HPLC-MS/MS法測(cè)定不同產(chǎn)地千里光中千里光菲靈堿的含量

張石宇 唐成林 林昶 宋信莉 劉英 張恩 石洪州 丁秦

摘要 [目的]測(cè)定不同產(chǎn)地11批千里光中千里光菲靈堿的含量。[方法]采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）法進(jìn)行檢測(cè)。色譜柱為ACE Excel 3 C 18-PFP （4.6 mm×150 mm，3 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水，梯度洗脫;柱溫40 ℃，流速0.6mL/min;質(zhì)譜采用電噴霧（ESI）離子源，正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）的掃描方式進(jìn)行檢測(cè)。[結(jié)果]該方法線性關(guān)系良好，精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，加樣回收率在96.90%～102.13%，RSD為1.16%～1.48%，該方法符合方法學(xué)考察要求;11批千里光藥材中千里光菲靈堿含量為0.069 6～0.811 1 μg/g。[結(jié)論]該研究建立的方法穩(wěn)定可行，可用于千里光中千里光菲靈堿含量的測(cè)定，為中藥千里光的質(zhì)量控制提供新參考。

關(guān)鍵詞 千里光;千里光菲靈堿;HPLC-MS/MS;不同產(chǎn)地;含量測(cè)定

中圖分類(lèi)號(hào) R 284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2022）02-0202-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.02.055

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Determination of Seneciphylline in Senecio scandens from Different Origins Based on HPLC-MS/MS

ZHANG Shi-yu1，TANG Cheng-lin2，LIN Chang3，4 et al （1.The First Affiliated Hospital of Guizhou University of TCM，Guiyang，Guizhou 550001; 2.Guizhou General Station of Crop Technology Extension，Guiyang，Guizhou 550001; 3.College of Pharmacy，Guizhou University of TCM，Guiyang，Guizhou 5500253;4.Research Center of TCM under Forest of Guizhou University of TCM，Guiyang，Guizhou 550025）

Abstract [Objective]To determine the seneciphylline content in 11 batches of Senecio scandens from different origins.[Method]The method of high performance liquid chromatography-mass spectrometry （HPLC-MS/MS） was used for detection.Ace excel 3 C 18-PFP （4.6 mm×150 mm，3 μm） was used as the chromatographic column，and the mobile phase was 0.1% formic acid acetonitrile -0.1% formic acid water with gradient elution.Column temperature 40 ℃，flow rate 0.6mL/min.Mass spectrometry was detected by electrospray ionization （ESI），positive ion mode and multiple reaction monitoring （MRM）.[Result]The method had good linear relationship，precision，repeatability and stability，and the recovery rate was 96.90%-102.13%，RSD was 1.16%-1.48%，which met the requirements of methodological investigation.The content of seneciphylline in 11 batches of Senecio scandens was 0.069 6-0.811 1 μg/g.[Conclusion]The method established in this study is stable and feasible，and can be used for the determination of seneciphylline content in Senecio scandens，providing a new reference for the quality control of Senecio scandens.

Key words Senecio scandens;Seneciphylline; HPLC-MS/MS; Different origins; Content determination

基金項(xiàng)目 貴州省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳項(xiàng)目“中藥材生產(chǎn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)制定”（XATH（GZ）2020/042號(hào)）;貴州省教育廳青年科技人才成長(zhǎng)項(xiàng)目（黔教合KY字〔2022〕259號(hào)）;貴州省特色功能食品與中藥制劑開(kāi)發(fā)攻關(guān)大平臺(tái)（黔教合KY字〔2020〕006）。

作者簡(jiǎn)介 張石宇（1987—），女，貴州遵義人，主管中藥師，碩士，從事中藥毒理與藥物代謝研究。*通信作者，農(nóng)藝師，碩士，從事中藥材規(guī)范化種植技術(shù)及推廣方面的研究。

