上皮鈉通道在相關(guān)呼吸系統(tǒng)疾病中的研究進展*

張 穎， 李 敏， 高力揚

（寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏銀川750021）

上皮鈉通道（epithelial sodium channel，ENaC）是一種非電壓依賴性的離子通道，是上皮細胞主要的Na+轉(zhuǎn)運通道之一，屬于 ENaC/退化蛋白（degenerin）超家族［1-2］。ENaC對阿米洛利敏感，主要分布于人體肺部［3］、腎臟［4］、結(jié)腸、生殖道［5］及中樞神經(jīng)系統(tǒng)［6］等多種組織的上皮細胞，能夠控制Na+進入上皮細胞，對穩(wěn)定細胞內(nèi)Na+濃度及維持細胞滲透平衡具有重要作用［7］。

細胞內(nèi)外液體滲透平衡是維持細胞正常生理功能的基礎(chǔ)，這種平衡取決于細胞內(nèi)外的相對滲透壓和膜的滲透性［8］，而人體細胞內(nèi)液和細胞外液的滲透壓主要取決于電解質(zhì)如Na+、K+、Cl-及HCO3-等的濃度，其中Na+是細胞外液滲透壓的主要決定因素［9］，一旦Na+在細胞內(nèi)外轉(zhuǎn)運失衡，機體會出現(xiàn)一系列的病變。ENaC作為重要的Na+通道，其與各類疾病的相關(guān)性引起了人們的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)有研究表明ENaC與心血管系統(tǒng)（如原發(fā)性高血壓）［10-12］、呼吸系統(tǒng)（如囊性纖維化）［13-14］、泌尿系統(tǒng)（如假性低醛固酮癥）［15-16］及生殖系統(tǒng)（如早產(chǎn)）［5，17］等相關(guān)多種疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要聯(lián)系。ENaC與呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病如囊性纖維化、哮喘及慢性阻塞性肺病等的關(guān)系尤為密切。本文從ENaC的結(jié)構(gòu)和功能、在呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機制及以ENaC為靶點的治療藥物和新方法等方面對近年來國內(nèi)外的相關(guān)研究進行綜述，旨在系統(tǒng)認(rèn)識ENaC在呼吸系統(tǒng)疾病中的調(diào)控機制，從而為開發(fā)相關(guān)疾病的治療藥物及手段提供參考資料。

1 ENaC概述

1.1 ENaC種類及分布 ENaC是ENaC/degenerin超家族的成員之一［2］，在肺魚目（肺魚）、四足類（青蛙和蟾蜍）等多個物種里均有表達［18］，其中人ENaC有α、β、γ及δ共4種亞基，分別由SCNN1A、SCNN1B、SCNN1G及SCNN1D基因所編碼［19］。ENaC的4種亞基都具有保守結(jié)構(gòu)，這種保守結(jié)構(gòu)有2個嵌入細胞膜的跨膜片段（transmembrane segments，TM），分別稱為TM1和TM2［20］。各亞基的氨基（―NH2）和羧基（―COOH）末端位于細胞內(nèi)，分別與TM1和TM2連接，胞外含有每個亞基大約70%氨基酸的片段［21］（圖1）。ENaC的α亞基具有多種亞型，是構(gòu)成ENaC的功能性單位［21］；β亞基是一類高度糖基化的蛋白，是構(gòu)成ENaC的輔助單位［20］；γ亞基的作用在于對ENaC的特定位點進行剪切，從而調(diào)節(jié)其活性［7］。大規(guī)模芯片和高通量RNA測序結(jié)果顯示：α、β及γ亞基不僅在腎、肺和結(jié)腸有高水平的表達，在生殖道、食道、皮膚、甲狀腺和舌頭等部位也有不同程度的表達（詳細表達圖譜可在https：//www.ebi.ac.uk/gxa/home獲取）［22］。δ亞基在人腦、胰腺、睪丸和卵巢中的表達水平較高，而在腎臟和肺中的表達水平很低，其具體功能尚不明確，需要進一步的研究［18］。一個具有完整功能性的ENaC通道通常由α、β和γ亞基或者δ、β和γ亞基組成異源三聚體結(jié)構(gòu)［23-24］（除此之外也存在其它組合方式［25-26］）。不同亞基聚集形成的通道呈現(xiàn)出不同的功能，例如：由α、β和γ亞基聚集形成的通道大量分布在腎臟、肺及結(jié)腸等部位，能夠高效吸收轉(zhuǎn)運Na+［27］；而δ、β 和γ亞基組成的通道在神經(jīng)組織有較多分布［18］，其具體生理病理功能尚未被闡明。

