鈣蛋白酶2及自噬相關(guān)蛋白5對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡的影響*

陳雨絲，韓 冰，鄭 璐，蔡 爽，湯 雷，楊 毅，郭怡歆，梁 猜， 趙金有， 楊 婷， 楊 勤， 謝汝佳

（貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省常見(jiàn)慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，貴州貴陽(yáng)550025）

細(xì)胞凋亡（apoptosis）屬于程序性細(xì)胞死亡的方式之一，是通過(guò)激活特定的信號(hào)通路、受到嚴(yán)格控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡的過(guò)程。細(xì)胞凋亡在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)和保證組織器官正常生理功能中具有重要意義，但是如果細(xì)胞凋亡過(guò)度也會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生［1］。且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為真核細(xì)胞重要的膜性細(xì)胞器，對(duì)細(xì)胞的調(diào)控起著非常重要的作用，一旦如饑餓、Ca2+平衡紊亂、氧化應(yīng)激等有害因素侵襲時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)被打破，大量的未折疊蛋白和錯(cuò)誤折疊蛋白累積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）發(fā)生，而ERS一旦持續(xù)或加重，就會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［2］。因此，ERS時(shí)，細(xì)胞為了對(duì)抗一系列有害因素的侵襲會(huì)啟動(dòng)其它的蛋白質(zhì)降解途徑來(lái)對(duì)其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)堆積的未折疊蛋白和錯(cuò)誤折疊蛋白進(jìn)行降解，從而恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)［3］。近年來(lái)的研究證明，自噬（autophagy）作為真核生物細(xì)胞內(nèi)除泛素-蛋白酶體降解系統(tǒng)的另一種蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，參與了對(duì)未折疊蛋白和錯(cuò)誤折疊蛋白的降解過(guò)程，而自噬相關(guān)蛋白5（autophgy-related protein 5，Atg5）可與Atg12結(jié)合，形成Atg5-Atg12泛素樣連接系統(tǒng)，再和外膜結(jié)合以促進(jìn)自噬體膜的延伸，最后形成自噬體，因此Atg5在自噬形成初期起著重要重要作用［4］。

鈣蛋白酶（calpain）是鈣依賴(lài)性的半胱氨酸蛋白酶，廣泛分布于絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物組織中。calpain-2是calpain超家族的主要成員之一。有研究表明，calpain-2可能通過(guò)水解Atg5，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)Atg5的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控［5］。然而在肝細(xì)胞中calpain-2與Atg5之間的相互關(guān)系以及對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響卻未見(jiàn)有報(bào)道。本研究采用二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）處理體外培養(yǎng)的大鼠正常肝細(xì)胞BRL-3A，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生ERS，觀(guān)察calpain-2及Atg5對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響。

材料和方法

1 材料

大鼠正常肝細(xì)胞BRL-3A（中國(guó)科學(xué)院典型細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心上海細(xì)胞庫(kù)）；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco）；胰酶、彩虹Marker、BCA蛋白定量試劑盒和DTT（北京索萊寶科技有限公司）；細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo）；兔抗β-actin抗體、兔抗Atg5抗體、兔抗Atg7抗體和兔抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈 3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）抗體（Abcam）；兔抗calpain-2抗體（Thermo）；Protein G瓊脂糖微珠（Cell Signaling Technology）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)BRL-3A細(xì)胞，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次，細(xì)胞密度達(dá)85～90%時(shí)以1∶3傳代備用。

2.2 多功能實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析儀（real-time cell analysis，RTCA）檢測(cè)不同濃度的DTT對(duì)BRL-3A細(xì)胞增殖的影響 RTCA DP系統(tǒng)可通過(guò)E-plate底部的電極檢測(cè)貼壁細(xì)胞的電阻抗，來(lái)反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)、活力以及貼壁的情況，將細(xì)胞指數(shù)（cell index，CI）作為檢測(cè)指標(biāo)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用含EDTA胰酶消化后制成細(xì)胞懸液再進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每孔7×103個(gè)細(xì)胞接種于E-plate，等細(xì)胞貼壁后再分別加入終濃度為0 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、4.0 mmol/L和6.0 mmol/L的DTT處理BRL-3A細(xì)胞，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，連續(xù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)60 h，觀(guān)察不同濃度的DTT對(duì)BRL-3A細(xì)胞增殖的影響，每10 min記錄1次，最后采用RTCA軟件來(lái)分析獲得CI值并篩選出后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳藥物濃度。

