UPS-E3泛素連接酶ITCH與胰島素抵抗的關(guān)系*

郭 豪， 馬 玉， 常曉彤

（河北北方學院臨床檢驗診斷學重點實驗室，河北張家口075000）

糖尿病已成為嚴重的世界性公共衛(wèi)生問題，預(yù)計至2045年全球糖尿病患者將超過6億人［1］。胰島素抵抗是2型糖尿病的重要表型，是指各種原因?qū)е乱葝u素促進葡萄糖攝取和利用率下降，機體代償性地分泌過多胰島素，產(chǎn)生高胰島素血癥。胰島素是一種蛋白類激素，促進糖原、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)合成等多種生物代謝過程，其作用的發(fā)揮依賴于胰島素信號正常轉(zhuǎn)導(dǎo)；胰島素重要靶器官如肝臟、脂肪、肌肉、胰腺和腦中胰島素信號通路阻斷將導(dǎo)致胰島素抵抗。胰島素信號是一種短暫的效應(yīng)，信號分子在胰島素的分泌和功能發(fā)揮中起著重要的作用。細胞中蛋白質(zhì)水平的穩(wěn)態(tài)取決于其合成和降解的速率，其中降解過程是通過2個緊密調(diào)控的系統(tǒng)來完成的，即溶酶體和蛋白酶體系統(tǒng)，靶向降解錯誤折疊或受損的蛋白質(zhì)。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）是細胞內(nèi)80%蛋白質(zhì)降解的主要途徑，其中底物泛素化過程的特異性取決于E3泛素連接酶。已有研究發(fā)現(xiàn)E3泛素連接酶ITCH在機體胰島素抵抗中發(fā)揮關(guān)鍵作用［2］。本文以ITCH的結(jié)構(gòu)和作用機制為基礎(chǔ)，闡述其與胰島素抵抗的相關(guān)性，為進一步研究ITCH的功能和胰島素抵抗的機制提供理論基礎(chǔ)。

1 UPS及泛素化

1.1 UPS UPS是真核細胞中選擇性降解蛋白質(zhì)的主要途徑，在細胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA損傷等多種生物學過程發(fā)揮著重要作用［3］。該系統(tǒng)與胰島素信號通路相關(guān)，可參與胰島素受體（insulin receptor，IR）的內(nèi)化、胰島素受體底物1/2（insulin receptor substrate 1/2，IRS1/2）表達量的調(diào)控和胰島素的降解［4］。UPS也參與炎癥反應(yīng)，有報道稱蛋白酶體抑制劑具有抗炎作用，UPS異常與肥胖、胰島素抵抗、糖尿病等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)［5-6］。

1.2 泛素化 泛素（ubiquitin，Ub）是一種存在于所有真核細胞、高度保守且大量表達、含76個氨基酸殘基的蛋白分子。泛素化是重要的翻譯后修飾，靶蛋白泛素化首先通過E1泛素活化酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶的多酶級聯(lián)介導(dǎo)、多肽泛素的共價加成而標記，然后經(jīng)26S蛋白酶體識別并降解，見圖1B。泛素化的調(diào)控是由底物特異性的E3泛素連接酶介導(dǎo)［7］。機體通常含有少量E1s和E2s，而含有大量E3s，主要分為HECT、RING和U-box蛋白3種類型。HECT是位于蛋白質(zhì)羧基端的一個結(jié)構(gòu)域，它的關(guān)鍵特征是半胱氨酸殘基在催化底物泛素化前與泛素羧基末端形成中間硫代酯鍵［8］。