Figure 1.Schematic diagram of the transmembrane structure of the ENaCsubunit.圖1 ENaC亞基跨膜結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 ENaC的功能及調(diào)節(jié)機制 ENaC的基本功能是控制細胞內(nèi)Na+濃度，維持細胞內(nèi)外滲透壓平衡。ENaC所在的組織部位不同，其發(fā)揮的生理作用不同。例如：遠端腎單位處的ENaC能夠調(diào)節(jié)細胞外液量和腎臟中K+的分泌［28］；在女性生殖道中，ENaC在生殖周期調(diào)節(jié)子宮液的吸收［29-30］；分布于血管內(nèi)皮細胞中的ENaC可以參與血壓的調(diào)節(jié)［12］。除此之外，ENaC對呼吸系統(tǒng)微環(huán)境的穩(wěn)定具有極其重要的影響。肺部微環(huán)境中，肺泡薄液層的水鹽平衡是維持肺部正常氣體交換的先決條件［31］。如果未能及時吸收足夠的鹽和水會使得肺內(nèi)液體從間質(zhì)過度移動到肺泡腔，引起肺部水腫，從而引發(fā)一系列肺部疾病。目前，已報道的肺泡上皮細胞跨膜離子通道主要有ENaC、鈉鉀泵（Na+/K+ATPase）、水通道蛋白（aquaporins，AQPs）和囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）。其中，Na+通過 ENaC 頂端進入上皮細胞中［7］，通過Na+/K+ATPase從基底外側(cè)泵出肺泡上皮細胞［32］，AQPs和CFTR主要調(diào)節(jié)細胞中H2O和Cl-的平衡［33-35］。肺泡上皮細胞水鹽平衡調(diào)節(jié)的示意圖如圖2所示。作為重要的Na+轉(zhuǎn)運通道，ENaC與Na+/K+ATPase等其它離子通道協(xié)同維持著肺部微環(huán)境的穩(wěn)定。

Figure 2.Schematic diagram of regulation of water-salt balance in alveolar epithelial cells.ENaC：epithelial sodium channel；AQP5：aquaporin 5；CFTR：cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.圖2 肺泡上皮細胞水鹽平衡調(diào)節(jié)的示意圖

ENaC的功能受諸多因素的影響，如ENaC蛋白磷酸化、泛素化或改變ENaC在細胞膜上的數(shù)量等都可以調(diào)控ENaC的鈉轉(zhuǎn)運效率。細胞內(nèi)活性氧升高會使ENaC內(nèi)化增加導(dǎo)致轉(zhuǎn)運效率降低［36］。大量研究表明，呈革蘭氏陽性的胞內(nèi)菌單增李斯特菌可以通過增加PKC-α表達的方式抑制H441細胞中ENaC-α 的表達及功能［37］。促炎消退介質(zhì)maresin 1可以通過增強ENaC和鈉鉀ATP酶活性的方式調(diào)節(jié)肺水清除，緩解LPS引起的急性肺損傷［38］。肺炎鏈球菌溶血素可以通過募集TNF來源的TIP肽來調(diào)控ENaC蛋白磷酸化狀態(tài)，從而抑制肺水清除，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的肺泡-毛細血管屏障功能損傷［39］。高碳酸血癥會通過促進ENaC-β的磷酸化、多泛素化和ENaC蛋白內(nèi)吞，影響ENaC在細胞表面的穩(wěn)定性［40］。而且，ENaC亞基的胞外結(jié)構(gòu)域可受多種調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)，例如泛素蛋白連接酶 Nedd4L［41］、血清/糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶1（serum/glucocorticoid regulated kinase 1，SGK1）［42］等。另有研究顯示細胞可以通過內(nèi)吞作用減少ENaC在細胞膜上的分布［43］，從而降低其功能。綜上所述，通常情況下ENaC的鈉轉(zhuǎn)運效率主要從以下水平進行調(diào)節(jié)：（1）調(diào)節(jié)ENaC亞基基因表達量；（2）通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)從細胞信號方面對通道活性進行調(diào)控；（3）調(diào)節(jié)ENaC蛋白在細胞膜和細胞質(zhì)中的分布。這些調(diào)控方式涉及通道蛋白的合成、運輸、插入細胞質(zhì)膜、降解等過程［44］。

