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    養(yǎng)精種玉湯對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟及PDGFA和PDGFRα表達(dá)的影響*

    2020-06-09 02:42:18肖彩仙唐立明
    中國(guó)病理生理雜志 2020年5期
    關(guān)鍵詞:卵母細(xì)胞卵泡卵巢

    肖彩仙, 段 恒, 唐立明

    (重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,重慶400016)

    近年來(lái),由于生活方式和社會(huì)環(huán)境的改變,晚婚晚育者、卵巢功能不全者和腫瘤年輕患者等增多,不孕癥患者比例逐年上升[1]。卵母細(xì)胞體外成熟(in vitro maturation,IVM)成為治療不孕癥的一種潛在有效的方法[2]。目前,全世界應(yīng)用IVM技術(shù)誕生的試管嬰兒有5 000多名,中國(guó)也廣泛應(yīng)用該技術(shù)治療多囊卵巢綜合征的不孕患者[3-4]。盡管IVM實(shí)踐有了很大發(fā)展,但仍然存在成熟率低、穩(wěn)定性差等問(wèn)題,不能得到全面推廣[5]。中藥可用于輔助生殖,減輕卵巢過(guò)度刺激綜合征,改善卵泡發(fā)育和卵子質(zhì)量[6]。養(yǎng)精種玉湯(Yangjing-Zhongyu decoctin,YZD)為治療不孕癥的經(jīng)典名方,臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示,養(yǎng)精種玉湯可以治療女性不孕,提高卵母細(xì)胞成熟率[7-8]。

    血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor,PDGF)家族的成員是由4種不同基因編碼的4種不同多肽鏈(A、B、C和D)組成的二聚糖蛋白,這些多肽鏈合成時(shí)為無(wú)活性前體,在蛋白水解加工后,4個(gè)PDGF鏈通過(guò)同源二聚化或異二聚化組裝成二硫鍵連接的二聚體,產(chǎn)生5種不同的二聚體同種型:PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC和PDGFDD[9]。有研究顯示,PDGF的A亞基(PDGF subunit A,PDGFA)和 PDGF受 體 α(PDGF receptorα,PDGFRα)在卵母細(xì)胞中表達(dá),向培養(yǎng)基中添加PDGF可以促進(jìn)原始卵泡的發(fā)育,而PDGFRα基因的突變則會(huì)導(dǎo)致小鼠卵巢變小,進(jìn)而影響卵母細(xì)胞的成熟[10-12]。因此,本研究觀察養(yǎng)精種玉湯對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟的影響,并進(jìn)一步觀察養(yǎng)精種玉湯對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟PDGFA和PDGFRα表達(dá)的影響,探討PDGFA和PDGFRα對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟的作用機(jī)制。

    材料和方法

    1 材料

    1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雌性KM小鼠140只,8~10周齡,體質(zhì)量25~30 g,SPF級(jí)雄性KM小鼠12只,12周齡,體質(zhì)量30~35 g,均由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,許可證號(hào)為SYXK(渝)2018-0003。

    1.2 藥物和試劑 養(yǎng)精種玉湯含熟地90 g、當(dāng)歸45 g、白芍45 g和山萸肉45 g,購(gòu)自重慶桐君閣大藥房,經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中藥教研室制備成含生藥1.5 kg/L的浸膏;由費(fèi)耀教授根據(jù)2015版《中國(guó)藥典》鑒定為正品,生產(chǎn)批號(hào)為20181102。注射用尿促卵泡激素(follicle stimulating hormone,F(xiàn)SH;麗珠制藥廠,生產(chǎn)批號(hào)H20052130);孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG;浙江寧波三生藥業(yè)有限公司,生產(chǎn)批號(hào)110044564);胎牛血清(Biological Industries,04-400-1B);M199培養(yǎng)基(Gibco,12340030);抗PDGFA抗體(Affinity,AF5179);抗PDGFRα抗體(Affinity,AF0241);抗 β-actin抗體(CST,4970T);goat anti-rabbit IgG(博奧森,0295G);RNA提取試劑盒(Axygen,AP-MN-MS-RNA-50);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Bimake,B24403)。

    1.3 儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo);XTL-400型體視顯微鏡(重慶澳浦光電技術(shù)有限公司);Synergy HTX全自動(dòng)酶標(biāo)儀和CFX PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad);Odyssey Fc雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(LI-COR Biosciences);NanoDrop 2000超微量核酸測(cè)定儀(Thermo)。