2.3 ERS細(xì)胞模型的建立 根據(jù)RTCA實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用終濃度為2.0 mmol/L的DTT誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞發(fā)生ERS，處理時(shí)間分別為0 h、6 h、12 h和24 h，收集細(xì)胞樣本用于real-time PCR、Western blot、免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞處理方法同2.3。用不含EDTA的胰酶消化各組細(xì)胞，收集各組細(xì)胞至離心管中，2 000 r/min離心5 min后棄上清，然后用預(yù)冷的PBS洗滌，2 000 r/min離心5 min各2次。加入500μL的binding buffer懸浮細(xì)胞，每一組細(xì)胞中加入5μL的annexin V-FITC混勻，再加入5μL的PI混勻，室溫下避光反應(yīng)10～15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 細(xì)胞處理方法同2.3。用不含EDTA的胰蛋白酶消化各組細(xì)胞，收集各組細(xì)胞至離心管中，2 000 r/min離心5 min，棄上清，再以預(yù)冷的PBS洗滌，2 000 r/min離心5 min，棄上清后各組加入500μL無(wú)水乙醇固定4℃過(guò)夜，次日1 000 r/min離心3～5 min，棄掉無(wú)水乙醇，再以PBS洗滌后1 000 r/min離心3～5 min，棄上清。配制PI/RNase A染色工作液，各組分別加入工作液500μL，混勻后避光反應(yīng)30～60 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.6 real-time PCR法檢測(cè)calpain-2和Atg5的mRNA表達(dá)水平 將每組細(xì)胞用PBS洗滌2次，再加入1.0 mL的TRIzol裂解液置于冰上裂解10 min，收集細(xì)胞裂解液提取RNA，用核酸蛋白儀測(cè)定RNA濃度，并根據(jù)A260/A280的比值確定所提取的RNA的純度，且所有樣本的A260/A280的比值均在1.8～2.0范圍內(nèi)則符合實(shí)驗(yàn)要求。按照Thermo K1622逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5×reaction buffer 4μL，dNTP Mix 2μL，Oligo dT 1μL，RNase inhibitor 1μL，transcriptase 1μL，RNA樣品為含1μg RNA的體積，RNase-free H2O補(bǔ)足反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為：25℃10 min，48℃ 60 min，95℃ 5 min。逆轉(zhuǎn)錄后合成的cDNA保存在-4℃短期內(nèi)使用。然后按照說(shuō)明書(shū)配制實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各 1 μL，cDNA模板2μL，RNase-free H2O 8.5μL，總體積25 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。mRNA相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt表示。實(shí)驗(yàn)所用的引物序列見(jiàn)表1。

2.7 Western blot法檢測(cè)calpain-2、Atg5、Atg7、Atg12和LC3的蛋白水平變化 收集各組細(xì)胞，分別加入120μL細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解10 min，收集細(xì)胞懸液于4℃、12 000 r/min離心30 min，取上清。BCA工作法進(jìn)行蛋白定量，以40μg總蛋白上樣然后進(jìn)行SDS-PAGE，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST封閉90 min。將兔抗calpain-2、Atg5、Atg7、Atg12和LC3抗體用I抗稀釋液按照說(shuō)明書(shū)上的比例稀釋后與PVDF膜置于4℃搖床孵育過(guò)夜，次日用TBST洗膜3遍后再與II抗（1∶4 000）室溫孵育60 min，TBST洗膜3遍，ECL發(fā)光成像，βactin作為內(nèi)參照，用Image Lab圖像分析軟件對(duì)樣本每一個(gè)條帶的灰度值進(jìn)行半定量分析。

