氯胺酮單次注射對(duì)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型動(dòng)物場(chǎng)景恐懼行為的影響及機(jī)制

魏肇余，薛 瑞，李光香，張?chǎng)趼遢?，李云峰，張有志，王恒?/p>

（1.河北北方學(xué)院研究生院，河北 張家口 075000；2.解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心麻醉科，北京 100091；3.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850）

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）是指?jìng)€(gè)體在經(jīng)歷重大創(chuàng)傷事件，如戰(zhàn)爭(zhēng)、重大災(zāi)害（地震、交通事故等）或性侵害之后所表現(xiàn)出的遲發(fā)性慢性精神疾病，主要特征包括持續(xù)生動(dòng)的創(chuàng)傷事件重現(xiàn)、創(chuàng)傷相關(guān)線索逃避、反應(yīng)過(guò)度和認(rèn)知與情感的負(fù)性改變[1-2]。PTSD與抑郁癥和焦慮癥具有高達(dá)50%的共患病比率。PTSD病因雖較明確，但病理生理機(jī)制復(fù)雜，尚未完全闡明，可能與神經(jīng)遞質(zhì)失衡、以下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamicpituitary-adrenal，HPA）軸為主體的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂、神經(jīng)免疫炎癥、腦解剖結(jié)構(gòu)和神經(jīng)可塑性改變等多種因素密切相關(guān)[3-6]。心理療法和藥物干預(yù)是PTSD治療最常規(guī)的2種方式，目前獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床PTSD患者治療的藥物只有舍曲林（sertraline）和帕羅西汀（paroxetine），它們都是選擇性5-羥色胺重?cái)z取抑制劑，是治療PTSD的首選藥物[7-8]。遺憾的是，選擇性5-羥色胺重?cái)z取抑制劑治療效果并不盡如人意，且存在起效延遲以及導(dǎo)致性功能障礙、認(rèn)知功能損傷、自殺傾向等多種不良反應(yīng)[9-11]。因此，深入研究PTSD的發(fā)病機(jī)制，研發(fā)具有強(qiáng)效速效抗PTSD作用的藥物具有重要意義。

氯胺酮是一種非競(jìng)爭(zhēng)性N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體拮抗劑，臨床上作為分離性麻醉劑使用。自2000年BERMAN等首次報(bào)道氯胺酮具有抗抑郁作用以來(lái)，越來(lái)越多臨床證據(jù)表明，氯胺酮可發(fā)揮快速而持久的抗抑郁作用，且對(duì)難治性抑郁亦有效，引起了人們對(duì)氯胺酮在精神疾病中應(yīng)用價(jià)值的高度興趣和廣泛關(guān)注[12-13]。2008年，MCGHEE等[14]研究表明，手術(shù)期間使用氯胺酮作為鎮(zhèn)痛藥的燒傷患者術(shù)后PTSD發(fā)生率顯著低于未使用氯胺酮干預(yù)組；然而2014年，該作者對(duì)大樣本臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)術(shù)中氯胺酮干預(yù)對(duì)術(shù)后燒傷患者的PTSD發(fā)展并無(wú)顯著影響，即并未降低PTSD的發(fā)生率[15]。同年，F(xiàn)EDER等[16]報(bào)道，亞麻醉劑量的氯胺酮單次給藥對(duì)慢性PTSD患者具有快速治療作用。由此可見(jiàn)，氯胺酮對(duì)PTSD是否具有治療作用并未取得一致性結(jié)論，需要進(jìn)一步進(jìn)行深入研究，明確氯胺酮對(duì)PTSD的影響可能為PTSD的治療提供有效且快速的干預(yù)手段。

本研究采用小鼠條件性恐懼模型[17-18]和大鼠時(shí)間依賴敏化模型（time-dependent sensitization，TDS）模型[19]評(píng)價(jià)氯胺酮不同時(shí)間點(diǎn)單次預(yù)防給藥對(duì)PTSD模型動(dòng)物場(chǎng)景恐懼行為的影響，并采用Western印跡法評(píng)價(jià)調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）表達(dá)是否是氯胺酮防治PTSD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

