孤獨癥譜系障礙實驗動物模型研究進展

李 燊，吳海濤，2

（1.青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認知與腦科學(xué)研究所，北京 100850）

孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）是一種神經(jīng)發(fā)育相關(guān)精神疾病，具有復(fù)雜的遺傳和環(huán)境成因。1943年，美國兒童精神病醫(yī)師KANNER[1]報道了11例ASD患兒的臨床癥狀，成為ASD診斷的重要基礎(chǔ)。ASD典型特征主要表現(xiàn)為社會交往障礙和重復(fù)刻板樣行為，部分ASD患者同時存在智力障礙和癲癇。ASD全球患病率為1.7%[2]，并逐年升高。ASD一旦發(fā)病，其癥狀會伴隨終生，對家庭和社會帶來沉重的精神和經(jīng)濟負擔(dān)?，F(xiàn)階段，對于ASD的診斷和治療仍缺乏行之有效的手段和方法，迫切需要通過深入的發(fā)病機制探討，來探尋其病因及病理生理學(xué)進程，為新型臨床診療和干預(yù)措施研發(fā)提供理論依據(jù)和實驗支撐。

目前，關(guān)于ASD的生物學(xué)研究主要圍繞經(jīng)典的實驗動物模型展開。因此，構(gòu)建穩(wěn)定可靠的ASD動物模型，對于深入探索ASD發(fā)病機制、病理生理進程、行為學(xué)變化及診斷治療等具有至關(guān)重要的研究價值?；诓煌瑢嶒瀯游锬Ｐ驮贏SD研究中的重要性，本綜述將重點圍繞近年來用于構(gòu)建ASD的常見模式動物及其構(gòu)建方法進展進行梳理和總結(jié)，以期為ASD相關(guān)實驗研究提供線索和依據(jù)。

1 孤獨癥譜系障礙研究常用的模式動物

基于模式動物在ASD研究中的重要價值，當(dāng)前，國內(nèi)外不同實驗室已成功構(gòu)建了包括非人靈長類、嚙齒類、鳴禽、斑馬魚、果蠅、海兔和秀麗隱桿線蟲等在內(nèi)的多種ASD模式動物。

各類模式動物的構(gòu)建旨在模擬與ASD相關(guān)的核心表型，包括社交和溝通障礙、興趣受限和刻板重復(fù)樣行為等。并在此基礎(chǔ)上，借助各類ASD模式動物在不同層面和維度深入解析ASD發(fā)病機制。我們將現(xiàn)有文獻報道的常用ASD相關(guān)模式動物及其研究優(yōu)勢總結(jié)如下（表1）。

2 常見孤獨癥譜系障礙動物模型構(gòu)建方法

由于ASD發(fā)病機制復(fù)雜，需要借助不同方式構(gòu)建不同類型的ASD動物模型。目前ASD動物模型的構(gòu)建方法主要分為遺傳學(xué)方法、化學(xué)藥物誘發(fā)和生物因素誘導(dǎo)3大類。

2.1 基于遺傳學(xué)方法構(gòu)建

大多數(shù)研究者認為，ASD的病因及發(fā)病機制與遺傳因素密切相關(guān)。隨著基因組學(xué)研究的迅速發(fā)展，借助新型基因測序技術(shù)，人們獲得了大批ASD相關(guān)易感及致病基因。近年來，隨著鋅指核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶以及CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)的發(fā)展，使基因突變動物模型迅速發(fā)展。目前熱門的突變基因主要包括編碼突觸黏附蛋白神經(jīng)配蛋白（neuroligin，NL）基因和神經(jīng)連接蛋白（neurexin，NR）類基因，Rett綜合征MeCP2基因，染色體22q13.3缺失綜合征Shank3基因，結(jié)節(jié)性硬化綜合征1（tuberous sclerosis complex 1，Tsc1）和Tsc2基因和脆性X綜合征Fmr1基因等（表2）。