2 ITCH及其作用底物

ITCH，又稱atrophin 1相互作用蛋白4（atrophin 1-interacting protein 4，AIP4），是一種高度保守的HECT家族E3泛素連接酶，相對分子質(zhì)量為113 000，是含有854個氨基酸殘基的單體蛋白，其結(jié)構(gòu)包括：1個N端C2結(jié)構(gòu)域，介導(dǎo)募集的底物蛋白進入細胞膜內(nèi)；4個WW結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)與靶蛋白特異性相互作用，可募集具有絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點或含PPXY結(jié)構(gòu)域的底物蛋白；1個C端HECT結(jié)構(gòu)域可將活化的泛素分子由E2泛素結(jié)合酶轉(zhuǎn)移至靶蛋白；1個PRD結(jié)構(gòu)域位于第195～246個氨基酸殘基之間，參與分揀連接蛋白9（sorting nexin 9，SNX9）等底物蛋白的募集，見圖1A。

Figure 1.The structure of ITCH（A）and its mechanism of participating in ubiquitin cascade（B）.In an ATP-requiring step，a thioester bond is formed between the carboxyl terminus of ubiquitin and an cysteine residue of ubiquitin activating enzyme（E1）；activated ubiquitin is then transferred to a specific cysteine residue of ubiquitin conjugating enzyme（E2）；the HECT domain of itch binds to the E2-ubiquitin complex and transfers the activated ubiquitin to a catalytic cysteine residue of its C-terminal region，and then catalyzes the ubiquitin transfer from the HECT domain to the lysine residues of the substrates；the ubiquitinated substrates are degraded by the 26Sproteasome.圖1 ITCH的結(jié)構(gòu)及其參與泛素化級聯(lián)的作用機制

生理情況下，ITCH的WW結(jié)構(gòu)域與含PPXY基序的底物特異結(jié)合，催化其泛素化并經(jīng)蛋白酶體降解，參與底物介導(dǎo)的免疫調(diào)控、細胞周期等多種生物過程。ITCH催化蛋白質(zhì)泛素化可分為兩步：首先HECT結(jié)構(gòu)域與E2-泛素復(fù)合物結(jié)合，并將活化的泛素轉(zhuǎn)移到其羧基端催化半胱氨酸殘基上，然后催化泛素從HECT結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)移到底物的賴氨酸殘基上［9］。已有研究顯示，ITCH的作用靶點是多種信號通路的核心參與調(diào)控者。

2.1 Jun蛋白家族 c-Jun/JunB是一種活化蛋白1（activator protein 1，AP-1）轉(zhuǎn)錄因子的成分，現(xiàn)已證實，c-Jun和JunB均是ITCH的底物蛋白［10］。經(jīng)脂多糖等刺激的巨噬細胞中，炎癥相關(guān)基因如白細胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）的表達依賴于 JunB［11］。在ITCH表達缺失的T細胞中，JunB蛋白表達增加，增強與IL-4結(jié)合的活性，后者可通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6（signal transducer and activator of transcription 6，STAT6）通路參與抗炎M2型巨噬細胞的代謝及作用的發(fā)揮［12］。此外，JunB調(diào)節(jié)IL-4基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)Th2淋巴細胞介導(dǎo)的M2型巨噬細胞極化，產(chǎn)生IL-10等抗炎細胞因子，從而防止肥胖和胰島素抵抗［13］。ITCH靶向結(jié)合c-Jun和JunB，催化其泛素化及降解，降低其在防止肥胖相關(guān)炎癥和胰島素抵抗中的作用。

2.2 硫氧還相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP） TXNIP最初被認為是一種硫氧還蛋白的抑制劑，現(xiàn)已被報道與胰島素抵抗相關(guān)［14］。在動物模型中，TXNIP的高表達可誘導(dǎo)胰腺β細胞凋亡，降低骨骼肌和脂肪等外周組織的胰島素敏感性，通過結(jié)合并降低葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）的表達來抑制葡萄糖的攝取［15-16］。機體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下，TXNIP參與核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體的激活，增加IL-1β的生成，進而參與炎癥發(fā)生［17］。但是，在細菌感染的巨噬細胞中，沉默TXNIP基因可促進Toll樣受體2介導(dǎo)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-6等炎性因子的產(chǎn)生［18］。ITCH介導(dǎo)的TXNIP在體內(nèi)外的多泛素化及降解［19］，可能靶向TXNIP-炎癥通路，調(diào)控機體的炎癥狀態(tài)。