2 ENaC與相關(guān)呼吸系統(tǒng)疾病

2.1 囊性纖維化（cystic fibrosis，CF） CF是一種常見的肺部疾病，由CFTR突變引起［45］，其癥狀為氣道表面液體（airway surface liquid，ASL）脫水，黏液在氣道中積聚，成為病原菌反復(fù)感染的場所以及產(chǎn)生長期的呼吸道炎癥［45］。有研究顯示在小鼠體內(nèi)過表達ENaC，小鼠氣道上皮會加速ASL脫水，導(dǎo)致黏液清除功能受損［46］，而抑制CF肺病模型中ENaC的活性可恢復(fù)ASL的水合作用并增強黏膜纖毛轉(zhuǎn)運速率，緩解CF癥狀［47］。

ENaC可以被泛素連接酶Nedd4L泛素化并被快速內(nèi)化和降解［41］。Butterworth等［48］研究表明，抑制去泛素化酶（deubiquitinases，DUBs）會減少細胞表面的ENaC。Kimura等［41］發(fā)現(xiàn)敲除 Nedd4L后的小鼠，其肺上皮中的ENaC蛋白水平升高，且該小鼠肺部表現(xiàn)出CF的特征，以上結(jié)果提示CF發(fā)病機制與ENaC蛋白表達量有重要聯(lián)系。有研究證明cAMP/PKA復(fù)合物可以通過Nedd4L來調(diào)節(jié)ENaC［49］，而CFTR會影響ENaC對cAMP/PKA的敏感性，CFTR存在時cAMP/PKA抑制ENaC，CFTR不存在時激活ENaC［50-51］。短腭肺鼻上皮克隆 1（short palate lung and nasal epithelial clone 1，SPLUNC1）是一種約25 kD的分泌蛋白，可在細胞外與ENaC結(jié)合抑制ENaC活性防止ASL脫水［52］，當(dāng)SPLUNC1表達降低時，CF患者病情加重［53］。此外，ENaC通過改變離子穩(wěn)態(tài)在驅(qū)動CF炎癥過程中也發(fā)揮著作用。Scambler等［54］檢測到具有CF突變的人支氣管上皮細胞和單核細胞中NLRP3依賴性IL-1β或IL-18分泌增加，進一步研究顯示ENaC介導(dǎo)的Na+轉(zhuǎn)運失調(diào)會改變Na+/K+濃度梯度，從而增強K+外排和下游NLRP3炎性體激活，并且ENaC的β亞基在細胞中的過度表達增加了NLRP3依賴性的IL-18分泌，使用ENaC抑制劑處理CF突變細胞后抑制了CF中的炎癥因子的表達，所有結(jié)果提示了存在ENaC影響CF炎癥的特定ENaCNLRP3信號軸。

基于ENaC在CF中的重要作用，已有大量研究將ENaC作為治療CF的靶標(biāo)。通過使用反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）［55］、靶向 siRNA［56］及其它干擾ENaC亞基基因表達或ENaC活性的分子［32］，均可顯著緩解CF的癥狀，這也從另一方面顯示出ENaC在CF發(fā)病機制中的重要性。除此之外，還可通過增強Nedd4L活性、開發(fā)SPLUNC1分子模擬物等方法為治療囊性纖維化提供新方向。