氯胺酮（軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所合成，純度＞99.00%）。氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司）；兔抗小鼠BDNF單克隆抗體（ab108319）（美國(guó)Abcam公司）；小鼠抗人β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（sc-47778）（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司）。自制麻醉用玻璃缸（20 cm×22 cm）；自制游泳用玻璃缸（20 cm×41 cm）；Video Freeze SOF-843條件性恐懼系統(tǒng)（美國(guó)Med Associates公司）；Milli-Q純水儀（美國(guó)Millipore公司）；TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；蛋白電泳儀和蛋白電子轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；EnVision多標(biāo)記微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)PE公司）。

1.2 動(dòng)物

100只SPF級(jí)C57小鼠，雄性，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0002。32只SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量260～270 g，購(gòu)自斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0002。飼養(yǎng)環(huán)境溫度21～24℃，濕度40%～70%，12 h晝夜明暗交替（8∶00 Am-8∶00 Pm），自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，每天抓取3 min，然后開始行為學(xué)測(cè)試，實(shí)驗(yàn)前1 h將小鼠或大鼠放進(jìn)實(shí)驗(yàn)間內(nèi)適應(yīng)環(huán)境。

1.3 小鼠條件性恐懼實(shí)驗(yàn)

1.3.1 小鼠條件性恐懼模型的制備和場(chǎng)景恐懼行為測(cè)試

將小鼠放入電擊箱中適應(yīng)2 min后，給予聲音刺激30 s（85 dB），最后2 s伴隨給予0.6 mA足底電擊，間隔2 min開始下一輪聲音和電擊，共進(jìn)行5輪。

分別于造模后24 h進(jìn)行5 min的場(chǎng)景恐懼測(cè)試，Video Freeze SOF-843軟件自動(dòng)記錄5 min內(nèi)的僵住時(shí)間，計(jì)算僵住時(shí)間百分率，僵住時(shí)間百分率（%）=僵住時(shí)間（s）/總時(shí)間（s）×100%。僵住行為定義為除呼吸運(yùn)動(dòng)外全身其余的肌肉運(yùn)動(dòng)均消失的一種刻板行為，是嚙齒動(dòng)物表達(dá)恐懼的方式。

1.3.2 不同時(shí)間點(diǎn)單次預(yù)防性給予氯胺酮對(duì)場(chǎng)景恐懼表達(dá)的影響

小鼠分為模型組和模型+不同時(shí)間氯胺酮組，分別于條件性恐懼造模前第7天、24 h和0.5 h單次ip給予生理鹽水或氯胺酮10 mg?kg-1，各組小鼠按1.3.1方法制備條件性恐懼模型，并于造模后24 h場(chǎng)景恐懼測(cè)試。實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1A。

1.3.3 氯胺酮對(duì)小鼠場(chǎng)景恐懼量效和起效時(shí)間行為測(cè)試

小鼠分為模型組和模型+不同劑量氯胺酮組，分別在造模前0.5 h單次ip給予生理鹽水、氯胺酮3和10 mg?kg-1。各組小鼠按1.3.1方法制備條件性恐懼模型，并于造模后24 h、第7天和第14天進(jìn)行場(chǎng)景恐懼測(cè)試。實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1B。

1.3.4 Western印跡法檢測(cè)條件性恐懼模型小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)BDNF蛋白表達(dá)水平

小鼠分為模型組和模型+氯胺酮組，分別在造模前0.5 h單次ip給予生理鹽水或氯胺酮10 mg?kg-1。各組小鼠按1.3.1方法制備條件性恐懼模型。同時(shí)取正常小鼠10只，放入電擊箱中同樣時(shí)間但不進(jìn)行電擊（正常對(duì)照組）。分別在造模訓(xùn)練后24 h、第14天場(chǎng)景恐懼表達(dá)測(cè)試后將小鼠處死，冰上取腦，分離皮質(zhì)組織，-80℃冰箱中備用。