2.3 Notch Notch是一種保守的Ⅰ型跨膜受體，它的激活與炎癥、胰島素抵抗等呈正相關(guān)［20-21］。實驗表明，肝臟Notch1的表達缺失，誘導(dǎo)糖異生關(guān)鍵酶葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6Pase）表達增加，促進葡萄糖產(chǎn)生［22］。另外，Notch激活肝臟中營養(yǎng)敏感的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）通路，導(dǎo)致脂肪和甘油三酯生成增多［23］。ITCH通過WW結(jié)構(gòu)域與Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的N端結(jié)合，HECT結(jié)構(gòu)域促進Notch的泛素化［24］，從而調(diào)控其生物學功能。

2.4 p53蛋白家族 p53是一種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控細胞增殖與凋亡周期，p63和p73是其同源性轉(zhuǎn)錄因子［25］。越來越多的證據(jù)表明，p53家族成員在調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用，然而這些作用卻不盡相同［26-27］。TAp63（p63亞型）缺乏的小鼠表現(xiàn)出葡萄糖不耐受、肥胖和胰島素抵抗，而TAp73缺乏的小鼠在高脂飲食喂養(yǎng)下能防止葡萄糖不耐受和胰島素抵抗［28-29］。生理情況下，ITCH催化p63和p73泛素化及降解，使其保持相對較低水平［30］，調(diào)控p53蛋白家族成員對葡萄糖穩(wěn)態(tài)的影響。

3 ITCH與胰島素抵抗

有學者提出關(guān)于胰島素抵抗發(fā)生的2種假說，即炎癥假說和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)假說［31］。E3泛素連接酶在胰島素抵抗和糖尿病過程中起著關(guān)鍵作用，其機制有兩種：一是E3泛素連接酶通過UPS直接降解IR、IRS和其它關(guān)鍵胰島素信號分子；二是通過調(diào)節(jié)參與胰島素信號分子調(diào)節(jié)的促炎癥介質(zhì)間接調(diào)控胰島素信號，例如 TNF-α、IL-6、IL-1β、單核細胞趨化蛋白 1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、低氧誘導(dǎo)因子 1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）等［2］。胰島素抵抗的發(fā)病機制復(fù)雜，是多因素相互作用及影響的結(jié)果，包括靶器官細胞胰島素敏感性降低、胞內(nèi)信號分子轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻、機體代謝紊亂等。

3.1 ITCH靶向炎癥 炎癥聯(lián)系肥胖與胰島素抵抗。脂肪組織巨噬細胞和T細胞的活化與肥胖所致的促炎癥狀態(tài)有關(guān)。M1型巨噬細胞由干擾素γ誘導(dǎo)，分泌促炎性細胞因子，在肥胖脂肪組織中占主導(dǎo)地位，M2型巨噬細胞主要由Th2淋巴細胞分泌的IL-4和IL-13誘導(dǎo)，產(chǎn)生抗炎細胞因子IL-10。已有研究顯示，ITCH-/-小鼠中脂肪組織浸潤的巨噬細胞呈慢性M2型極化，巨噬細胞半乳糖型凝集素2（macrophage galactose-type lectin 2，Mgl2）、精氨酸酶1（arginase 1，Arg1）、幾丁質(zhì)酶3樣蛋白1（chitinase 3-like protein 1，CHI3L1）等M2型巨噬細胞標志物的表達顯著增加，防止小鼠體重增加及肥胖刺激下的代謝紊亂［13］。體外研究應(yīng)用siRNA沉默巨噬細胞中ITCH的表達，導(dǎo)致促炎因子IL-1β減少，抗炎因子IL-10表達增加。也有研究表明，ITCH缺乏對肥胖的影響是由高脂飲食引起的炎癥所介導(dǎo)的，當高脂飲食被阻斷時，ITCH基因敲除小鼠在生理過程中體重的變化趨勢與野生型小鼠相同，提示在無高脂飲食或炎癥刺激的情況下，ITCH缺乏不影響小鼠的代謝表型［13］。

