照組、AHI組和3-MA組每天給予等體積0.5%CMC-Na灌胃5 d。3-MA組在建立急性肝損傷模型前2 h腹腔注射2.5 mg/kg 3-MA[7]。3-MA+CUR組于肝損前5天給予120 mg/kg姜黃素溶液灌飼,然后在建立急性肝損傷模型前2 h腹腔注射2.5 mg/kg 3-MA。在肝損模型建立12 h后處死大鼠并收取血及肝組織;血清存放于-80℃冰箱,病理組織樣本浸泡于4%甲醛,肝組織經(jīng)液氮瞬時(shí)冷凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱備用。

    3.2 血液生化指標(biāo)檢測(cè) 將獲得的血清采用全生化分析儀檢測(cè)大鼠血清谷丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平。

    3.3 肝組織切片病理變化的觀察 肝組織標(biāo)本于4%甲醛溶液固定后,進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片和HE染色,于正置顯微鏡下觀察肝臟組織的病理學(xué)形態(tài)變化。

    3.4 透射電鏡觀察自噬體 肝組織標(biāo)本于2.5%戊二醛磷酸緩沖液中固定后,進(jìn)行沖洗、后固定、染色、沖洗、脫水、包埋、切片,采用4%醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色,最后將染色后的超薄切片放到單孔銅網(wǎng)上,于透射電鏡下觀察。

    3.5 Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) 取0.1 mg肝臟組織,加入裂解液充分勻漿,離心后取上清液。先用雙喹啉-4-羧酸二鈉鹽蛋白分析試劑盒測(cè)定樣本內(nèi)蛋白濃度,再用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì),并轉(zhuǎn)膜。室溫下封閉1 h,搖床上洗滌5 min,移入含有I抗(抗LC3和beclin 1抗體)的孵育盒中,4℃孵育過(guò)夜。再在搖床上洗滌3次,移到含II抗(goat anti-rabbit IgG和goat anti-mouse IgG,1∶5 000稀釋)的抗體孵育盒中,于室溫?fù)u床上孵育2 h。洗滌3次后加入底物并曝光顯影。應(yīng)用生物電泳圖像分析系統(tǒng)測(cè)定條帶灰度值,以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達(dá)水平。

    3.6 腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的ELISA檢測(cè) 取保存的血清,按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α的含量。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組樣本均數(shù)之間比較采用單因素方差分析,若各組總體方差齊同,則采用SNK-q檢驗(yàn),若方差不齊,則采用Tamhane檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 各組大鼠血清ALT和AST水平

    與對(duì)照組比較,AHI組ALT和AST水平顯著升高(P<0.05);與AHI組比較,姜黃素組的ALT和AST水平顯著下降(P<0.05);與姜黃素組比較,3-MA組及3-MA+CUR組的ALT和AST水平均顯著升高(P<0.05),但與肝損傷組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05),見(jiàn)圖1。

    2 肝組織切片病理學(xué)的變化

    正常對(duì)照組肝細(xì)胞輕度水腫,未見(jiàn)明顯病變。肝損傷組可見(jiàn)約50%的肝細(xì)胞壞死,壞死的肝細(xì)胞核碎裂、胞漿深染,壞死區(qū)可見(jiàn)較多炎細(xì)胞浸潤(rùn)。姜黃素組的壞死細(xì)胞較肝損傷組顯著減少,炎細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)較輕。而3-MA組及3-MA+姜黃素組較肝損傷組無(wú)明顯變化,見(jiàn)圖2。

    Figure 1.The serum levels of ALT and AST in various groups.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group;△P<0.05,△△P<0.01 vs AHI group;#P<0.05 vs CUR group.圖1 大鼠血清ALT和AST水平的變化

    Figure 2.Pathological changes of rat liver tissues in various groups(HEstaining,×100).A:control group;B:AHIgroup;C:CUR group;D:3-MA group;E:3-MA+CURgroup.圖2 各組大鼠肝組織的病理變化

