小鼠條件性恐懼模型的建立和品系敏感性研究

薛 瑞，魏肇余，張森品，陳紅霞，李云峰，張有志

（軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850）

創(chuàng)傷后應激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）是指個體經(jīng)歷、目睹或遭遇到一個或多個重大創(chuàng)傷性事件所導致的延遲出現(xiàn)和持續(xù)存在的一類精神障礙[1]。1980年，“美國精神疾病診斷與統(tǒng)計手冊”第三版（DSM-Ⅲ）首次定義了該疾病和明確了診斷標準，最新出版的DSM-Ⅴ將PTSD從焦慮障礙中分離出來，與急性應激障礙、適應障礙等歸入創(chuàng)傷及應激相關障礙分類下[1-2]。流行病學研究表明，創(chuàng)傷事件發(fā)生后PTSD的終生患病率為1.3%～12.2%，其中女性發(fā)病率高于男性，兒童期遭遇創(chuàng)傷風險高于成人期[2-3]。目前PTSD的治療以心理干預和藥物治療相結(jié)合的方式為主，以舍曲林和氟西汀為代表的5-羥色胺重攝取抑制劑被認為是PTSD治療的首選用藥[4-5]。

PTSD病理機制研究和新藥評價依賴于理想的PTSD動物模型，然而由于發(fā)病機制復雜，單一模型無法全面模擬其核心癥狀，因此多采用多模型結(jié)合的方式評價疾病和藥物的作用特點。PTSD的核心癥狀群包括創(chuàng)傷事件闖入性回憶、創(chuàng)傷線索回避、高警覺和反應性及認知與情感的負性改變，其中創(chuàng)傷性事件闖入性回憶與恐懼記憶的再現(xiàn)具有相似的過程和表現(xiàn)[2]。條件性恐懼模型被認為是模擬評價創(chuàng)傷事件闖入性回憶的經(jīng)典模型，此外，它還可評價恐懼記憶不同階段的特點，為我們精準評價疾病發(fā)生和藥物作用特點提供了良好的工具。

本研究首先通過預實驗對文獻方法[6-8]進行改進，建立穩(wěn)定的小鼠條件性恐懼模型，進而以ICR小鼠、DBA/2小鼠（后簡稱DBA小鼠）和C57BL/6J小鼠（后簡稱C57小鼠）為研究對象，通過評價不同品系小鼠在場景恐懼和聲音線索恐懼獲得與表達的敏感性確定了C57為敏感品系鼠，并對C57小鼠條件性恐懼的自然消退和聲音線索恐懼消退訓練和保持進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

ICR小鼠和C57小鼠，雄性，SPF級，體質(zhì)量18～20 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0002。DBA小鼠，雄性，SPF級，體質(zhì)量18～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)溫度 22～26℃，濕度40%～60%，8∶00-20∶00燈光照明，自由攝食飲水。

1.2 主要儀器

條件性恐懼檢測系統(tǒng)：包括條件性恐懼測試箱和Video Freeze SOF-843僵住時間采集軟件（美國Med Associates Inc.公司）。

1.3 小鼠條件性恐懼模型的建立

小鼠購入后適應性飼養(yǎng)6 d，實驗當天提前1 h放入實驗間。不同品系小鼠放入電擊箱內(nèi)（A環(huán)境）自由探索2 min（適應期）后，給與30 s聲音刺激（85 dB，5000 Hz），后2 s伴隨給與不可逃避的足底電擊（0.6 mA，持續(xù)2 s），聲音-電擊共配對5次，每次間隔2 min。計算機軟件記錄各個階段（包括適應期、5輪聲音刺激期和5輪間歇期）的僵住時間，僵住時間百分率（%）=僵住時間（s）/總時間（s）×100%。僵住行為是嚙齒類動物表達恐懼的方式，表現(xiàn)為除呼吸運動外全身其余的肌肉運動均消失[9]。