    2 方法

    2.1 養(yǎng)精種玉湯血清的制備 將16只雌性小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和養(yǎng)精種玉湯組,每組各8只,按20 g/kg劑量灌胃給藥,正常組給等體積的生理鹽水,每天1次,連續(xù)3 d。我們前期采用高效液相色譜監(jiān)測(cè)養(yǎng)精種玉湯的最佳取血時(shí)點(diǎn),發(fā)現(xiàn)養(yǎng)精種玉湯灌胃后0.5 h達(dá)最高藥物吸收峰值,因此我們選擇末次給藥0.5 h后摘眼球取血。常溫下靜置2 h,4℃、3 000 r/min離心15 min,0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后分裝,于-80℃冷藏備用。

    2.2 小鼠卵母細(xì)胞的采集與分組 小鼠處死前46~48 h腹腔注射10 U PMSG,每只0.1 mL,無(wú)菌打開(kāi)腹腔,取出卵巢,清洗3次。在解剖鏡下,用1 mL注射針頭刺破卵巢中的卵泡,用巴氏吸管收集未成熟的卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞復(fù)合體(oocyte-granulosa cell complexes,OCCs),反復(fù)清洗4次,將多只小鼠OCCs混合后分為空白(blank)組、空白血清(blank serum)組、養(yǎng)精種玉湯血清(YZD)組和FSH組。將各組分別放入加有10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液中,空白血清組、養(yǎng)精種玉湯血清組和FSH組分別加入2%的小鼠血清、養(yǎng)精種玉湯小鼠血清和75 U FSH。放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    2.3 卵母細(xì)胞成熟率的計(jì)算 OCCs體外培養(yǎng)24 h后,用透明質(zhì)酸酶消化去除顆粒細(xì)胞,在顯微鏡下觀察并計(jì)算各組卵母細(xì)胞成熟率(成熟卵母細(xì)胞個(gè)數(shù)/卵母細(xì)胞總數(shù)×100%),有第1極體排出為成熟卵母細(xì)胞。

    2.4 小鼠體外受精率及卵裂率的計(jì)算 雄性小鼠處死后取出附睪及附睪尾,PBS清洗3次,剪成段,釋出精子于含10%胎牛血清的培養(yǎng)液中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2 h使精子獲能。將培養(yǎng)24 h的各組OCCs用透明質(zhì)酸酶消化去除顆粒細(xì)胞,調(diào)整精子密度,按精卵約為10 000∶1的比例將精子加入含有卵母細(xì)胞的培養(yǎng)液中繼續(xù)孵育5 h。顯微鏡下觀察并計(jì)算卵母細(xì)胞的受精率(受精卵個(gè)數(shù)/成熟卵個(gè)數(shù)×100%),出現(xiàn)兩個(gè)原核的細(xì)胞為受精卵;24 h后計(jì)算卵裂率(卵裂球個(gè)數(shù)/受精卵數(shù)×100%)。

    2.5 Western blot檢測(cè)PDGFA和PDGFRα蛋白的表達(dá) 每組收集20只KM小鼠的OCCs,培養(yǎng)24 h后去除顆粒細(xì)胞。各組卵母細(xì)胞于4℃、5 000 r/min離心5 min,棄上清,加入裂解液,超聲破碎細(xì)胞,提取總蛋白。采用10%的預(yù)制凝膠,140 V電泳,待溴酚藍(lán)至凝膠底部結(jié)束電泳;300 mA轉(zhuǎn)膜60 min,室溫封閉1.5 h;加入I抗[抗PDGFA(1∶500)和抗PDGFRα(1∶1 000)]4℃過(guò)夜;II抗(1∶5 000)室溫?fù)u床孵育1.5 h;配制ECL發(fā)光液,暗室中曝光2 min;用ImageJ軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度分析,以β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行比對(duì)。

    2.6 real-time PCR檢測(cè)PDGFA和PDGFRα的mRNA表達(dá)水平 每組收集6只小鼠的OCCs,培養(yǎng)24 h后去除顆粒細(xì)胞,每組卵母細(xì)胞加入Buffer RⅠ,用21號(hào)注射器反復(fù)抽吸10次,轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管,然后加入Buffer RⅡ,渦漩振蕩,離心,取上清加入異丙醇,混勻。將上述液體移入離心柱內(nèi)芯,離心,棄濾液,加Buffer W1A,離心,棄濾液,加Buffer W2清洗2次,離心,棄濾液。將離心柱芯轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管,加入Buffer TE,室溫靜置1 min,離心洗脫得RNA。反應(yīng)條件為:逆轉(zhuǎn)錄42℃15 min,85℃2 min;預(yù)變性95℃ 30 s;擴(kuò)增95℃ 5 s,60℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán);熔解曲線95℃ 5 s,60℃ 1 min。以GAPDH為內(nèi)參照,統(tǒng)計(jì)分析PDGFA和PDGFRα的mRNA表達(dá)。引物信息見(jiàn)表1。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    用軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。率的比較用χ2檢驗(yàn);蛋白和mRNA表達(dá)的數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD),組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    表1 real-time PCR實(shí)驗(yàn)的引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