    3 電鏡下觀察自噬體的情況

    正常對(duì)照組無(wú)明顯自噬體形成,線粒體嵴和膜形態(tài)正常。AHI組可見(jiàn)較多自噬小體形成,線粒體膜、核膜和細(xì)胞膜不完整、線粒體嵴間隙加大、消失。姜黃素組可見(jiàn)大量自噬小體形成。3-MA組及3-MA+CUR組自噬體較姜黃素組明顯減少,見(jiàn)圖3。

    Figure 3.Autophagic bodies of the liver tissue were observed by transmission electron microscopy(×10 000).A:control group;B:AHIgroup;C:CURgroup;D:3-MA group;E:3-MA+CURgroup.圖3 各組大鼠肝組織的透射電鏡下自噬體的觀察

    4 各組大鼠肝組織內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3及beclin 1的表達(dá)情況

    與對(duì)照組比較,AHI組大鼠的LC3-Ⅱ及beclin 1蛋白表達(dá)量均上調(diào)(P<0.01);與AHI組比較,姜黃素組的LC3-II及beclin 1蛋白表達(dá)量均上調(diào)(P<0.01);與姜黃素組比較,3-MA組及3-MA+CUR組的LC3-II及 beclin 1蛋白表達(dá)量均顯著下降(P<0.01),見(jiàn)圖4。

    Figure 4.The protein levels of LC3 and beclin 1 in the liver tissues in variousgroupsdetected by Western blot.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group;△△P<0.01 vs AHI group;##P<0.01 vs CURgroup.圖4 肝組織自噬蛋白LC3和beclin 1蛋白水平的變化

    5 各組大鼠血清TNF-α表達(dá)情況

    AHI組大鼠血清TNF-α含量較對(duì)照組顯著升高(P<0.01);姜黃素組大鼠血清TNF-α含量較AHI組顯著下降(P<0.01);3-MA組及3-MA+姜黃素組大鼠的血清TNF-α含量較姜黃素組明顯增高(P<0.01),見(jiàn)圖5。

    討 論

    Figure5.The serum levels of TNF-αin various groups detected by ELISA.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs control group;△△P<0.01 vs AHIgroup;##P<0.01 vs CURgroup.圖5 各組大鼠血清TNF-α含量的比較

    自噬是真核生物細(xì)胞中一種高度保守的代謝途徑,負(fù)責(zé)處理受損的細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊的蛋白,并在惡劣條件下為機(jī)體提供充分的能量,因此,自噬對(duì)機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下維持細(xì)胞內(nèi)平衡、細(xì)胞生存和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起關(guān)鍵作用。此外,自噬對(duì)炎癥有著重要的調(diào)節(jié)作用,可影響炎癥疾病的病理進(jìn)程,其重要作用與肝臟、肌肉等代謝性器官密切相關(guān)[8]。

    近年來(lái)許多研究表明,自噬在LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。LPS/D-GalN作用于肝臟后,可誘導(dǎo)肝臟巨噬細(xì)胞大量釋放促炎因子引起應(yīng)激反應(yīng),過(guò)度表達(dá)的促炎因子如TNF-α、持續(xù)大量的活性氧簇(reaction oxidation species,ROS)等會(huì)造成線粒體或其它細(xì)胞器的損傷。如果受損的細(xì)胞器沒(méi)有通過(guò)適應(yīng)性反應(yīng)得到處理,就會(huì)發(fā)生細(xì)胞死亡或者凋亡。而自噬就是一種適應(yīng)性反應(yīng)。Amir[9]等發(fā)現(xiàn),在 LPS/D-GalN 誘導(dǎo)的急性肝損傷模型中,抑制肝臟特異性自噬會(huì)加重TNF-α誘導(dǎo)的肝損傷;Ilyas等[10]在巨噬細(xì)胞特異性敲除Atg5模型中,用LPS/D-GalN注射,刺激急性肝損傷小鼠中發(fā)現(xiàn)敲除組小鼠肝損傷較對(duì)照組加重,依賴炎性小體產(chǎn)生的血清白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)顯著增加,提示敲除組小鼠炎癥小體活性增加,故加重了急性肝損傷。魏琳琳等[11]也發(fā)現(xiàn),在LPS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠急性肝衰竭的早中期,肝細(xì)胞自噬逐漸增強(qiáng),可能起保護(hù)性作用。以上研究均提示自噬參與LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷的調(diào)控,并在其中發(fā)揮保護(hù)作用。