1.4 場景恐懼和聲音線索恐懼表達的檢測

場景恐懼表達檢測：條件性恐懼訓練24 h后，將小鼠再次置于接受過電擊的裝置（環(huán)境A：足底電柵欄+白光）中，不給與任何刺激，進行環(huán)境重現(xiàn)，記錄5 min內(nèi)的僵住時間，計算僵住時間百分率，評價3種品系小鼠場景條件恐懼表達的特點。

聲音線索恐懼表達檢測：場景恐懼檢測2 h后，將小鼠置于新環(huán)境（環(huán)境B：三角形半透明黑色套盒+白色底板+無白光）中，2 min適應期后進行30 s聲音刺激，聲音刺激結(jié)束30 s后將動物取出，記錄各個階段（包括適應期、聲音刺激期和間歇期）的僵住時間，計算僵住時間百分率，用于評價3種品系小鼠線索條件恐懼表達的特點。

1.5 條件性恐懼的自然消退

以C57小鼠為研究對象，分別于條件性恐懼訓練后第2，7，14，21和28天對其場景恐懼和聲音線索恐懼進行檢測，以評價該品系小鼠條件性恐懼的自然消退特點。其中，場景恐懼檢測5 min內(nèi)僵住時間（環(huán)境A，無聲音信號，不電擊），聲音線索恐懼檢測30 s聲音刺激期內(nèi)僵住時間（環(huán)境B，不電擊，2 min適應+30 s聲音信號+30 s間歇），計算僵住時間百分率。

1.6 聲音線索恐懼消退訓練和消退保持測試

以C57小鼠為研究對象，在條件性恐懼訓練（方法見1.3）后24 h進行聲音線索恐懼消退訓練，消退訓練結(jié)束后24 h進行消退保持測試。消退訓練方法：將C57小鼠放入B環(huán)境電擊箱中，適應2 min后，采用“30 s聲音刺激+30 s間歇期”方法給與10次聲音刺激，計算機軟件記錄適應期、10輪聲音刺激階段和10輪間歇期的僵住時間，計算僵住時間百分率，作為消退訓練成績。消退保持測試方法：將C57小鼠放入B環(huán)境電擊箱中，適應2 min后，給與30 s聲音刺激1次，刺激結(jié)束30 s后將動物取出，記錄不同階段（適應期+30 s聲音刺激期+30 s間歇期）內(nèi)僵住時間并計算僵住時間百分率，作為消退保持成績。

1.7 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用±s表示，采用Prism8.0軟件進行統(tǒng)計。兩組間比較采用Studentt或Manny-Whitney檢驗，多組間比較采用單因素方差分析和Dunnettt或Tukey檢驗，不同時間點檢測僵住時間百分率數(shù)據(jù)采用重復測量的單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3種品系小鼠條件性恐懼獲得的差異性

3種品系模型組小鼠隨聲音/場景-電擊配對次數(shù)增加均呈現(xiàn)僵住時間百分率增加（圖1），其中ICR小鼠末次檢測的僵住時間百分率為（29±22）%，DBA小鼠為（35±19）%，C57小鼠為（81±20）%。3種品系正常組小鼠不同時間點僵住時間百分率無明顯波動。

2.2 3種品系小鼠條件性恐懼表達的差異性

條件性恐懼訓練24 h后，分別進行場景恐懼檢測和聲音線索恐懼檢測，評價不同品系小鼠條件性恐懼表達的差異。ICR，DBA和C57模型組小鼠場景恐懼的僵住時間百分率分別為（8±11）%，（26±20）%和（45±16）%（圖2），其中DBA小鼠和C57小鼠模型組與對照組相比有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，P＜0.01）。如圖3所示，ICR，DBA和C57模型組小鼠在新環(huán)境下的僵住時間百分率分別為（2±3）%，（5±5）%和（14±9）%，提示不同品系小鼠在新環(huán)境下未呈現(xiàn)恐懼反應。在30 s的聲音刺激期，上述3種品系模型組小鼠的僵住時間百分率分別為（13±24）%，（47±26）%和（66±19）%，其中DBA小鼠和C57小鼠模型組與對照組相比有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，P＜0.01）。