表1 Real-time PCR的引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

2.8 Co-IP法檢測(cè)calpain-2與Atg5之間的相互作用關(guān)系 將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和DTT組，DTT組采用終濃度為2.0 mmol/L DTT處理24 h，對(duì)照組則加入等體積PBS處理24 h。棄培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，每皿加入500μL裂解液，冰上裂解10 min。用細(xì)胞刮分別收集至1.5 mL的EP管中，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清至新的EP管中，BCA工作法定量，將抗體按免疫共沉淀所需1∶50比列添加至200 μL濃度為1 g/L的裂解物中，4℃旋轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜。次日，加入Protein G瓊脂糖微珠各20μL，4℃旋轉(zhuǎn)孵育3 h后，4℃、10 000 r/min離心1 min，棄上清，800μL洗滌液洗滌沉淀5次，然后分別加入2×上樣緩沖液20 μL，渦旋震蕩后14 000×g瞬時(shí)離心30 s，樣品加熱至 95～100℃，5 min后14 000×g離心 1 min，進(jìn)行Western blot。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組之間比較則采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 RTCA動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)不同濃度的DTT對(duì)BRL-3A細(xì)胞增殖的影響

與0 mmol/L DTT組相比，0.5 mmol/L DTT和1.0 mmol DTT對(duì)BRL-3A細(xì)胞增殖并沒(méi)有明顯的抑制作用，而2.0 mmol/L DTT對(duì)細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用（P＜0.05），且隨著濃度的增加，DTT對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用更明顯，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Dynamic monitoring of the normalize cell index of the BRL-3A cells treated with DTTat different concentrations by xCELLigence RTCA system（A），and the viability of BRL-3A cells exposed to DTTat different concentrations for 24 h（B）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs0 mmol/L group.圖1 xCELLigence RTCA系統(tǒng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)不同濃度DTT處理的BRL-3A細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞指數(shù)

2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BRL-3A細(xì)胞凋亡情況

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，2.0 mmol/L DTT處理BRL-3A細(xì)胞0 h、6 h、12 h和24 h后，0 h組細(xì)胞凋亡率為（4.41±3.41）%，6 h組細(xì)胞凋亡率為（2.70±6.76）%，DTT作用時(shí)間延長(zhǎng)后，12 h組細(xì)胞凋亡率為（12.13±7.19）%，24 h組的細(xì)胞凋亡率為（22.71±19.25）%，細(xì)胞凋亡率隨著DTT作用時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)一步增加（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BRL-3A細(xì)胞的細(xì)胞周期分布

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，DTT 6 h、12 h和24 h組的細(xì)胞周期分布與0 h組相比均發(fā)生明顯變化，細(xì)胞周期均被阻滯在G1期，且S期及G2/M期細(xì)胞比例明顯下降，見(jiàn)圖3及表2。

4 Real-time PCR檢測(cè)calpain-2和Atg5的mRNA表達(dá)變化

Real-time PCR結(jié)果顯示，與0 h組比較，DTT處理BRL-3A細(xì)胞6 h后，calpain-2和Atg5的mRNA水平表達(dá)增加，且DTT處理BRL-3A細(xì)胞12 h后mRNA表達(dá)水平達(dá)到最高；DTT處理BRL-3A細(xì)胞24 h后，calpain2和Atg5的mRNA表達(dá)水平雖較12 h有所下降，但仍然明顯高于 0 h組和 6 h組（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

5 DTT 處理 BRL-3A 細(xì)胞后 calpain-2、Atg5、Atg7、Atg12及LC3的蛋白表達(dá)變化

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與0 h組相比，DTT處理細(xì)胞6 h、12 h和24 h后Atg12、Atg7及calpain-2蛋白表達(dá)水平逐漸升高（P＜0.05），LC3的蛋白表達(dá)較0 h組明顯增加，且LC3-II/LC3-I的比值也較0 h組顯著增大（P＜0.05），而Atg5的蛋白表達(dá)水平逐漸降低（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

6 Co-IP檢測(cè)calpain-2和Atg5的相互作用

2.0 mmol/L DTT處理BRL-3A細(xì)胞24 h后，用抗Atg5的抗體不僅能夠在細(xì)胞裂解物中檢測(cè)到Atg5的存在，并且也能檢測(cè)到calpain-2的存在，而對(duì)照組僅能檢測(cè)到Atg5的存在；用抗calpain-2抗體進(jìn)行反向Co-IP發(fā)現(xiàn)，在DTT處理24 h的細(xì)胞裂解物中不僅能檢測(cè)到calpain-2的存在，同時(shí)也能檢測(cè)到Atg5的存在，而對(duì)照組僅能檢測(cè)到calpain-2的存在，見(jiàn)圖6。由此可以說(shuō)明，在DTT誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生ERS的過(guò)程中，calpain-2和Atg5存在相互作用關(guān)系。