    目前觀察自噬現(xiàn)象最直接、最經(jīng)典的方法是通過(guò)透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)自噬體,這是自噬檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。而LC3和beclin 1是反映自噬水平的最常用的蛋白。LC3是重要細(xì)胞骨架輔助成分,分為L(zhǎng)C3-I和LC3-Ⅱ,自噬發(fā)生時(shí)LC3-I經(jīng)泛素樣加工,與自噬膜表面的脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ,LC3-Ⅱ被募集并定位于自噬體膜上,直至自噬體和溶酶體相融合[5]。大量研究表明,beclin 1參與自噬體的形成,它能介導(dǎo)其他自噬蛋白定位于自噬前體,在自噬中起重要作用。beclin還可調(diào)節(jié)液泡分選蛋白34(valuolar protein sorting 34,Vps-34),誘導(dǎo) beclin-Vps34-Vps15核心復(fù)合體形成,從而促進(jìn)自噬[12]。LC3和beclin 1表達(dá)水平的增高常提示自噬活性的增高,因此本研究選擇觀察這兩種蛋白來(lái)評(píng)估自噬水平。

    我們的研究結(jié)果顯示,LPS/D-GalN可引起大鼠急性肝損傷,表現(xiàn)為ALT和AST的升高,病理?yè)p傷程度的加重,電鏡顯示自噬體有所增多,Western blot顯示自噬相關(guān)蛋白LC3和beclin 1的表達(dá)增強(qiáng),自噬的增強(qiáng)可能與肝細(xì)胞的自我保護(hù)反應(yīng)有關(guān);應(yīng)用姜黃素后,肝臟功能得到明顯改善,組織病理?yè)p傷程度減輕,提示姜黃素對(duì)肝臟起保護(hù)作用,同時(shí)發(fā)現(xiàn)自噬體進(jìn)一步增多,細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng),提示肝組織中存在活躍的自噬;3-MA作為I型磷脂酰肌醇3激酶通路抑制劑,可抑制自噬的起始階段以及自噬小體的形成,應(yīng)用自噬抑制劑3-MA后,姜黃素的促進(jìn)自噬作用被其阻滯,其對(duì)肝臟的保護(hù)作用也隨之消失。這些結(jié)果表明,姜黃素可能通過(guò)激活自噬減輕LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷。

    Zhao等[13]研究發(fā)現(xiàn),在膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷中,自噬可降低促炎因子TNF-α、IL-6和IL-8的表達(dá);而Liu等[14]發(fā)現(xiàn),抑制自噬會(huì)使炎癥介質(zhì)IL-1β、TNF-α、IL-6等增加,減弱抗炎效應(yīng);孫健等[15]的研究也提到,上調(diào)細(xì)胞自噬會(huì)抑制NF-κB蛋白的水平,增加其對(duì)炎癥細(xì)胞因子的抑制作用;而抑制自噬則導(dǎo)致NF-κB蛋白水平增加,并減弱其對(duì)炎癥細(xì)胞因子生成的抑制作用。以上研究均提示,自噬可能參與了對(duì)炎癥因子水平的調(diào)控過(guò)程。本研究中,姜黃素組自噬蛋白較AHE組增加,促炎因子TNF-α的表達(dá)水平顯著低于AHI組,而加入自噬抑制劑3-MA后則逆轉(zhuǎn)了姜黃素的作用,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