炎癥通路通過多種途徑與胰島素抵抗相連，主要有IκB激酶β（inhibitor kappa B kinaseβ，IKKβ）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號通路。ITCH的表達水平與NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的表達水平相關(guān)。研究表明，在骨折修復(fù)的早期階段，NF-κB結(jié)合目的基因啟動子中的相應(yīng)位點來上調(diào)ITCH等含有WW結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶的表達水平，抑制成骨細胞的分化［32］。含核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白2（nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2，NOD2）是一種炎癥性腸病——克羅恩病的易感蛋白，參與協(xié)調(diào)細胞刺激后的細胞因子應(yīng)答，其中ITCH直接通過K-63連接多聚泛素化NOD2結(jié)合蛋白RIP2，調(diào)控NOD2依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，即NF-κB信號通路和Ras-絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路，參與NOD2介導(dǎo)的炎癥性疾病的發(fā)生［33］。具體地，ITCH增強NOD2/RIP2通路誘導(dǎo)炎癥通路中JNK和p38的活性，但抑制NF-κB的激活。泛素編輯酶A20是炎癥和細胞因子介導(dǎo)的NF-κB激活的關(guān)鍵負調(diào)節(jié)因子，ITCH作為A20泛素編輯復(fù)合物的亞基之一，參與A20底物的識別和滅活，負向調(diào)控炎癥信號通路［34］。目前已知，JNK與胰島素抵抗的發(fā)展相關(guān)，機制可能是激活I(lǐng)TCH進一步參與胰島素抵抗。因此，ITCH可通過靶向炎癥通路細胞和分子，調(diào)控機體代謝表型和胰島素抵抗的發(fā)生。

3.2 ITCH調(diào)控機體代謝物質(zhì)的水平 胰島素抵抗與許多代謝紊亂相關(guān)。正常情況下，胰島素通過增加葡萄糖消耗和脂質(zhì)合成來促進機體合成代謝，但機體發(fā)生胰島素抵抗便不能抑制肝臟葡萄糖的產(chǎn)生，自相矛盾的是，肝臟脂質(zhì)合成增加，導(dǎo)致高血糖和高甘油三酯血癥。

不同胰島素敏感性人群的ITCH表達分析顯示，ITCH與脂肪組織炎癥細胞表型相關(guān)，飲食誘導(dǎo)小鼠肥胖的前提下，ITCH基因缺失的脂肪組織細胞體積較小、密度偏高，表現(xiàn)出抗炎模式［13］。經(jīng)高脂飲食喂養(yǎng)數(shù)周后，ITCH-/-小鼠的空腹血糖水平明顯降低，糖耐量得到改善，在空腹和普通飲食狀態(tài)下血清胰島素水平下降，胰島素抵抗指數(shù)的穩(wěn)態(tài)模型評估值明顯降低［13］。已知IL-13是介導(dǎo)M2型巨噬細胞激活的Th2細胞因子，在ITCH-/-小鼠的肝臟中，抗炎細胞因子IL-13水平升高，激活下游STAT3通路，抑制葡萄糖生成基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制肝臟葡萄糖的產(chǎn)生［35］。關(guān)于脂質(zhì)代謝，與野生型小鼠相比，ITCH-/-小鼠的肝臟甘油三酯水平明顯降低，過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ）表達顯著上調(diào)，后者在組織巨噬細胞中促進M2型極化，增加組織的氧化代謝和能量消耗，改善胰島素抵抗［13］。研究發(fā)現(xiàn)，ITCH泛素化并降解脫乙酰酶sirtuin-6（SIRT6），減少脂肪酸氧化并促進肝臟脂質(zhì)浸潤；另外，ITCH缺失阻止細胞核中固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2，SREBP2）的清除，導(dǎo)致循環(huán)膽固醇水平降低［36］。將動脈粥樣硬化模型小鼠體內(nèi)ITCH和載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因敲除后，M2型巨噬細胞增多，循環(huán)斑塊形成減少，同時出現(xiàn)肝脂肪變性減少、線粒體氧化能力增強，脂肪酸氧化增加等脂質(zhì)代謝改善狀態(tài)［36］?？傊?，ITCH表達缺失背景下，機體甘油三酯、膽固醇等脂質(zhì)含量減少，血清葡萄糖及胰島素水平降低，胰島素抵抗狀態(tài)有所減輕。因此，ITCH的表達調(diào)控可以作為治療以高脂血癥和高膽固醇血癥為主要癥狀的胰島素抵抗的一個靶點。3.3 ITCH靶向胰島素及其信號通路 胰島素生物學效應(yīng)的發(fā)揮依賴于細胞中各級信號分子的逐級轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中任何信號分子受抑制或降解，通路被阻斷，即導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生。既往研究報道，人肝癌HepG2細胞胰島素抵抗狀態(tài)下，ITCH蛋白表達上調(diào)，可能通過靶向降解胰島素信號通路中關(guān)鍵信號分子，抑制胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［37］。