Fig.1 Fear conditioning regime in mice.A was the study on time point of drug treatment：ketamine 10 mg?kg-1was ip injected 7 d，24 h or 0.5 h before fear conditioning training（D-7，D0，D1），and contextual fear expression test was performed 24 h later（D2）.The percentage of freezing time in mice was calculated in 5 min test period.B was the study on dose-response and onset time of drug treatment：ketamine at 3 or 10 mg?kg-1was ip given 0.5 h before fear conditioning training，and contextual fear expression test was performed in D2（24 h later），D7 and D14 after fear conditioning training.The percentage of freezing time in mice was calculated in 5 min test period.

皮質(zhì)組織稱重，并按10 mg/100 μL比例加入含蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑的預(yù)冷RIPA裂解緩沖液，并以BCA法蛋白定量。常規(guī)配置12%SDS-PAGE凝膠和5%基層膠，每孔上樣30 μg，蛋白經(jīng)電泳分離后恒壓轉(zhuǎn)印至PDVF膜。10%脫脂牛奶封閉2 h，之后加BDNF（1∶1000）和β肌動(dòng)蛋白（1∶5000）一抗，4℃冰箱搖床孵育過(guò)夜，室溫下二抗（1∶10 000）孵育2 h。在凝膠成像系統(tǒng)（Fluor Chem TMFC2）清晰顯影記錄圖像。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶積分吸光度的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 大鼠TDS實(shí)驗(yàn)

1.4.1 大鼠分組和TDS模型制備

大鼠分為模型組和模型+氯胺酮組，分別在條件性恐懼訓(xùn)練前第14天、24 h和0.5 h分別單次ip給予生理鹽水或氯胺酮10 mg?kg-1。TDS模型制備包括4步：①束縛：將動(dòng)物固定于干凈的聚丙烯嚙齒動(dòng)物限制錐里2 h。②游泳：動(dòng)物束縛結(jié)束后立即放入游泳缸內(nèi)游泳20 min，水溫22～24℃，水深15 cm。③麻醉：游泳恢復(fù)15 min后，將大鼠放入充滿乙醚的麻醉缸內(nèi)，直至其翻正反射消失后取出，待大鼠恢復(fù)清醒后放回飼養(yǎng)間。④游泳（再次應(yīng)激）：造模后第7天，將動(dòng)物重新放入游泳缸中進(jìn)行20 min強(qiáng)迫游泳，結(jié)束后將動(dòng)物放回飼養(yǎng)間飼養(yǎng)（圖2）。

1.4.2 大鼠條件性恐懼訓(xùn)練和場(chǎng)景恐懼檢測(cè)

TDS模型制備結(jié)束后第7天，進(jìn)行條件性恐懼訓(xùn)練。將大鼠置電擊箱中適應(yīng)2 min，給予聲音刺激20 s（85 dB），并在聲音刺激的最后2 s伴隨給予不可逃避的足底電擊（0.7 mA，持續(xù)2 s），聲音-電擊配對(duì)共5次，間隔2 min。24 h后將大鼠再次置于接受過(guò)電擊的裝置中進(jìn)行環(huán)境重現(xiàn)，但不給于任何刺激。場(chǎng)景恐懼檢測(cè)持續(xù)5 min，每隔6 s觀察一次，記錄大鼠出現(xiàn)僵住行為的次數(shù)，計(jì)算僵住次數(shù)百分率（即僵住次數(shù)/觀察次數(shù)×100%），評(píng)價(jià)氯胺酮對(duì)TDS大鼠場(chǎng)景條件恐懼表達(dá)的影響。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示。除小鼠不同時(shí)間點(diǎn)單次預(yù)防給藥對(duì)恐懼記憶表達(dá)影響的數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測(cè)量的單因素方差分析，其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進(jìn)行分析，post-hoc test采用Dunnettttest。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig.2 Establishment of time-dependent sensitization（TDS）model and contextual fear test in rats.Ketamine 10 mg?kg-1 was ip injected to TDS rats 0.5 h，24 h and 14 d before fear conditioning training，and contextual fear expression test was performed 24 h after training.The percentage of freezing time in rats was calculated in 5 min test period.