    綜上所述,姜黃素對(duì)LPS/D-GalN誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷肝臟的保護(hù)作用可能與其促進(jìn)自噬減輕炎癥反應(yīng)相關(guān),但仍需進(jìn)一步深入的研究。

    猜你喜歡
    素組姜黃肝臟
    七種行為傷肝臟
    中老年保健(2022年4期)2022-11-25 14:45:02
    肝臟里的膽管癌
    肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:49:00
    魚藤素對(duì)急性髓系白血病KG-1a細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制
    姜黃素對(duì)脂多糖/D-氨基半乳糖誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響
    肝臟減負(fù)在于春
    Curcumin in The Treatment of in Animals Myocardial ischemia reperfusion: A Systematic review and Meta-analysis
    姜黃素對(duì)缺血再灌注大鼠肺組織壞死性凋亡的影響
    姜黃提取物二氧化硅固體分散體的制備與表征
    中成藥(2018年2期)2018-05-09 07:19:43
    姜黃素對(duì)人胃癌AGS細(xì)胞自噬流的作用
    中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:37
    IL-17A促進(jìn)肝部分切除后IL-6表達(dá)和肝臟再生
    美女 人体艺术 gogo| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产精品免费视频内射| 亚洲专区国产一区二区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 此物有八面人人有两片| 久久人人精品亚洲av| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 免费在线观看影片大全网站| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 成年版毛片免费区| 精品福利观看| 亚洲电影在线观看av| 免费少妇av软件| 丝袜美腿诱惑在线| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲av成人一区二区三| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 女人精品久久久久毛片| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 午夜福利18| 国产成人精品在线电影| 国产97色在线日韩免费| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 午夜免费成人在线视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 美女 人体艺术 gogo| 黄色毛片三级朝国网站| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲中文av在线| 中文字幕人妻熟女乱码| 午夜免费鲁丝| 久久人人97超碰香蕉20202| 99在线人妻在线中文字幕| 99热只有精品国产| 国产三级黄色录像| 国产精品 国内视频| 亚洲欧美激情综合另类| 成人18禁在线播放| 国产亚洲精品一区二区www| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久久久久人人人人人| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 88av欧美| 久久中文字幕人妻熟女| 久久精品91无色码中文字幕| 人人澡人人妻人| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久天堂一区二区三区四区| 91国产中文字幕| 黑人欧美特级aaaaaa片| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 变态另类丝袜制服| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲一区中文字幕在线| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 久久久国产成人免费| 久久中文看片网| 波多野结衣高清无吗| 一进一出抽搐gif免费好疼| 免费无遮挡裸体视频| 97人妻天天添夜夜摸| av在线播放免费不卡| 亚洲av熟女| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产免费男女视频| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲国产精品成人综合色| 成人三级做爰电影| 国产精品亚洲一级av第二区| 黄色视频不卡| 首页视频小说图片口味搜索| 国语自产精品视频在线第100页| 国产主播在线观看一区二区| 成人手机av| 久久人妻av系列| 一区二区三区激情视频| 欧美日本中文国产一区发布| 一区在线观看完整版| 免费在线观看日本一区| 国产高清视频在线播放一区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| www.