收稿日期 2021-05-26;修回日期 2021-07-02

千里光為菊科植物千里光（Senecio scandens Buch.-Ham.）的干燥地上部分[1]。千里光原名千里及，別名九里明、九龍光、黃花草、九嶺光、蒲兒根、一掃光等，始載于《本草拾遺》，主要分布于我國(guó)華東、中南及西南各地，常見(jiàn)于山地林邊、灌木草叢和路邊，夏秋采收，是應(yīng)用歷史悠久的常用中藥之一[2]。千里光具有清熱解毒、明目、利濕的功效，常用于治療癰腫瘡毒、感冒發(fā)熱、目赤腫痛、泄瀉痢疾、皮膚濕疹等。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，千里光中含有多種肝毒性吡咯里西啶生物堿（PAs），包括阿多尼弗林堿、千里光堿、千里光菲靈堿、克氏千里光堿等[3-5]。PAs可通過(guò)傳統(tǒng)草藥、茶劑、谷物或奶制品、肉類(lèi)等食物鏈的傳遞被人類(lèi)攝食，經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450酶代謝活化形成親電性中間體后，與體內(nèi)生物大分子如蛋白質(zhì)結(jié)合，形成吡咯蛋白加合物（pyrrole-protein adducts，PPA），與體內(nèi)DNA結(jié)合，形成吡咯DNA加合物（pyrrole-DNA adducts，PDA），進(jìn)而誘導(dǎo)肝臟肝竇阻塞綜合征（hepatic sinusoidal obstruction syndrome，HSOS），致嚴(yán)重的肝毒性[6-7]。此外，PAs還具有顯著的肺臟毒性、遺傳毒性、神經(jīng)毒性和胚胎毒性等[8-9]。因此含PAs的中藥一直是世界衛(wèi)生組織（WHO）等國(guó)際組織及國(guó)家嚴(yán)密監(jiān)控的對(duì)象。

2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定了千里光藥材中阿多尼弗林堿的含量限度，不得超過(guò)0.004%[1]，然而對(duì)其他吡咯里西啶生物堿類(lèi)均未作規(guī)定。千里光菲靈堿是千里光中的主要吡咯里西啶類(lèi)生物堿之一，有研究報(bào)道，額河千里光中千里光菲靈堿的含量為0.055 7%，超過(guò)了千里光堿和全緣千里光堿在額河千里光中的含量[10]。千里光菲靈堿是一種具有十二元大環(huán)二酯-倒千里光堿類(lèi)型的PAs，屬于最具肝毒性的PAs[7]。Hincks等[11]研究表明，與其他PAs相比，千里光菲靈堿可以在體外產(chǎn)生更多的PDA。韓佳寅等[12]研究表明，千里光菲靈堿濃度在12.5 ～100 μg/mL時(shí)，可在體外致小鼠胚胎毒性。Wang等[13]報(bào)道，千里光菲靈堿濃度為5～50 μmol/L時(shí)，可通過(guò)激活線粒體介導(dǎo)的小鼠和原代肝細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)其肝毒性。很多研究表明，千里光菲靈堿毒性比其他PAs更大[14-16]。因此，筆者建立了千里光中千里光菲靈堿的含量測(cè)定方法，對(duì)來(lái)源不同產(chǎn)地的11批千里光藥材進(jìn)行分析與比較，以明確其安全性，為其臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器。FW100型高速粉碎機(jī)（泰斯特儀器有限公司）;SB-5200DT型超聲機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）;QL-901型渦旋混合器（江蘇海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠）;AE240型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）;美國(guó)AB 5500 Q TRAP 質(zhì)譜儀（Applied Biosystems公司）。

1.1.2 藥品與試劑。千里光菲靈堿（純度≥99%，成都德斯特生物技術(shù)有限公司，批號(hào)DST200910-125）;乙腈、甲醇和甲酸（質(zhì)譜級(jí)別，德國(guó)Merck公司）;水為娃哈哈純凈水。

1.1.3 藥材。試驗(yàn)用藥材為來(lái)自11個(gè)產(chǎn)地的千里光樣品，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室孫慶文教授鑒定為菊科植物千里光（Senecio scandens Buch.-Ham.）的干燥地上部分。各樣品來(lái)源及編號(hào)詳見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備。

1.2.1.1 對(duì)照品溶液的制備。取千里光菲靈堿對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加0.5%甲酸溶液配制成每l mL含0.1 μg的溶液，即得千里光菲靈堿的對(duì)照品溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 供試品溶液的制備。分別取11批千里光藥材的粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入0.5%甲酸溶液25mL，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）40 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用0.5%甲酸溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，經(jīng)0.25 μm微孔濾膜過(guò)濾，續(xù)濾液即為供試品溶液。