表1 實驗室常見孤獨癥譜系障礙（ASD）模式動物類型及其研究優(yōu)勢

2.1.1 神經(jīng)配蛋白

NL是存在于突觸后膜上的細胞黏附分子，與NR相互作用促進突觸前膜和后膜的形成。NL-1敲除小鼠和NL-1 P89L敲入小鼠均表現(xiàn)出空間記憶受損。NL-1敲除小鼠顯示出強烈的梳理刻板行為表型，而NL-1 P89L雜合子小鼠則未顯示異常的刻板梳理行為[14-15]。另外，NL-2敲除小鼠也表現(xiàn)出ASD樣行為，其社交行為正常，但焦慮樣行為增加，疼痛敏感性降低以及運動協(xié)調(diào)性差[16]。NL-3缺失小鼠則表現(xiàn)出超聲發(fā)聲受損和社會記憶改變[17]。MODI等[18]發(fā)現(xiàn)，NL-3 敲除小鼠表現(xiàn)出明顯的社交能力缺陷。 ROTHWELL等[19]報道了NL-3 R451C敲入小鼠具有社交新穎性偏好缺陷、過度活躍和重復(fù)行為等ASD相關(guān)行為表型。浙江大學(xué)羅建紅等[20]利用NL-3 R451C敲入小鼠進一步研究發(fā)現(xiàn)，前額葉皮質(zhì)腦區(qū)gamma振蕩異?？赡苁菍?dǎo)致小鼠社交行為障礙的主要原因，而通過操控前額葉皮質(zhì)腦區(qū)抑制性PV中間神經(jīng)元可有效逆轉(zhuǎn)NL-3 R451C敲入小鼠的社交缺陷。

HAMILTON等[21]還描述了利用鋅指核酸酶基因編輯方法開發(fā)的NL-3敲除大鼠模型，這為利用大鼠作為研究ASD相關(guān)基因的致病機制提供了重要實驗依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，NL-3敲除大鼠表現(xiàn)出過度活躍，且對驚恐刺激產(chǎn)生的前脈沖抑制受損，腦電圖研究顯示，該突變大鼠睡眠中斷與ASD患者睡眠障礙癥狀高度一致[22]。

2.1.2 神經(jīng)連接蛋白

NR編碼α和β神經(jīng)毒素，并且作為NR的突觸前結(jié)合配體，在突觸的黏附、分化和成熟中具有重要作用。目前較常見的模型鼠來自NR-1α/2α/3α3個基因全部敲除的小鼠，或來自NR-1α/2α雙敲小鼠。與野生型小鼠對比，三敲和雙敲小鼠分別在腦干和新皮質(zhì)中顯示較少的抑制性突觸[23]。

ESCLASSAN等[24]發(fā)現(xiàn)，NR-1α敲除大鼠存在顯著的非社會性認知缺陷，最顯著的行為表型是類似多動癥的過度活躍。有趣的是，ASD患者也常表現(xiàn)出注意缺陷多動障礙等并發(fā)癥。

Cntnap2是另一類neurexin家族成員，目前在患有智力障礙和ASD的個體中可觀察到Cntnap2基因的隱性突變或染色體倒位。來自鳴禽的研究表明，Cntnap2與人類ASD有關(guān)，且富含與人類語言相關(guān)的神經(jīng)環(huán)路。已有報道，Cntnap2突變的小鼠顯示行為缺陷、多動以及癲癇發(fā)作[25]。

2.1.3 甲基CpG結(jié)合蛋白2

甲基CpG結(jié)合蛋白2（methyl-CpG binding protein 2，MeCP2）靶向突變的ASD小鼠模型與臨床Rett綜合征具有高度的表型一致性。許多研究表明，MeCP2突變小鼠表現(xiàn)出社會行為受損。這些模型包含了許多與人類相似的癥狀，從而為理解ASD行為異常的神經(jīng)機制提供了有價值的實驗體系。

目前，較為經(jīng)典的MeCP2突變小鼠有缺失外顯子3[26]、缺失外顯子3和4[27]以及308X點突變[28]。盡管MeCP2敲除小鼠表現(xiàn)出Rett綜合征患者存在的大多數(shù)發(fā)育和行為缺陷，但在MeCP2過表達小鼠模型中難以鑒定出ASD樣行為[29]。WU等[30]構(gòu)建了MeCP2敲除大鼠模型，其表現(xiàn)出生長遲緩、咬合不正、缺乏運動、前肢握力較弱和顯著的社會交往缺陷。