精华液| 国产精品免费视频内射| 国产黄a三级三级三级人| av福利片在线| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 男人舔女人下体高潮全视频| 精品欧美国产一区二区三| 黑人欧美特级aaaaaa片| 精品人妻1区二区| 免费看美女性在线毛片视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 麻豆成人av在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 一级作爱视频免费观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 午夜福利一区二区在线看| 日韩高清综合在线| 国产精品野战在线观看| 免费少妇av软件| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 天堂影院成人在线观看| 男人舔女人的私密视频| 大型av网站在线播放| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲三区欧美一区| 黑丝袜美女国产一区| 在线av久久热| 午夜激情av网站| 国产私拍福利视频在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 超碰成人久久| 91精品三级在线观看| 操出白浆在线播放| 色婷婷久久久亚洲欧美| 老汉色av国产亚洲站长工具| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 一区福利在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久国产亚洲av麻豆专区| 91成人精品电影| 大型av网站在线播放| 亚洲天堂国产精品一区在线| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲无线在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 999久久久国产精品视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| av片东京热男人的天堂| 欧美成人午夜精品| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 最新在线观看一区二区三区| 国产精品免费视频内射| 久久久精品欧美日韩精品| 首页视频小说图片口味搜索| 国产午夜福利久久久久久| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产精品电影一区二区三区| 国产三级在线视频| 亚洲黑人精品在线| 久久人妻av系列| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产伦人伦偷精品视频| 国产单亲对白刺激| 看黄色毛片网站| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 少妇 在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 国产一级毛片七仙女欲春2 | 久久精品影院6| 高清毛片免费观看视频网站| 人妻久久中文字幕网| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲精华国产精华精| 人人澡人人妻人| av天堂在线播放| cao死你这个sao货| 色综合婷婷激情| 国产一区在线观看成人免费| 国产麻豆成人av免费视频| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产精品久久久人人做人人爽| 成年人黄色毛片网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 可以在线观看的亚洲视频| 天天一区二区日本电影三级 | 亚洲午夜理论影院| av欧美777| 99在线视频只有这里精品首页| 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 精品久久蜜臀av无| 午夜视频精品福利| 日韩欧美免费精品| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 天堂影院成人在线观看| 美女免费视频网站| 可以在线观看的亚洲视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产黄a三级三级三级人| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲一区二区三区色噜噜| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 日本三级黄在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 成在线人永久免费视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产熟女午夜一区二区三区| 制服丝袜大香蕉在线| 精品熟女少妇八av免费久了| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 一级毛片高清免费大全| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产午夜精品久久久久久| 国产熟女午夜一区二区三区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产一区二区三区视频了| 免费看a级黄色片| 精品乱码久久久久久99久播| 91国产中文字幕| 黄色a级毛片大全视频| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲久久久国产精品| 1024视频免费在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 身体一侧抽搐| 母亲3免费完整高清在线观看| 免费在线观看日本一区| 中文字幕人成人乱码亚洲影| av片东京热男人的天堂| 精品国产亚洲在线| 久久久久久久久久久久大奶| av电影中文网址| 日本精品一区二区三区蜜桃| 少妇的丰满在线观看| 国产成人欧美| 国产成人影院久久av| 国产精品亚洲美女久久久| 免费在线观看完整版高清| 亚洲免费av在线视频| 在线观看www视频免费| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲精品av麻豆狂野| 午夜a级毛片| 久久这里只有精品19| 久久国产精品影院| av在线天堂中文字幕| 两个人看的免费小视频| 亚洲片人在线观看| 中出人妻视频一区二区| 999久久久国产精品视频| 久久久久国内视频| 手机成人av网站| 露出奶头的视频| 午夜久久久久精精品| 91成人精品电影| 欧美色视频一区免费| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 国产亚洲精品av在线| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 成人亚洲精品av一区二区| ponron亚洲| 日韩高清综合在线| 97人妻天天添夜夜摸| 99国产综合亚洲精品| 午夜免费鲁丝| 99热只有精品国产| 欧美国产日韩亚洲一区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 麻豆久久精品国产亚洲av| 电影成人av| 午夜福利影视在线免费观看| 久久久久久大精品| 