1.2.2 液質(zhì)聯(lián)用條件。

1.2.2.1 色譜條件。色譜柱為ACE Excel 3 C 18-PFP（4.6 mm×150 mm，3 μm）;流速0.6mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量 20 μL;流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈（B）-0.1%甲酸水溶液（A），梯度洗脫（0～2 min，5%～5%B;2～6 min，5%～90%B;6～8 min，90%～90%B;8～9 min，90%～5%B;9～11 min，5%～5%B）。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件。離子源為ESI源;檢測(cè)模式為正離子模式;噴霧電壓5 500 V;碰撞氣為N 2;霧化溫度550 ℃;霧化氣379.2 kPa;輔助氣379.2 kPa;去簇電壓70 eV;碰撞電壓38 eV;射入電壓10 eV，掃描方式為多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）。為了得到千里光菲靈堿的結(jié)構(gòu)信息，該研究采用Q-Trap質(zhì)譜上的IDA（information-dependent acquisition）標(biāo)準(zhǔn)觸發(fā)的EPI（enhanced product ion）掃描對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行二級(jí)碎片分析。EPI掃描選擇在正離子模式下，掃描范圍為m/z 50～400。

1.2.3 方法學(xué)考察。

1.2.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。分別吸取空白溶劑、對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL，在“1.2.2”液質(zhì)聯(lián)用條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別精密吸取千里光菲靈堿對(duì)照品溶液適量，用0.5%甲酸稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0和1 000.0 ng/mL的系列對(duì)照品溶液。吸取各對(duì)照品溶液20 μL，按“1.2.2”液質(zhì)聯(lián)用條件分別進(jìn)樣分析。以質(zhì)量濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.3 精密度試驗(yàn)。精密吸取20 ng/mL千里光菲靈堿對(duì)照品溶液20 μL，按“1.2.2”液質(zhì)聯(lián)用條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定千里光菲靈堿的峰面積，計(jì)算其RSD值。

1.2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批號(hào)千里光藥材粉末，按“1.2.1.2”方法分別制備6份供試品溶液，按“1.2.2”液質(zhì)聯(lián)用條件進(jìn)樣分析，測(cè)定千里光菲靈堿的含量，計(jì)算其RSD值。

1.2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一批浙江千里光藥材粉末，按“1.2.1.2”方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h，按“1.2.2”液質(zhì)聯(lián)用條件進(jìn)樣分析，測(cè)定千里光菲靈堿的含量，計(jì)算其RSD值。

1.2.3.6 加樣回收率試驗(yàn)。分別稱(chēng)取已測(cè)定含量的浙江千里光藥材粉末0.2 g，共9份，精密稱(chēng)定，按80%、100%、120%比例分別加入千里光菲靈堿對(duì)照品適量，再按照“1.2.1.2”方法制備供試品溶液，按照“1.2.2”液質(zhì)聯(lián)用條件進(jìn)樣分析，測(cè)加樣回收率，計(jì)算RSD值。

1.2.4 千里光菲靈堿含量的測(cè)定。取11個(gè)產(chǎn)地的11批千里光藥材樣品各3份，每份0.2 g，精密稱(chēng)定，分別按“1.2.1.2”方法制備供試品溶液，再按照“1.2.2”液質(zhì)聯(lián)用條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積并計(jì)算千里光菲靈堿含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。試驗(yàn)對(duì)千里光菲靈堿的離子對(duì)（m/z）334/120進(jìn)行檢測(cè)，所得對(duì)照品、供試品和空白溶劑總離子流色譜圖如圖1所示，結(jié)果表明對(duì)照品和供試品溶液中千里光菲靈堿的保留時(shí)間均為7.1 min，空白溶劑在7.1 min時(shí)無(wú)出峰，證明該方法專(zhuān)屬性良好。且供試品所測(cè)定主峰旁邊無(wú)明顯雜峰，經(jīng)計(jì)算樣品與其他組分峰的分離度>1.5，理論塔板數(shù)按千里光菲靈堿計(jì)算不低于4 000，符合藥典測(cè)定要求。試驗(yàn)采用Q-Trap質(zhì)譜對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行二級(jí)碎片分析，EPI掃描選擇在正離子模式下，掃描范圍為m/z 50～400，得到的二級(jí)質(zhì)譜圖如圖2所示。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。按“1.2.3.2”方法操作，以質(zhì)量濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程為y=76 742x-13 277（R2=1），結(jié)果表明，千里