表2 常見遺傳修飾ASD哺乳類動物模型的構(gòu)建

中科院上海神經(jīng)科學(xué)研究所仇子龍和孫強等[31]基于慢病毒感染策略，構(gòu)建了大腦中過表達人類MeCP2的轉(zhuǎn)基因食蟹猴（Macaca fascicularis），其表現(xiàn)出ASD樣行為并呈現(xiàn)出轉(zhuǎn)基因的種系穩(wěn)定遺傳。來自同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院、昆明理工大學(xué)等單位的研究人員詳細描述了利用轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)編輯MeCP2基因的新型MeCP2突變食蟹猴模型[32]。隨后，ZHANG等[33]探討了MeCP2突變猴的相關(guān)表型，包括靈長類動物獨特的眼動追蹤檢測，結(jié)合磁共振成像分析，發(fā)現(xiàn)了同ASD患者相似的生理、行為和結(jié)構(gòu)異常。此類研究表明，使用基因工程方法構(gòu)建非人靈長類動物模型研究腦部疾病的可行性和可靠性，對于ASD相關(guān)神經(jīng)機制研究以及潛在治療干預(yù)具有重要的研究價值。

2.1.4 SH3和多樣錨蛋白重復(fù)域蛋白

Shanks是一類突觸后密度蛋白，可同多種離子型和代謝型谷氨酸受體相互作用，并與肌動蛋白細胞骨架相聯(lián)系。Shank3的突變與ASD和Phelan-McDermid綜合征有關(guān)，其特征包括全腦發(fā)育遲緩、智力殘疾、言語延遲或缺失和輕微畸形等特征。目前已構(gòu)建了多種針對Shank3的多種動物模型，Shank3正在成為ASD研究的熱點基因。

WANG等[34]描述了ASD相關(guān)Shank3基因敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)-紋狀體-丘腦環(huán)路在突變體中過度活躍，但在社交行為期間活性降低。研究人員還可利用超聲發(fā)聲研究Shank3敲除大鼠的社交溝通行為[35]。MODI等[36]通過利用Shank2敲除大鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出顯著的ASD行為表型，包括過度活躍、運動增加和重復(fù)刻板行為等，其過度活躍的表型可能與紋狀體中mGluR1表達上調(diào)、樹突分支增加和長時程抑制增強有關(guān)。LIU等[37]使用CRISPR/Cas9基因編輯方法構(gòu)建了第一個可遺傳的Shank3b突變斑馬魚模型，其表現(xiàn)出明顯的ASD樣行為和突觸蛋白homer1和突觸素水平改變。JAMES等[38]在斑馬魚Shank3基因突變模型中驗證了腸道運動障礙是由該基因突變所致。

中科院深圳先進院腦認知與腦疾病研究所ZHOU等[39]報道了食蟹猴Shank3的種系可傳播突變非人靈長類動物模型。該突變猴表現(xiàn)出明顯的睡眠障礙、運動缺陷、重復(fù)行為增加及社交和學(xué)習(xí)障礙等，比嚙齒類動物模型更加接近ASD樣行為和神經(jīng)表型。

2.1.5 脆性X智力低下蛋白1

脆性X綜合征主要是由脆性X智力低下基因（fragile X mental retardation 1，F(xiàn)mr1）啟動子中胞嘧啶-鳥嘌呤-鳥嘌呤三核苷酸的擴增引起，少數(shù)是由點突變引起。男童的臨床癥狀較女童更加嚴重，包括智力殘疾、言語遲緩、焦慮、注意力缺陷障礙、多動、癲癇發(fā)作和身體畸形等。

COMERY等[40]描述了Fmr1敲除小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元樹突棘較野生型小鼠更長、細而曲折，且頂樹突的樹突棘密度更大。HE等[41]通過在體雙光子鈣成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)mr1突變小鼠的神經(jīng)元對重復(fù)胡須刺激的適應(yīng)性明顯不足，提示皮質(zhì)感覺回路中適應(yīng)性受損可能是ASD觸覺防御的潛在原因之一。SAXENA等[42]通過穿管實驗研究了Fmr1敲除大鼠社會支配地位和社會等級的變化，為理解Fmr1敲除大鼠群體之間復(fù)雜的社交動態(tài)提供了新見解。

2.1.6 結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物蛋白1/2

Tsc是一種常染色體顯性遺傳的疾病，其特征是在多個器官（包括腦和腎）中產(chǎn)生塊莖樣良性腫瘤，甚至發(fā)展成惡性腫瘤。NORMAND等[43]研究結(jié)果表明，在胚胎后期被缺失丘腦Tsc1，能導(dǎo)致成年小鼠癲癇發(fā)作和強迫性梳理等ASD樣行為。REITH等[44]描述了與浦肯野細胞相關(guān)的Tsc2缺失小鼠模型，該小鼠浦肯野神經(jīng)元損傷并表現(xiàn)出社交障礙、重復(fù)行為和有限的興趣。由于浦肯野細胞缺失是ASD患者中最常見的解剖異常之一，該模型可為相關(guān)病理生理學(xué)研究提供實驗支撐。