国产精品野战在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 午夜影院日韩av| 99香蕉大伊视频| 精品不卡国产一区二区三区| 一级片免费观看大全| 欧美乱码精品一区二区三区| 露出奶头的视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 岛国视频午夜一区免费看| 精品久久久久久成人av| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 免费在线观看亚洲国产| 日韩精品青青久久久久久| 久久亚洲真实| 国产精品电影一区二区三区| 高清在线国产一区| 国产片内射在线| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 两个人视频免费观看高清| 午夜成年电影在线免费观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲第一青青草原| 亚洲人成电影免费在线| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 免费看十八禁软件| 一级毛片女人18水好多| 波多野结衣一区麻豆| 正在播放国产对白刺激| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 美女午夜性视频免费| 青草久久国产| 午夜两性在线视频| 十八禁人妻一区二区| 欧美日韩精品网址| 男女下面插进去视频免费观看| 黑人操中国人逼视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美一级a爱片免费观看看 | 日韩欧美一区二区三区在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 两人在一起打扑克的视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 成人手机av| 一边摸一边做爽爽视频免费| 午夜免费激情av| www日本在线高清视频| 天天添夜夜摸| netflix在线观看网站| 国产一区二区激情短视频| 欧美一级a爱片免费观看看 | 一进一出好大好爽视频| av天堂久久9| 午夜a级毛片| 婷婷丁香在线五月| 国产又爽黄色视频| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲国产精品999在线| 国内精品久久久久久久电影| 免费看a级黄色片| 久久这里只有精品19| 亚洲专区中文字幕在线| 无人区码免费观看不卡| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 免费不卡黄色视频| 无遮挡黄片免费观看| 两人在一起打扑克的视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 日本vs欧美在线观看视频| 日韩免费av在线播放| 香蕉国产在线看| 在线观看www视频免费| www.www免费av| 欧美日韩精品网址| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产精品亚洲一级av第二区| 青草久久国产| 亚洲国产欧美日韩在线播放| bbb黄色大片| 成人av一区二区三区在线看| 欧美乱妇无乱码| 在线观看www视频免费| 男人的好看免费观看在线视频 | 少妇熟女aⅴ在线视频| av在线天堂中文字幕| 韩国av一区二区三区四区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 免费高清在线观看日韩| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产伦人伦偷精品视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 成人特级黄色片久久久久久久| 黄片大片在线免费观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 女警被强在线播放| 男人舔女人的私密视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产野战对白在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 一级a爱片免费观看的视频| 91麻豆av在线| 少妇被粗大的猛进出69影院| 中文字幕最新亚洲高清| 91精品三级在线观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产午夜精品久久久久久| 国产1区2区3区精品| 久久香蕉国产精品| 国产熟女xx| 日本免费a在线| 色婷婷久久久亚洲欧美| 中国美女看黄片| 午夜两性在线视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲伊人色综图| 十分钟在线观看高清视频www| 村上凉子中文字幕在线| 欧美成人免费av一区二区三区| 免费少妇av软件| www.精华液| 黄色女人牲交| 人人澡人人妻人| 亚洲熟妇熟女久久| 中文字幕高清在线视频| 亚洲av电影在线进入| 一本综合久久免费| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 国产亚洲精品一区二区www| 国产免费av片在线观看野外av| e午夜精品久久久久久久| 亚洲五月色婷婷综合| 深夜精品福利| 国产97色在线日韩免费| 亚洲精品中文字幕在线视频| 两个人视频免费观看高清| 国产成人免费无遮挡视频| 搡老岳熟女国产| 黄色片一级片一级黄色片| 女性被躁到高潮视频| 一级a爱视频在线免费观看| 久久中文看片网| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲最大成人中文| 黄色视频不卡| 91大片在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 后天国语完整版免费观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲第一青青草原| 成人三级做爰电影| 村上凉子中文字幕在线| 免费观看人在逋| 久久精品国产综合久久久| 久久久国产精品麻豆| 久久人妻av系列| 久久狼人影院| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 老司机靠b影院| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲五月婷婷丁香| 