    結(jié) 果

    1 養(yǎng)精種玉湯對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟的影響

    與空白組和空白血清組比較,養(yǎng)精種玉湯血清組小鼠卵母細(xì)胞成熟率顯著提高(P<0.01);與FSH組比較,養(yǎng)精種玉湯血清組卵母細(xì)胞成熟率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05),見(jiàn)圖1及表2。這說(shuō)明養(yǎng)精種玉湯能提高卵母細(xì)胞的體外成熟率。

    Figure 1.Immature oocytes of each group were cultured in vitro for 24 h(×100).圖1 各組未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)24 h的形態(tài)變化

    表2 養(yǎng)精種玉湯對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟的影響Table 2.Effect of YZDon in vitro maturation of mouse oocytes

    2 養(yǎng)精種玉湯對(duì)小鼠體外受精和受精卵發(fā)育的影響

    與空白組比較,養(yǎng)精種玉湯血清組受精率明顯提高(P<0.05);與空白血清組比較,養(yǎng)精種玉湯血清組受精率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05),但受精率較空白血清組提高,見(jiàn)表3。這提示養(yǎng)精種玉湯能提高卵母細(xì)胞受精率。

    3 養(yǎng)精種玉湯對(duì)PDGFA和PDGFRα蛋白表達(dá)的影響

    表3 養(yǎng)精種玉湯血清對(duì)小鼠體外受精和受精卵發(fā)育的影響Table 3.The effect of YZDon in vitro fertilization and fertilized egg development in mice

    Western blot結(jié)果顯示,與空白組和空白組血清組比較,養(yǎng)精種玉湯血清組PDGFA和PDGFRα蛋白的表達(dá)減少(P<0.01),見(jiàn)圖2。

    Figure 2.The protein expression of PDGFA and PDGFRα in the oocytes of each group.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs blank group;##P<0.01 vs blank serumgroup.圖2 各組卵母細(xì)胞中PDGFA和PDGFRα蛋白的表達(dá)

    4 養(yǎng)精種玉湯對(duì)PDGFA和PDGFRαmRNA表達(dá)的影響

    real-time PCR結(jié)果顯示,與空白組和空白血清組比較,養(yǎng)精種玉湯血清組PDGFA和PDGFRα的mRNA表達(dá)量減少(P<0.01),見(jiàn)圖3。

    Figure 3.The mRNA expression of PDGFA and PDGFRα in the oocytes of each group.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs blank group;##P<0.01 vs blank serumgroup.圖3 PDGFA和PDGFRα的mRNA在各組卵母細(xì)胞中表達(dá)的變化

    討 論

    養(yǎng)精種玉湯出自《傅青主女科》,由熟地、當(dāng)歸、白芍和山萸肉組成。功效平補(bǔ)肝腎,填精益血,本方所治之證因精血不足,肝腎陰虛,沖任失養(yǎng)而成,故立補(bǔ)血養(yǎng)精之法,精血充足,沖任得養(yǎng)而種子成孕[13]。中醫(yī)認(rèn)為:“腎藏精,腎為天癸之源,沖任之本,腎氣盛,沖任滿盈,天癸蓄極泌至,月事以時(shí)下,經(jīng)調(diào)而有子。”名醫(yī)羅元愷曾指出天癸是非肉眼所能見(jiàn)的元陰,溶于血中,與西醫(yī)的雌激素尤其相似。在血分雌激素的影響下,卵泡不斷發(fā)育,當(dāng)雌激素亦即“陰”的水平達(dá)到重陰時(shí)卵泡發(fā)育成熟,排出卵子,故“女精”即卵子。卵子之精在血分“陰”提高的前題下溢瀉,所以有“精血”同源和“精、陰、血”同源之說(shuō)。傅山所創(chuàng)養(yǎng)精種玉湯,說(shuō)明血中補(bǔ)陰,陰中養(yǎng)精,養(yǎng)精才能種玉的道理,同時(shí)又把血、陰、精聯(lián)系在一起,從中醫(yī)的腎-天癸-沖任這一生殖軸確立治療原則[14-15]。后歷經(jīng)無(wú)數(shù)醫(yī)家的反復(fù)臨床實(shí)踐及療效驗(yàn)證,現(xiàn)已成為治療不孕癥的基礎(chǔ)方[16]。