2.1.7 其他基因

有研究提示，多巴胺轉(zhuǎn)運體（dopamine transporter，DAT）突變可能也和ASD的發(fā)生密切相關(guān)。自然界中存在一種DAT T365M的突變，即DAT肽鏈的第365位蘇氨酸突變?yōu)榈鞍彼幔诠壷?，該突變被證實可產(chǎn)生包括運動過度、恐懼、重復(fù)動作和社交互動改變等與ASD類似的行為障礙[45]。DICARLO等[46]將該突變引入小鼠中，發(fā)現(xiàn)攜帶DAT T356M基因突變的小鼠表現(xiàn)出社交活動減少、社會支配地位喪失以及埋珠行為減少等行為障礙。

2.2 化學(xué)因素誘發(fā)

經(jīng)過數(shù)十年的研究，大多數(shù)學(xué)者認為，多種化學(xué)因素所致的腦功能發(fā)育障礙可能與ASD關(guān)系密切，進而提出了多種發(fā)病機制假說。常見的由化學(xué)因素誘發(fā)的動物模型主要有丙戊酸（valproic acid，VPA）誘發(fā)模型、沙利度胺（thalidomide）模型和米索前列醇（misoprostol）模型等。

2.2.1 丙戊酸誘發(fā)模型

VPA是一種常用的抗癲癇藥物，也用于治療雙相情感障礙和神經(jīng)性疼痛。臨床研究表明，孕期服用VPA會增加神經(jīng)管缺陷發(fā)生率、發(fā)育遲緩和認知障礙，并可誘發(fā)ASD。研究表明，產(chǎn)前暴露于VPA誘導(dǎo)的胚胎小鼠，其大腦中H3和H4組蛋白短暫高乙?；赡芘c產(chǎn)后ASD樣行為障礙相關(guān)[49]。此外，在大腦發(fā)育階段接觸VPA也可導(dǎo)致ASD樣行為，其機制可能是通過抑制糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）從而促進Wnt信號影響神經(jīng)元發(fā)育過程中的軸突重塑[50]。還有研究發(fā)現(xiàn)，VPA可通過β-catenin-大鼠肉瘤病毒原癌基因蛋白（rat sarcoma viral oncoyene homolog，Ras）-細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶p21（extracellular signal-regulated kinase-p21，ERK-p21）通路影響神經(jīng)祖細胞分化和增殖[51]。還可抑制參與GABA降解的GABA轉(zhuǎn)氨酶，并增強GABA合成酶谷氨酸脫羧酶活性，因此，VPA暴露可能導(dǎo)致GABA水平的顯著升高[52]。總之，胚胎發(fā)育早期暴露于VPA環(huán)境可能會影響大腦發(fā)育過程中神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的成熟，進而導(dǎo)致ASD樣行為表型。

LIU等[53]發(fā)現(xiàn)，VPA誘導(dǎo)的ASD大鼠模型表現(xiàn)出ASD患者相似的腸道菌群失調(diào)。YASUE等[54]研究發(fā)現(xiàn)，VPA暴露可誘發(fā)狨猴缺乏社會動機并降低對其同類的興趣，還發(fā)現(xiàn)該狨猴不會表現(xiàn)出對不公平待遇的厭惡。

2.2.2 沙利度胺模型

沙利度胺可引起多種先天性缺陷，如出生時缺失拇指、四肢發(fā)育不全、眼和耳缺陷及患有先天性心臟病等。TSUGIYAMA等[55]通過將孕大鼠產(chǎn)前第9和10天暴露于沙利度胺制備子代ASD大鼠模型。將該模型大鼠暴露于16 kHz純音環(huán)境下進行聽覺刺激，發(fā)現(xiàn)其具有聽覺過敏表型。NARITA等[56]檢測了暴露于沙利度胺的大鼠行為學(xué)表型，僅發(fā)現(xiàn)其學(xué)習(xí)能力受損，未發(fā)現(xiàn)其他典型的ASD樣行為表型。