Gli樣轉(zhuǎn)錄因子3（Gli-similar 3，Glis3）是Krüppel樣鋅指轉(zhuǎn)錄因子的一個亞家族，參與調(diào)控胰腺β細胞生成和成熟、胰島素基因表達等重要生物過程［38］。ITCH作為Glis3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵負調(diào)節(jié)因子，可導(dǎo)致其多泛素化并通過蛋白酶體降解而降低Glis3的穩(wěn)定性，顯著抑制Glis3介導(dǎo)的胰島素基因的轉(zhuǎn)錄激活，影響胰島素生物學效應(yīng)［39］。研究表明，ITCH-/-小鼠的肌肉組織中，胰島素受體Tyr972和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）Ser473的磷酸化程度明顯增強，從而促進胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［13］。叉頭框蛋白O1（forkhead box protein O1，F(xiàn)OXO1）是胰島素信號通路的重要下游因子，ITCH基因缺失引起底物JunB表達上調(diào)以促進miR-182的表達，后者結(jié)合FOXO1 3′端非翻譯區(qū)，降低了FOXO1的表達［40］，抑制其對糖異生關(guān)鍵酶的調(diào)控，肝臟糖異生作用減低，血糖下降。人表皮生長因子受體3（human epidermal growth factor receptor，HER3）的表達與胰腺癌、乳腺癌等腫瘤的進展相關(guān)?？笻ER3抗體9F7-F11可誘導(dǎo)ITCH靶向結(jié)合HER3，導(dǎo)致HER3泛素化并被蛋白酶體降解。相應(yīng)地，siRNA介導(dǎo)ITCH基因敲減，可抑制9F7-F11誘導(dǎo)的HER3泛素化降解，恢復(fù)HER3磷酸化，促進AKT和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）磷酸化［41］，進而促進胰島素關(guān)鍵信號通路——PI3K/AKT信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，ITCH介導(dǎo)的胰島素信號分子的降解或信號通路的阻斷可能是胰島素抵抗的分子機制之一。

4 小結(jié)

綜上所述，E3泛素連接酶ITCH可直接調(diào)控胰島素基因轉(zhuǎn)錄及其信號通路分子水平，或通過影響炎癥細胞表型和炎癥因子水平間接調(diào)控機體甘油三酯、膽固醇等代謝物質(zhì)水平，進而參與胰島素抵抗的發(fā)生。因此，控制機體ITCH蛋白的表達，可能是預(yù)防或治療胰島素抵抗和2型糖尿病的新方法。但也有少數(shù)報道，如前所述，ITCH作用于底物TXNIP可減輕機體炎癥狀態(tài)。目前關(guān)于ITCH參與胰島素抵抗的具體分子機制還未明確，有待未來深入研究，為胰島素抵抗相關(guān)疾病提供新的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。