2.2 哮喘（asthma） 哮喘是一種慢性炎癥性氣道疾病，通常由于氣道受過敏原、感染等異質(zhì)性刺激引起。常出現(xiàn)氣道阻塞、黏液分泌過多及氣道高反應(yīng)性（airway hyperresponsiveness，AHR）等癥狀［57］。哮喘患者病情加重時，上皮細胞黏液分泌增多會導(dǎo)致氣道堵塞，嚴(yán)重時甚至危及生命［58-59］。位于氣道上皮的ENaC可以通過向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運Na+來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外的相對滲透壓，創(chuàng)造一個滲透梯度以促進氣道液體的吸收［60］。Mall等［46］觀察到，在轉(zhuǎn)基因過表達ENaC的小鼠體內(nèi)會出現(xiàn)ASL脫水，黏液清除功能受損的現(xiàn)象，并且還伴隨氣道阻塞和炎癥［61］等癥狀。Anagnostopoulou等［62］研究表明，過敏性炎癥會抑制ENaC介導(dǎo)的Na+轉(zhuǎn)運，降低上皮細胞對氣道液體的吸收。ENaC的亞細胞定位結(jié)果顯示其定位于氣道上皮細胞的纖毛上，在維持纖毛的清除功能方面具有重要作用［63-64］。Fritzsching等［65］以黏液纖毛清除受損的ENaC-β轉(zhuǎn)基因（Scnn1b-Tg）小鼠為動物模型，使用過敏原處理小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Scnn1b-Tg幼鼠呼吸道對過敏原的清除能力顯著降低，氣道嗜酸性粒細胞增多，并且小鼠氣道上皮細胞、巨噬細胞、2型先天淋巴樣細胞和Th2細胞中IL-13表達水平升高，AHR增強。AHR會導(dǎo)致患者反復(fù)出現(xiàn)呼吸短促、咳嗽和喘息癥狀。這說明ENaC在維持黏液纖毛清除功能及在哮喘的發(fā)病機制中扮演了重要角色。由此可見，在哮喘的發(fā)病機制中ENaC能夠影響氣道上皮對ASL的分泌和吸收，能夠維持上皮纖毛對過敏原的清除功能，具有成為治療哮喘靶標(biāo)的潛在意義。

2.3 急性肺損傷（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘 迫 綜 合 征（acute respiratory distress syndrome，ARDS） ALI/ARDS是指由非心源性原因?qū)е路蚊氀軆?nèi)皮和肺泡上皮損傷，血管通透性增加的臨床綜合征，表現(xiàn)為急性進行性加重的呼吸困難、低氧血癥及肺水腫，早期為ALI，發(fā)展嚴(yán)重時即為ARDS［66］。目前已有多項研究表明 ENaC與 ALI/ARDS的發(fā)病過程密切相關(guān)，且ENaC被認(rèn)為是限制肺水腫期間肺泡液清除率（alveolar fluid clearance，AFC）的關(guān)鍵因素。SGK1可促進ENaC的α、β和γ亞基表達，對減輕肺水腫具有重要意義。有研究證明，羅格列酮可以通過PPARγ/SGK1依賴性信號通路降低支氣管肺泡灌洗液中的TNF-α和IL-1β的水平，促進ALI模型小鼠中ENaC的表達并增強AFC，顯著減輕肺水腫的癥狀［42］。Zhu等［67］研究發(fā)現(xiàn)胰島素可以通過促進ALI模型大鼠中SGK1磷酸化，激活并上調(diào)ENaC的表達，進一步的研究發(fā)現(xiàn)胰島素是通過PI3K/SGK1 途 徑［68］和 mTORC2/SGK1［69］途 徑 上 調(diào)ENaC表達從而改善肺水腫癥狀。隨后，Deng等［70］觀察到胰島素還可以通過抑制Nedd4L，增加依賴于PI3K/Akt途徑的ENaC表達，減輕肺水腫并增強AFC。而 Qi等［71］實驗結(jié)果顯示，17β-雌二醇通過PI3K/Akt/SGK1信號傳導(dǎo)途徑升高ENaC-α表達和抑制炎癥，在一定程度上緩解肺水腫。這說明SGK1有望成為改善ENaC功能的間接靶點。此外，在急性肺損傷期間產(chǎn)生的缺氧癥狀及過度分泌的炎癥因子如TNF-α、IL-1β等會抑制ENaC的離子轉(zhuǎn)運效率從而加重ALI/ARDS的癥狀［72］。

2.4 慢性阻塞性肺?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD） COPD是氣道長期受刺激物如香煙煙霧［73］等刺激，出現(xiàn)上皮細胞損傷，肺毛細血管破壞，上皮細胞加速衰老，氣道重塑等現(xiàn)象并最終導(dǎo)致肺功能喪失的疾?。?4］，氣道黏液阻塞和持續(xù)的炎癥是該病的重要特征［75-76］。在COPD患者氣道中，ENaC異常導(dǎo)致氣道表面脫水，ASL量減少，并損害黏液淤積和清除。李雯等［77］探究了ENaC在COPD發(fā)病機理中的作用，通過檢測從患者體內(nèi)分離的支氣管上皮細胞，發(fā)現(xiàn)COPD患者上皮細胞中α和γ亞基顯著升高，表明ENaC可能在COPD的發(fā)病中起關(guān)鍵作用。Rab等［13］將成年SCNN1B敲除小鼠和野生型同窩幼仔長期暴露于香煙煙霧中，顯示SCNN1B敲除小鼠肺中黏液過度分泌，產(chǎn)生了COPD的癥狀，進一步證實了ENaC與COPD肺病的相關(guān)性，但ENaC在COPD發(fā)生過程中所發(fā)揮的具體作用仍在探究中。