2.3 C57小鼠條件性恐懼自然消退

分別于條件性恐懼訓練第2天（D2）、D7、D14、D21和D28進行5 min場景恐懼和30 s聲音線索恐懼檢測，評價C57小鼠條件性恐懼自然消退的行為特點。如圖4A所示，C57小鼠D2，D7，D14，D21和D28場景恐懼的僵住時間百分率分別為（45±16）%，（25±12）%，（19±8）%，（16±7）%和（25±14）%，其中D2與對照組相比有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。如圖4B所示，C57小鼠D2，D7，D14，D21和D28聲音線索恐懼的僵住時間百分率分別為（65±21）%，（69±13）%，（52±23）%，（58±31）%和（48±22）%，其中D2，D7，D14，D21與對照組相比有統(tǒng)計學差異（分別為P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05和P＜0.01）。

2.4 C57小鼠聲音線索恐懼的消退訓練和保持

Fig.1 Fear acquisition performance following fear conditioning training in lCR（A），DBA（B）and C57（C）mice.Different strains of mice were placed in the foot shock box（context A）for 2 min before sound（30 s，85 dB）-shock（2 s，0.6 mA）presentation.Freezing behavior was recorded by computer.Percentage of freezing time（%）=freezing time（s）/total time（s）×100%.n=8-11.±s.

Fig.2 Contextual fear expression in lCR（A），DBA（B）and C57（C）mice 24 h following fear conditioning training.Twenty-four hours following fear conditioning training，different strains of mice were re-placed in the same shock box（context A）again，and freezing behavior was measured for 5 min without sound or shock.±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

Fig.3 Tone-cued fear expression in lCR（A），DBA（B）and C57（C）mice 24 h following fear conditioning training.Two hours following contextual fear expression test，different strains of mice were placed in a different context（context B ）for 2 min before 1 trail of 30 s sound-30 s interval.±s，n=10.＊＊P＜0.01，compared with control group.

Fig.4 Time-dependent extinction of contextual fear conditioning（A）and tone-cued fear conditioning（B）in C57 mice.Fear expression behavior in C57 mice was tested in context A and context B for 5 min and 30 s，respectively，in D2，D7，D14，D21 and D28.±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

Fig.5 Extinction training（A）and retention test（B）in C57 mice following tone-cued fear conditioning training.C57 mice were subjected to 10 extinction trails with 30 s sound presentation and 30 s intervals in context B.Twenty-four hours later，extinction retention test was performed in the same context for 30 s with sound on.±s，n=10.

條件性恐懼訓練24 h后，采用“30 s聲音刺激-30 s間歇期”的方法進行10輪聲音消退訓練，如圖5A所示，隨消退訓練次數(shù)增加，C57小鼠聲音線索恐懼反應逐漸降低，第1輪和第10輪聲音刺激期僵住時間百分率分別為（55±30）%和（32±27）%。消退訓練24 h后進行消退保持測試，如圖5B所示，C57小鼠在30 s聲音刺激期的僵住時間百分率為（47±35）%。

3 討論

根據(jù)與創(chuàng)傷記憶是否具有直接聯(lián)結(jié)，PTSD模型可分為敏化模型和條件性恐懼模型，其中敏化模型包括單程長時應激模型、時間依賴敏化模型、單程短暫電擊模型、天敵模型和社會挫敗模型等[10-11]。無論是PTSD患者還是敏化動物模型都會出現(xiàn)恐懼反應增敏和（或）消退障礙等癥狀，因此條件性恐懼模型在PTSD病理機制研究和抗PTSD藥物評價中具有重要價值。條件性恐懼模型是基于巴甫洛夫條件反射，以電擊刺激為創(chuàng)傷性應激因子，將中性條件性刺激（如應激環(huán)境、聲音或燈光）和厭惡性的非條件刺激（電擊）進行多次配對，動物可獲得場景關聯(lián)恐懼（以環(huán)境為線索的恐懼條件化）和（或）聲音線索恐懼（以聲音為線索的恐懼條件化）[12]。