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)間單次預(yù)防性給予氯胺酮對(duì)場(chǎng)景恐懼表達(dá)的影響

分別于條件性恐懼訓(xùn)練前第7天、24 h和0.5 h，單次ip氯胺酮10 mg?kg-1，24 h后進(jìn)行5 min場(chǎng)景恐懼測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)圖3。與模型對(duì)照組相比，氯胺酮第7天、24 h和0.5 h組僵住時(shí)間百分率均無(wú)顯著差異，提示氯胺酮10 mg?kg-1在這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)單次預(yù)防給藥對(duì)24 h場(chǎng)景恐懼表達(dá)無(wú)影響。

Fig.3 Effect of single prophylactic administration of ketamine on contextual fear behavior in mice.See Fig.1A for the mouse treatment.±s，n=9-11.

2.2 氯胺酮單次預(yù)防性給藥對(duì)小鼠場(chǎng)景恐懼的量效和起效時(shí)程的影響

于條件性恐懼訓(xùn)練前0.5 h單次ip氯胺酮3或10 mg?kg-1，分別于訓(xùn)練后24 h、第7天和第14天進(jìn)行5 min場(chǎng)景恐懼測(cè)試（圖4）。與模型對(duì)照組相比，僅訓(xùn)練后第14天氯胺酮10 mg·kg-1組顯著降低小鼠僵住時(shí)間百分率（P＜0.05），提示氯胺酮對(duì)小鼠場(chǎng)景恐懼表達(dá)有抑制作用，且該抑制作用具有延遲出現(xiàn)的特點(diǎn)。

2.3 氯胺酮單次預(yù)防性給藥對(duì)TDS增敏的大鼠場(chǎng)景恐懼的影響

分別于TDS大鼠場(chǎng)景恐懼訓(xùn)練前第14天、24 h和0.5 h單次ip氯胺酮10 mg?kg-1，訓(xùn)練24 h后進(jìn)行5 min場(chǎng)景恐懼檢測(cè)（圖5）。與模型對(duì)照組相比，僅訓(xùn)練前0.5 h氯胺酮組可顯著降低大鼠僵住次數(shù)百分率（P＜0.05），提示其對(duì)TDS大鼠場(chǎng)景恐懼表達(dá)有抑制作用。

2.4 氯胺酮單次預(yù)防性給藥對(duì)條件性恐懼模型小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)BDNF水平的影響

Fig.4 Effect of single prophylactic administration of ketamine on contextual fear behavior in mice.See Fig.1B for the mouse treatment.A-C was the result of contextual fear test at 24 h，the 7thand 14thday after training，respectively.±s，n=10-11. ＊P＜0.05，compared with model group.

訓(xùn)練后24 h和第14天，與正常對(duì)照組比較，條件性恐懼模型組小鼠皮質(zhì)BDNF含量均顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）；氯胺酮10 mg?kg-1組在上述時(shí)間點(diǎn)均逆轉(zhuǎn)條件性恐懼造模所致的皮質(zhì)BDNF降低，與模型組相比具有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）（圖6）。

Fig.5 Effect of single prophylactic administration of ketamine on contextual fear behavior in time-dependent sensitized stress（TDS）rats.See Fig.2 for the rat treatment.±s，n=8-9.＊P＜0.05，compared with model group.