Figure 2.The effect of DTTtreatment on the apoptosis of BRL-3A.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs0 h group.圖2 DTT處理后對(duì)BRL-3A細(xì)胞凋亡的影響

Figure 3.The effect of DTTtreatment on the cell cycle of BRL-3A cells.圖3 DTT處理BRL-3A細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞周期的影響

表2 DTT對(duì)BRL-3A細(xì)胞周期分布的影響Table 2.Effect of DTTtreatment on the cell cycle distribution of BRL-3A cells（%.Mean±SD.n=3）

討 論

肝細(xì)胞凋亡是調(diào)節(jié)肝組織正常細(xì)胞更新、增殖及再生的重要機(jī)制，同時(shí)也是造成肝臟損傷以及肝臟疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。肝細(xì)胞凋亡過(guò)度會(huì)導(dǎo)致各種肝臟疾病的發(fā)生，例如肝功能衰竭、肝纖維化等。因此，深入研究肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制對(duì)臨床肝臟疾病的防治具有重要意義［8-10］。

Figure 4.The mRNA expression of calpain-2 and Atg5 after DTT stimulation.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs 0 h group.圖4 Real-time PCR檢測(cè)DTT處理細(xì)胞后calpain-2和Atg5的mRNA表達(dá)

ERS信號(hào)通路是繼死亡受體通路和線(xiàn)粒體通路后新發(fā)現(xiàn)的一條細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。ERS時(shí)，細(xì)胞通過(guò)激活未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），一方面使細(xì)胞周期停滯在G1/S期，另一方面可抑制蛋白質(zhì)的合成以減輕蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的聚集；此外，還可通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解系統(tǒng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚集的蛋白質(zhì)進(jìn)行清除。通過(guò)上述一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以減輕或終止ERS，從而恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。但是ERS如果持續(xù)存在或加重，超過(guò)細(xì)胞自身代償能力時(shí)也可誘發(fā)細(xì)胞凋亡［2，9］。

Figure 5.The protein levels of Atg5，calpain-2，Atg12，Atg7 and LC3 in the BRL-3A cells exposed to 2.0 mmol/L DTT at different time points.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs0 h group.圖5 2.0 mmol/L DTT處理BRL-3A細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)Atg5、calpain-2、Atg12、Atg7和LC3蛋白水平的影響

Figure 6.Co-IPdetection of the interaction between Atg5 and calpain-2 in the BRL-3A cells treated with DTT.圖6 Co-IP檢測(cè)DTT處理BRL-3A細(xì)胞后Atg5與calpain-2之間的相互作用

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，采用2.0 mmol/L DTT處理體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞6、12和24 h后，ERS信號(hào)通路中相關(guān)信號(hào)分子GRP78、p-PERK、ATF4和CHOP的表達(dá)水平顯著上調(diào)，說(shuō)明2.0 mmol/L DTT處理細(xì)胞能夠誘導(dǎo)ERS的發(fā)生［9］，因此在本次實(shí)驗(yàn)中仍然采用2.0 mmol/L DTT處理細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DTT處理細(xì)胞6、12和24 h后，G1期細(xì)胞較對(duì)照組（0 h組）顯著增加，說(shuō)明DTT處理細(xì)胞后細(xì)胞周期被阻滯在G1期。此外，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DTT處理細(xì)胞不同時(shí)間后，自噬相關(guān)指標(biāo)Atg12、Atg7和LC3蛋白表達(dá)水平均較0 h組顯著上調(diào)，且LC3-II/LC3-I的比值也較0 h組明顯增大。由于LC3有LC3-I和LC3-II兩種形式，隨著自噬的發(fā)生，LC3-I與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合而轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3-II；當(dāng)自噬泡膜閉合時(shí)，只有LC3-II定位于自噬泡膜上，因此LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化可作為自噬發(fā)生的標(biāo)志。自噬作為真核生物細(xì)胞內(nèi)除泛素-蛋白酶體降解系統(tǒng)外的另一種蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，廣泛參與了ERS時(shí)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中聚集的蛋白質(zhì)的降解過(guò)程［4］。因此，ERS時(shí)自噬水平增高可能是細(xì)胞的一種重要代償保護(hù)機(jī)制，可在一定程度上減輕ERS，從而發(fā)揮保護(hù)肝細(xì)胞的作用［7］。上述研究結(jié)果提示，DTT誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生ERS時(shí)，細(xì)胞通過(guò)啟動(dòng)UPR，一方面阻止細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，另一方面通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)（上調(diào)細(xì)胞自噬水平）對(duì)聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)進(jìn)行清除，以求恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。但是本研究也發(fā)現(xiàn)，DTT處理細(xì)胞不同時(shí)間后，細(xì)胞凋亡較對(duì)照組（0 h組）顯著增多，呈明顯的時(shí)間依賴(lài)性，提示可能還有其他信號(hào)通路參與了對(duì)ERS的調(diào)控。