光菲靈堿在質(zhì)量濃度0.5～1 000.0 ng/mL線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗(yàn)。按“1.2.3.3”方法操作，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定千里光菲靈堿的峰面積，計(jì)算其RSD為2.19%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.2.3.4”方法操作，分別進(jìn)樣平行樣6份，測(cè)定千里光菲靈堿的含量，計(jì)算其RSD為1.74%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.2.3.5”方法操作，測(cè)定千里光菲靈堿的含量，計(jì)算其RSD為2.85%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn)。由表2可見(jiàn)，在供試品中按80%、100%和120%比例分別加入千里光菲靈堿對(duì)照品時(shí)，平均回收率分別為96.90%、97.28%和102.13%，RSD值分別為1.42%、1.48%和1.16%，表明該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于千里光藥材中千里光菲靈堿的含量測(cè)定。

2.2 千里光菲靈堿的含量測(cè)定

由表3可知，不同產(chǎn)地的11批千里光藥材中千里光菲靈堿的含量差異較大，產(chǎn)自廣東、江蘇和云南的千里光藥材中千里光菲靈堿含量較低，而產(chǎn)自貴州、河南、四川、廣西和浙江的千里光藥材中千里光菲靈堿的含量較高。而產(chǎn)自浙江的千里光藥材中千里光菲靈堿含量明顯高于其他產(chǎn)地的，為0.811 1 μg/g。

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，千里光具有廣譜抗菌、抗氧化、清除自由基、抗病毒和抗腫瘤等藥理作用。千里光中亦含有有毒成分吡咯里西啶類(lèi)生物堿，對(duì)人和家畜肝臟有蓄積性損害，可造成肝硬化和壞死[17]。世界衛(wèi)生組織（WHO）在1989年發(fā)布了有關(guān)吡咯里西啶生物堿的健康與安全指南，推測(cè)導(dǎo)致成人肝臟肝竇阻塞綜合征（HSOS）的每日最低攝入量為每日1 mg PAs（按70 kg體重質(zhì)量）。2020版《中國(guó)藥典》僅對(duì)千里光藥材中阿多尼弗林堿進(jìn)行了含量限定，對(duì)其余吡咯里西啶類(lèi)生物堿均無(wú)任何規(guī)定，其安全性值得注意。

該研究采用HPLC-MS/MS測(cè)定千里光中千里光菲靈堿的含量，采用MRM的掃描方式進(jìn)行檢測(cè)，所建立的含量測(cè)定方法具有較好的穩(wěn)定性、靈敏度、準(zhǔn)確度，檢測(cè)結(jié)果科學(xué)、可靠。該試驗(yàn)參考了Bolechová等[18]所建立的方法中有關(guān)離子對(duì)的選擇，在經(jīng)歷多次調(diào)整之后最終所得到的HPLC-MS/MS的檢測(cè)條件，可為千里光藥材的相關(guān)研究提供參考。試驗(yàn)中檢測(cè)了11個(gè)產(chǎn)地千里光藥材中千里光菲靈堿的含量，結(jié)果表明，產(chǎn)自廣東、江蘇和云南的千里光藥材中千里光菲靈堿含量較低，而產(chǎn)自貴州、河南、四川、廣西和浙江的千里光藥材中千里光菲靈堿的含量較高。由于不同地區(qū)千里光藥材中千里光菲靈堿的含量差異較大，為避免其造成的安全隱患，相關(guān)部門(mén)應(yīng)給予充分的重視，從原藥材、成品制劑、用藥指導(dǎo)等方面進(jìn)行嚴(yán)格把控，從整體水平揭示千里光等含PAs中藥及其制劑的用藥風(fēng)險(xiǎn)，為全面系統(tǒng)評(píng)價(jià)其安全性和指導(dǎo)其臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

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