2.5 ENaC與其它呼吸系統(tǒng)疾病 除上述疾病外，還有研究顯示ENaC與支氣管擴張癥和慢性支氣管炎相關(guān)。支氣管擴張癥是指由慢性支氣管炎癥或感染引起的氣道永久性擴張，F(xiàn)ajac等［78］分析了55例特發(fā)性支氣管擴患者的基因，結(jié)果表明ENaC-β和ENaC-γ基因的變異可能是導(dǎo)致支氣管擴張的主要原因。Astrand等［79］顯示ENaC可以促進慢性支氣管炎患者氣道的黏液水合作用及轉(zhuǎn)運。已有研究證明ENaC在癌細胞的遷移、增殖和凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮效應(yīng)［80］。另外，關(guān)于ENaC在肺部癌癥的相關(guān)研究也逐漸成為了近年來研究的熱點。He等［81］通過對一系列肺癌細胞株進行了全基因組RNA測序和染色質(zhì)免疫沉淀測序分析，發(fā)現(xiàn)編碼ENaC-α亞基的基因SCNN1A與小細胞肺癌（small-cell lung cancer，SCLC）發(fā)生過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子ASCL1（achaetescute complex-like 1）表達高度相關(guān)。體外研究證明，阿米洛利能顯著抑制ASCL1依賴性SCLC的生長，因此得出結(jié)論SCNN1A（ENaC-α）基因是神經(jīng)內(nèi)分泌肺癌譜系癌基因ASCL1的直接轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，可以將其作為這種癌癥的候選靶標(biāo)［81］。

3 ENaC在相關(guān)呼吸系統(tǒng)疾病治療中的應(yīng)用

綜上所述，ENaC與多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系，有充足的研究證明其是治療相關(guān)呼吸系統(tǒng)疾病的優(yōu)選靶點。近年來以其作為直接或間接靶點，開發(fā)相關(guān)疾病的治療藥物和方法的研究也日益增多。目前為止的研究主要集中在兩方面，一是開發(fā)調(diào)節(jié)ENaC的藥物和新型分子。這些藥物或分子可以直接靶向作用于ENaC或通過相應(yīng)的信號途徑間接調(diào)控ENaC的表達和活性，如臨床藥物特布他林通過cAMP、PKA等途徑激活ENaC的表達［82］，對支氣管哮喘、COPD等疾病的緩解及治愈有重要意義。SPX-101是一種新型的ENaC靶向藥物，它是一種吸入性治療性多肽，可抵抗蛋白水解降解，并在低pH下穩(wěn)定，通過促進通道內(nèi)化來降低ENaC活性，從而達到治療CF疾病的作用［43］。另一方面是通過siRNA［56］或ASO［47］靶向作用于ENaC 各亞基的編碼基因，直接干擾ENaC的表達進而緩解病癥，然而這些新的藥物或分子的治療效果和副作用等則需要進一步的臨床研究來證明。

4 展望

本文總結(jié)了近年來國內(nèi)外ENaC在相關(guān)呼吸系統(tǒng)疾病中作用的研究進展，并對ENaC在相關(guān)疾病中治療的應(yīng)用進行了小結(jié)，但這些治療藥物或治療方法仍需要進一步的臨床驗證。離子通道是細胞間相互通訊和傳送信號的基本途徑之一。隨著國內(nèi)外對ENaC廣泛深入的研究，人們對ENaC在各種疾病中的作用也有了更加深刻的認(rèn)識，以ENaC為靶點治療各種相關(guān)疾病的思路也越來越受關(guān)注。但是ENaC在這些疾病和生理活動的調(diào)控機制尚未完全闡明，如ENaC中δ亞基的功能尚未得到確切闡釋。因此進一步探索ENaC的生物學(xué)功能，將為相關(guān)疾病的治療和藥物的開發(fā)開辟新的方向。