在本次研究中還觀(guān)察到一個(gè)有趣的現(xiàn)象，當(dāng)DTT誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生ERS后，與Atg12、Atg7和LC3的蛋白表達(dá)變化不同，Atg5的蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組（0 h組）顯著降低。Atg5是在自噬體形成過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)，它可與Atg12結(jié)合，形成Atg5-Atg12泛素樣連接系統(tǒng)，再和外膜結(jié)合以促進(jìn)自噬體膜的延伸，最后形成自噬體［10-14］。由此可見(jiàn)，Atg5在自噬過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。為了進(jìn)一步明確Atg5蛋白水平的下調(diào)是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平還是轉(zhuǎn)錄后水平，我們進(jìn)一步對(duì)Atg5的mRNA表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DTT處理細(xì)胞后，Atg5的mRNA水平較對(duì)照組（0 h組）顯著升高，提示Atg5蛋白水平降低可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。

近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，calpain家族成員calpain-2可能參與了對(duì)Atg5轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控［15-16］。calpain-2是細(xì)胞內(nèi)的一種蛋白水解酶，可通過(guò)水解多種底物蛋白參與疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，這其中可能也包括對(duì)Atg5的水解。例如Yousefi在研究中發(fā)現(xiàn)，calpain-2可能通過(guò)水解Atg5，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)Atg5的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控［15］。為了證實(shí)在肝細(xì)胞中是否也存在這一調(diào)控過(guò)程，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了細(xì)胞中calpain-2的mRNA及蛋白表達(dá)含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DTT處理細(xì)胞后，calpain-2的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)。這提示當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生ERS時(shí)，Atg5蛋白水平的降低可能與calpain-2的表達(dá)增多有關(guān)。為證實(shí)這一猜測(cè)，我們采用Co-IP的方法對(duì)Atg5與calpain-2的相互作用關(guān)系進(jìn)行了研究。結(jié)果證實(shí)，DTT處理細(xì)胞24 h后，利用calpain-2抗體能夠?qū)alpain-2蛋白及與其發(fā)生相互作用的Atg5蛋白共同沉淀下來(lái)；反之，利用Atg5抗體也能夠?qū)tg5蛋白及與其發(fā)生相互作用的calpain-2蛋白共同沉淀下來(lái)，而在對(duì)照組則未檢測(cè)到這一現(xiàn)象。上述研究結(jié)果提示，肝細(xì)胞發(fā)生ERS時(shí)，calpain-2蛋白與Atg5蛋白之間的確發(fā)生了相互作用，而Atg5蛋白水平的降低可能與calpain-2、Atg5之間的相互作用并對(duì)Atg5進(jìn)行水解有關(guān)。由于Atg5是自噬體形成過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)減少將影響自噬體的形成，導(dǎo)致細(xì)胞自身代償機(jī)制不充分，從而使肝細(xì)胞走向凋亡。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們將進(jìn)一步采用calpain-2和Atg5的免疫熒光共定位以及calpain-2抑制劑等方法來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證兩者之間的相互關(guān)系。