Fig.6 Effect of single prophylactic administration of ketamine on cortex brain-derived neurotrophic factor（BDNF）expression in mouse contextual fear model by Western blotting.Ketamine 10 mg?kg-1was ip given 0.5 h before fear conditioning training，and BDNF protein expression was detected following contextual fear expression test in D2（A and C）and D14（B and D），respectively.C and D was the semiquantitative result of A and B，respectively.±s，n=9-12.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with controlgroup； #P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

3 討論

條件性恐懼模型利用巴甫洛夫條件反射原理，將厭惡性刺激（如電擊）與中性刺激（如訓(xùn)練場(chǎng)景）多次配對(duì)訓(xùn)練后建立，模型動(dòng)物在重新暴露于原訓(xùn)練環(huán)境時(shí)會(huì)對(duì)該環(huán)境產(chǎn)生條件性恐懼反應(yīng)，即場(chǎng)景恐懼[20-22]。條件性恐懼模型被認(rèn)為是研究PTSD機(jī)制和評(píng)價(jià)藥物作用的重要模型，特別是對(duì)于恐懼記憶的獲得、提取和消退等階段的研究具有重要價(jià)值[23-24]。本研究采用小鼠條件性恐懼模型對(duì)氯胺酮單次預(yù)防給藥的作用進(jìn)行研究。本研究結(jié)果表明，氯胺酮10 mg?kg-1單次預(yù)防給藥，在訓(xùn)練后第14天（而非訓(xùn)練后第2天）顯著減輕模型小鼠的場(chǎng)景恐懼，且3 mg?kg-1預(yù)防性給藥無(wú)此作用，提示氯胺酮抑制小鼠場(chǎng)景恐懼表達(dá)的作用與劑量有關(guān)，且具有延遲出現(xiàn)的特點(diǎn)。MCGOWAN等[17]研究亦表明，在訓(xùn)練前1周單次預(yù)防性給予氯胺酮30 mg?kg-1可降低場(chǎng)景恐懼的表達(dá)，但訓(xùn)練前在1個(gè)月或1 h單次給予氯胺酮30 mg?kg-1，并不會(huì)影響恐懼的表達(dá)。由此進(jìn)一步驗(yàn)證了氯胺酮對(duì)恐懼的表達(dá)是具有抑制作用，該作用依賴于給藥時(shí)間點(diǎn)、藥物劑量以及起效時(shí)程。

此外，本研究建立了大鼠TDS模型，并在該模型上評(píng)價(jià)了氯胺酮對(duì)PTSD增敏的恐懼行為的影響。單一連續(xù)刺激（single prolonged stress，SPS）模型依次經(jīng)過(guò)2 h的束縛、20 min的游泳和乙醚麻醉3種刺激模擬動(dòng)物心理、生理和內(nèi)分泌方面的應(yīng)激，模型動(dòng)物對(duì)條件性恐懼的僵住反應(yīng)增強(qiáng)，呈現(xiàn)恐懼增敏，與文獻(xiàn)[25-26]報(bào)道的PTSD患者癥狀一致。大鼠TDS模型是在SPS模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步強(qiáng)化刺激，在SPS模型建立7 d后進(jìn)行短暫的再次刺激（20 min強(qiáng)迫游泳），再經(jīng)過(guò)7 d后進(jìn)行相關(guān)行為學(xué)測(cè)試[18]。TDS模型可模擬PTSD患者在經(jīng)歷與創(chuàng)傷無(wú)關(guān)刺激時(shí)導(dǎo)致的焦慮和恐懼增加的現(xiàn)象，不同實(shí)驗(yàn)室已證明TDS模型具有很好的表觀效度、結(jié)構(gòu)效度和預(yù)測(cè)效度，且TDS模型動(dòng)物行為學(xué)缺陷的出現(xiàn)需要1～2周的潛伏期，與臨床PTSD癥狀的延遲出現(xiàn)具有良好的一致性[27-30]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TDS模型大鼠在條件性恐懼訓(xùn)練前不同時(shí)間點(diǎn)單次預(yù)防性給予氯胺酮10 mg?kg-1，只有在恐懼訓(xùn)練前0.5 h給藥時(shí)可顯著抑制場(chǎng)景恐懼的表達(dá)，提示氯胺酮對(duì)于TDS增敏的場(chǎng)景恐懼表達(dá)具有快速干預(yù)作用，此作用同樣依賴于給藥時(shí)間點(diǎn)。然而值得注意的是，氯胺酮單次給藥在大鼠TDS模型中呈現(xiàn)速效抑制恐懼表達(dá)的作用，而其在小鼠條件性恐懼模型中卻具有延遲起效特點(diǎn)，二者的不一致性可能與動(dòng)物種屬和造模方式的不同有關(guān)。TAKAHASHI等[18]研究亦發(fā)現(xiàn)，在大鼠條件性恐懼模型中，場(chǎng)景恐懼訓(xùn)練后SPS模型大鼠與正常大鼠相比呈現(xiàn)恐懼增敏反應(yīng)，表現(xiàn)為僵住時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)；而5-羥色胺重?cái)z取抑制劑帕羅西汀長(zhǎng)期給藥僅對(duì)SPS增敏的場(chǎng)景恐懼表達(dá)有抑制作用，對(duì)正常大鼠條件性恐懼表達(dá)無(wú)影響，這與本研究結(jié)果一致。