成人国产综合亚洲| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品久久久av美女十八| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产精品九九99| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 97人妻天天添夜夜摸| 久久精品人人爽人人爽视色| 美女国产高潮福利片在线看| 久久久久久大精品| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 丁香欧美五月| 99香蕉大伊视频| 757午夜福利合集在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 久久午夜综合久久蜜桃| 99re在线观看精品视频| 免费在线观看亚洲国产| 欧美日韩黄片免| 亚洲精华国产精华精| 亚洲最大成人中文| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 男人舔女人下体高潮全视频| 精品欧美一区二区三区在线| 丰满的人妻完整版| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲九九香蕉| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 在线视频色国产色| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 99re在线观看精品视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲国产精品999在线| 欧美黄色淫秽网站| av天堂在线播放| 女警被强在线播放| 动漫黄色视频在线观看| 日韩大码丰满熟妇| 欧美日韩精品网址| 亚洲黑人精品在线| 手机成人av网站| 欧美在线一区亚洲| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 丁香六月欧美| АⅤ资源中文在线天堂| 精品久久蜜臀av无| 999精品在线视频| 好男人在线观看高清免费视频 | 国产av一区在线观看免费| 国产主播在线观看一区二区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 在线播放国产精品三级| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 在线观看一区二区三区| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲精品在线美女| 国产97色在线日韩免费| 亚洲成人国产一区在线观看| 韩国av一区二区三区四区| 18美女黄网站色大片免费观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 精品久久久久久成人av| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 日韩国内少妇激情av| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲精品一区av在线观看| 正在播放国产对白刺激| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 亚洲成av片中文字幕在线观看| 咕卡用的链子| 一本久久中文字幕| 亚洲精品一区av在线观看| 午夜久久久久精精品| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产精品亚洲一级av第二区| e午夜精品久久久久久久| 精品国产美女av久久久久小说| 丝袜美足系列| 麻豆av在线久日| 嫩草影视91久久| 欧美中文综合在线视频| 久久久久久国产a免费观看| 老司机在亚洲福利影院| 无人区码免费观看不卡| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产男靠女视频免费网站| 高清在线国产一区| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲人与动物交配视频| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 99久久九九国产精品国产免费| av女优亚洲男人天堂| 午夜a级毛片| 波多野结衣巨乳人妻| videossex国产| 亚洲真实伦在线观看| 99久久成人亚洲精品观看| 国产黄a三级三级三级人| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产成人aa在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 在线播放无遮挡| 午夜福利视频1000在线观看| 色在线成人网| 极品教师在线视频| 亚洲美女视频黄频| 亚洲在线自拍视频| 欧美一区二区国产精品久久精品| 中文字幕高清在线视频| 偷拍熟女少妇极品色| 国内精品一区二区在线观看| 国产精品久久视频播放| av.在线天堂| 国产精品一区www在线观看 | x7x7x7水蜜桃| 美女大奶头视频| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 久久中文看片网| 久久国产精品人妻蜜桃| 男女边吃奶边做爰视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 国产精品99久久久久久久久| 69av精品久久久久久| 日本黄色视频三级网站网址| 精品人妻熟女av久视频| 色在线成人网| 日本三级黄在线观看| 天堂动漫精品| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| av天堂中文字幕网| 国产淫片久久久久久久久| 午夜福利在线在线| 成人亚洲精品av一区二区| 国产精品免费一区二区三区在线| 美女被艹到高潮喷水动态| 偷拍熟女少妇极品色| 国产精品1区2区在线观看.| 国内精品宾馆在线| 亚洲精品在线观看二区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 美女黄网站色视频| 色综合婷婷激情| 岛国在线免费视频观看| 久久热精品热| 最近最新中文字幕大全电影3| 极品教师在线免费播放| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 最近最新中文字幕大全电影3| 日日干狠狠操夜夜爽| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲在线观看片| 久久亚洲真实| 亚洲自拍偷在线| 日韩一区二区视频免费看| 久久久久九九精品影院| 少妇被粗大猛烈的视频|