    PDGF是機(jī)體內(nèi)一種重要的促分裂劑和趨化劑,能刺激機(jī)體內(nèi)各種類型的細(xì)胞分裂和增殖[17]。Nilsson等[18]提出PDGF由卵母細(xì)胞產(chǎn)生,其作用于周圍的顆粒和卵泡膜/間質(zhì)細(xì)胞以促進(jìn)原始卵泡發(fā)育。一些研究報(bào)道了哺乳動(dòng)物卵巢中PDGF及其受體存在于大鼠[11]、人類[19]和豬[10]等,這些實(shí)驗(yàn)研究以卵泡或卵巢為研究對(duì)象,利用免疫組化研究PDGF蛋白對(duì)卵泡發(fā)育的作用。但有研究者指出雖然卵泡中卵母細(xì)胞的免疫反應(yīng)性似乎非常特異,但尚不清楚在發(fā)育的后期階段卵泡中觀察到的卵母細(xì)胞染色是由于蛋白質(zhì)的存在,還是非特異性抗體結(jié)合導(dǎo)致的[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,養(yǎng)精種玉湯血清組較空白組卵母細(xì)胞成熟率明顯提高,且PDGFA和PDGFRα表達(dá)較空白組減少,表明養(yǎng)精種玉湯可以提高小鼠卵母細(xì)胞的體外成熟率,同時(shí)也證實(shí)了在卵泡發(fā)育的后期階段中觀察到的卵母細(xì)胞PDGFA和PDGFRα染色是由于其蛋白質(zhì)的存在。

    PDGF作為重要的促有絲分裂原,通過(guò)與靶細(xì)胞膜上的α和β蛋白酪氨酸激酶受體結(jié)合,促使有絲分裂信號(hào)向胞內(nèi)傳遞,從而引起DNA合成、細(xì)胞分裂及增殖[17,20]。PDGF結(jié)合使PDGFRα二聚化,并激活受體的激酶活性,觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng),包括Ras-MAPK、PI3K和PLCγ途徑,這些途徑都參與了卵母細(xì)胞的成熟過(guò)程。例如:PDGFR主要通過(guò)銜接蛋白Grb2和Shc連接到Ras-MAPK,Grb2通過(guò)其SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合激活的PDGFR,并通過(guò)其SH3結(jié)構(gòu)域復(fù)合Sos1激活Raf-1和MAPK級(jí)聯(lián)的下游,從而刺激細(xì)胞生長(zhǎng)[21]。此外,PDGF在培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)是動(dòng)態(tài)的[21]。Pascuali等[22]研究發(fā)現(xiàn),青春期前(卵泡正處于發(fā)育階段)大鼠PDGF受體的抑制導(dǎo)致卵泡膜和顆粒細(xì)胞增殖減少,雌激素濃度降低,他們認(rèn)為局部抑制PDGF會(huì)增加卵巢細(xì)胞凋亡,從而發(fā)生大量卵泡閉鎖。有研究表明,PDGF家族成員的表達(dá)受激素調(diào)節(jié),用雌激素治療未成熟小鼠24 h可降低卵巢PDGF及其受體的表達(dá),且免疫組化結(jié)果顯示PDGFRs的免疫染色隨著卵泡發(fā)育至竇前期(卵母細(xì)胞成熟之前)而增強(qiáng),但此后減弱[23]。上述研究表明,PDGF及其受體的蛋白表達(dá)在發(fā)育的卵母細(xì)胞中升高,而在卵母細(xì)胞成熟時(shí)表達(dá)下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示養(yǎng)精種玉湯血清組PDGFA和PDGFRα水平較空白組下降,說(shuō)明養(yǎng)精種玉湯可能通過(guò)下調(diào)PDGFA和PDGFRα的蛋白和mRNA表達(dá)來(lái)促進(jìn)小鼠卵母細(xì)胞的體外成熟。

    本實(shí)驗(yàn)將養(yǎng)精種玉湯與輔助生殖相結(jié)合,豐富了“腎主生殖”的內(nèi)涵,有利于中醫(yī)藥在輔助生殖中的應(yīng)用與發(fā)展,為輔助生殖領(lǐng)域開(kāi)辟新途徑。

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