近年來(lái)，人們對(duì)氯胺酮的作用機(jī)制研究具有突破性的進(jìn)展。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，氯胺酮發(fā)揮速效抗抑郁作用主要與其拮抗NMDA受體有關(guān)，而新近觀點(diǎn)認(rèn)為，氯胺酮是通過(guò)抑制中間神經(jīng)元NMDA受體，進(jìn)而激活α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁啞唑丙酸受體，引起B(yǎng)DNF表達(dá)升高或快速釋放，進(jìn)而激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白受體有關(guān)。此外，氯胺酮與單胺再攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、5-羥色胺受體、多巴胺能受體和阿片類受體等多種蛋白和受體系統(tǒng)具有相互作用，其抗抑郁作用機(jī)制仍在深入研究中[31-32]。目前，氯胺酮抗PTSD的作用機(jī)制并未達(dá)成共識(shí)，但也有零星報(bào)道，如張黎明等[19]發(fā)現(xiàn)，小劑量慢性給予氯胺酮的抗PTSD作用與升高BDNF含量有關(guān)。另有研究表明，氯胺酮可通過(guò)激活內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)中哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路增強(qiáng)恐懼記憶的消退作用等[33-34]。本研究發(fā)現(xiàn)，氯胺酮在小鼠條件性恐懼模型中單次預(yù)防給藥對(duì)恐懼記憶表達(dá)具有抑制作用，但該作用在訓(xùn)練后第14天才顯現(xiàn)，提示其具有延遲起效的特點(diǎn)。隨后采用Western印跡法分別檢測(cè)了訓(xùn)練后24 h和第14天小鼠皮質(zhì)內(nèi)BDNF表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在上述2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組相比，模型組BDNF水平均顯著降低，提示恐懼發(fā)生可能與BDNF表達(dá)降低有關(guān)；然而，與模型組相比，在上述2個(gè)時(shí)間點(diǎn)氯胺酮組BDNF表達(dá)均顯著升高，與其抑制恐懼表達(dá)作用的起效時(shí)間（訓(xùn)練后第14天）不一致，提示BDNF表達(dá)增加可能與氯胺酮抑制恐懼表達(dá)作用無(wú)關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，氯胺酮單次給藥對(duì)恐懼記憶表達(dá)可能有預(yù)防作用，該作用與劑量和時(shí)間（給藥時(shí)間點(diǎn)和時(shí)間窗）密切相關(guān)。此外，單次給予氯胺酮抗PTSD延遲起效的特點(diǎn)與恐懼記憶形成后BDNF含量的改變?cè)跁r(shí)間上不具有一致性，提示單次給予氯胺酮的抗PTSD作用可能與調(diào)節(jié)BDNF表達(dá)無(wú)關(guān)。本研究為氯胺酮預(yù)防PTSD恐懼記憶的表達(dá)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。