2.2.3 米索前列醇模型

米索前列醇是一種前列腺素類似物，通常用于防治胃潰瘍。有證據(jù)表明，產(chǎn)前暴露于高劑量（40 μg·kg-1）米索前列醇可導(dǎo)致默比烏斯綜合征、顱神經(jīng)核受損而導(dǎo)致單側(cè)或雙側(cè)面神經(jīng)麻痹、肌肉或骨骼肌畸形以及ASD樣行為癥狀。KOENIG等[57]研究發(fā)現(xiàn)，孕期暴露于米索前列醇40 μg·kg-1的小鼠，其子代呈現(xiàn)出明顯的異常行為，但并未發(fā)現(xiàn)顯著的ASD樣行為和神經(jīng)功能障礙。由于目前尚無令人信服的證據(jù)表明孕期暴露米索前列醇是神經(jīng)發(fā)育障礙（包括ASD）的一個危險因素，因此，未來仍需進一步深入開展相關(guān)研究。

2.3 生物因素誘導(dǎo)

2.3.1 腸道菌群（gut microbiota，GM）模型

研究表明，GM的變化可調(diào)節(jié)胃腸生理、免疫功能甚至行為，GM中的特定細菌與ASD相關(guān)表型之間也可能存在一定相關(guān)性[58]。CORETTI等[59]研究了具有ASD相關(guān)表型的特發(fā)性BTBR T+tf/J近交系小鼠的GM變化，發(fā)現(xiàn)其GM顯著異常、腸道通透性增加以及免疫失調(diào)。SHARON等[60]將來自ASD患者和正常人的GM移植到無菌小鼠腸道中，證實源自ASD患者的GM足以誘導(dǎo)明顯的ASD樣行為。目前研究認為，GM可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)活性代謝產(chǎn)物影響小鼠行為，表明腸-腦軸可能與ASD的發(fā)病和病理生理學(xué)進程密切相關(guān)。

2.3.2 丙酸（propionic acid，PPA）模型

PPA為一種短鏈脂肪酸，是腸道細菌代謝終產(chǎn)物，也是一種常見食品防腐劑。許多研究表明，PPA可引起大鼠ASD樣行為和神經(jīng)炎癥反應(yīng)。MACFABE等[61]發(fā)現(xiàn)，PPA處理的大鼠表現(xiàn)出對特定物體興趣減少和社交行為減弱的特征，免疫組織化學(xué)分析顯示，其腦組織反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞增生和小膠質(zhì)細胞活化，表明其具有先天性神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

LOBZHANIDZE等[62]探討PPA對大鼠社交行為、焦慮行為和杏仁核中央核超微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，急性給予相對較低劑量的PPA（175 mg·kg-1）即可導(dǎo)致大鼠社交行為顯著減少。上述研究結(jié)果為利用PPA建立嚙齒類ASD動物模型提供了實驗依據(jù)，但這種模型與人類ASD之間的相關(guān)性仍有待進一步深入驗證。

2.3.3 博爾納病病毒（Borna disease virus，BDV）模型

BDV是一種高度嗜神經(jīng)性、非節(jié)段性、單股負鏈的RNA病毒。感染BDV的新生鼠表現(xiàn)為海馬和小腦發(fā)育異常和學(xué)習(xí)的障礙，這與一些ASD患兒的行為障礙表現(xiàn)較為一致。PLETNIKOV等[63]利用BDV感染幼年大鼠建立了一種全新的ASD動物模型，該動物模型表現(xiàn)出感覺、運動、社交、情緒和認知等多種行為障礙。BDV作為一個獨特的致畸因子，可望用于研究遺傳與環(huán)境相互作用的病理生理學(xué)機制，也有助于開展臨床前藥物治療測試。

3 展望

本文主要針對目前實驗室常見的孤獨癥譜系障礙實驗動物模型及其構(gòu)建方法進行了系統(tǒng)梳理和總結(jié)，相關(guān)研究可望為深入理解ASD的病因、發(fā)病機制和診療提供理論依據(jù)和實驗支撐。需指出，由于不同ASD患者在遺傳和表型方面存在較大差異，因此，很難明確哪種實驗動物模型或哪種構(gòu)建方法是模擬ASD發(fā)生的最佳模型，不同模型之間只有相互借鑒、優(yōu)勢互補才能最大限度地發(fā)揮其研究價值。

隨著發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、連接組學(xué)、新型多光子在體成像技術(shù)、單細胞技術(shù)和誘導(dǎo)多能干細胞等學(xué)科和技術(shù)的不斷完善和突破，未來神經(jīng)科學(xué)家們可借助新工具和新方法產(chǎn)生的新信息和線索，用于指導(dǎo)新型實驗動物模型的制備和研究，必將進一步深化對ASD致病機制的理解，為開發(fā)新型ASD診療手段提供重要支撐。