條件性恐懼模型的建立與多種因素密切相關，如動物品系、電擊強度、電擊時間、聲音刺激時間、聲音-電擊配對次數(shù)、配對方式、預適應方式、間歇期時間和實驗目的等。訓練過程是恐懼條件化的學習過程，不同實驗室采用的造模訓練方式不同。由于藥物對恐懼行為既可能發(fā)揮促進作用也可能發(fā)揮抑制作用，因此本研究希望通過訓練方案的優(yōu)化將僵住時間百分率控制在40%～60%。此外，本研究擬在D2同時檢測場景和聲音線索恐懼的表達，因此恐懼條件化訓練時增加了間歇期時間，如僅檢測聲音線索恐懼的表達，則可縮短適應期和間歇期的時間。在文獻調(diào)研和預實驗的基礎上，本研究發(fā)現(xiàn)聲音-電擊配對5次可成功誘導C57小鼠形成場景恐懼和聲音線索恐懼，DBA小鼠可誘導形成聲音線索恐懼但無法形成場景恐懼，而神經(jīng)精神藥理學研究最常用的遠交系小鼠品系ICR小鼠則無法誘導形成場景恐懼和聲音線索恐懼，提示動物品系可能對條件性恐懼模型能否成功具有決定性的影響。結(jié)合恐懼消退和保持的實驗結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)C57小鼠為條件性恐懼研究的敏感品系鼠，易形成恐懼反應，聲音線索恐懼可持續(xù)3～4周。

除訓練方式外，不同實驗室采用的檢測指標和檢測方式也不盡相同。僵住行為的檢測指標分為僵住時間和僵住次數(shù)2種，二者記錄方式不同[13-14]。僵住時間是記錄檢測周期內(nèi)動物呈現(xiàn)僵住反應的累計時間，而僵住次數(shù)則是間隔固定時間（常為6～10 s，與檢測周期長短有關）判斷一次動物是否處于僵住狀態(tài)，進而記錄累計僵住次數(shù)。本研究以小鼠為研究對象，條件性恐懼模型僵住行為研究時采用了計算機軟件自動記錄僵住時間的方法。但值得注意的是，如以大鼠為研究對象，部分大鼠呼吸幅度較深，可能會影響計算機軟件采集數(shù)據(jù)的準確性，此時建議采用人工記錄僵住次數(shù)的方式進行數(shù)據(jù)采集。此外，本研究還對聲音線索恐懼的檢測方式進行了優(yōu)化。目前，文獻報道的檢測場景恐懼采用的時長多為3～11 min，其中以記錄5 min內(nèi)的僵住時間最常見[7，15]，本研究也采用該時長進行場景恐懼的檢測。然而對于聲音線索恐懼，多數(shù)文獻中采用檢測2或3 min內(nèi)僵住時間或次數(shù)的方法[6-7]，而本研究發(fā)現(xiàn)，2 min長時聲音刺激時，小鼠發(fā)生了時間依賴的恐懼消退，此種方式檢測的聲音線索恐懼的僵住時間百分率不足30%（結(jié)果未列出），因此通過預實驗，本研究將聲音線索恐懼的檢測時間優(yōu)化為30 s。

此外，值得注意的是，條件性恐懼模型是否成功不應僅以統(tǒng)計學結(jié)果作為參照，而應結(jié)合研究目的，以僵住時間百分率是否滿足實驗需求為核心依據(jù)。例如，本研究中D2進行的場景恐懼表達檢測中，DBA模型小鼠的僵住時間百分率雖與正常組相比顯著增加，但DBA模型組僵住時間百分率僅為25%，因此DBA小鼠并非場景恐懼檢測的合適品系，模型組25%的僵住率也無法滿足檢測藥物作用的目的。

綜上，本研究確定了C57小鼠為敏感品系，建立了恐懼獲得、表達、自然消退、消退訓練和消退保持各階段恐懼行為檢測的實驗方法，成功建立了小鼠條件性恐懼模型，該模型穩(wěn)定可靠，具有良好的可重復性。