毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定磺丁基醚-β-環(huán)糊精中雜質(zhì)1,4-丁烷磺內(nèi)酯

李聞新，張雪柏，律 濤，王 巧

0 引言

磺丁基醚-β-環(huán)糊精(Betadex sulfobutyl ether sodium,SBE7-β-CD)是一種新型藥用輔料，具有水溶性好、腎毒性低、溶血作用小等優(yōu)點(diǎn)，可增加藥物的溶解度和穩(wěn)定性，提高生物利用度，掩蓋不良?xì)馕兜?，已廣泛用于藥物注射劑、口服制劑等新包合物的研究[1-2]。SBE7-β-CD是由1,4-丁烷磺內(nèi)酯(1,4-butane sultone,1,4-BS)在堿性條件下與β-環(huán)糊精(β-CD)的2,3,6位碳上的羥基發(fā)生取代反應(yīng)而得到的[3-4]。由其合成工藝可知，1,4-丁烷磺內(nèi)酯是合成SBE-β-CD的原料，由于其具有弱致癌性[5-6]，必須嚴(yán)格限制其含量。王雙等[7]采用分散液液微萃取-氣相色譜法對(duì)1,4-BS進(jìn)行含量測(cè)定研究，但該方法樣品處理繁瑣、操作復(fù)雜，僅可作為實(shí)驗(yàn)室研究，不能用于實(shí)際工作中的檢測(cè)。本試驗(yàn)在該研究的基礎(chǔ)上對(duì)SBE7-β-CD中的1，4-BS進(jìn)行測(cè)定研究，并比較了標(biāo)準(zhǔn)曲線法和外標(biāo)一點(diǎn)法的準(zhǔn)確度，通過(guò)優(yōu)化供試品處理等條件總結(jié)出了更為簡(jiǎn)便的方法，提高了工作效率。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 天美GC7900氣相色譜儀(上海天美科學(xué)儀器有限公司)，配有火焰離子化檢測(cè)器，D7900P色譜工作站；空氣源SPB-3型(北京中惠普分析技術(shù)研究所)；旋渦混合器XW-80A型(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)。

1.2 試藥 1,4-BS(美國(guó)Sigma公司，純度>99%)；二乙砜(美國(guó)Sigma公司，純度97%)；SBE7-β-CD對(duì)照品為USP標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：F0K026，純度100%)；SBE7-β-CD供試品(由唐山市第二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，批號(hào)：20131104，20131105，20131106)；二氯甲烷(分析純，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司)；無(wú)水硫酸鈉(分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：DB1701(30 m×0.32 mm，0.25 μm，Agilent Technologies)；氫火焰離子化檢測(cè)器；載氣為氮?dú)?純度99.999%)，燃?xì)鉃闅錃?，助燃?xì)鉃榭諝?；載氣流速30 ml/min；進(jìn)樣口溫度為200 ℃；柱溫為程序升溫：初始溫度100 ℃，以10 ℃/min的升溫速率升到200 ℃，再以30 ℃/min的升溫速率升到260 ℃，恒溫3 min；檢測(cè)器溫度為270 ℃；柱前壓為9.9 psi；分流比為10∶1；進(jìn)樣量1 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液 取1,4-BS對(duì)照品約12 mg，精密稱定，置10 ml量瓶中，加水溶解，定容。精密量取此溶液1 ml，置25 ml量瓶中，用水定容，得濃度為48 μg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液 取二乙砜約2 mg，精密稱定，置25 ml量瓶中，加水溶解，定容。精密量取此溶液5 ml，置10 ml量瓶中，用水定容，得濃度為40 μg/ml的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。

2.2.3 供試品溶液 取SBE7-β-CD供試品約0.2 g，精密稱定，置10 ml離心管中，精密加入水1 ml，渦旋溶解，再精密加入二氯甲烷1 ml，渦旋1 min，靜置分層，取有機(jī)相，得供試品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn) 取1,4-BS對(duì)照品約12 mg，精密稱定，置10 ml量瓶中，加適量二氯甲烷溶解，定容，精密量取此溶液1 ml，置25 ml量瓶中，用二氯甲烷定容，得濃度為48 μg/ml的1,4-BS二氯甲烷溶液。再精密量取此溶液1 ml，置10 ml量瓶中，用二氯甲烷定容，得濃度為4.8 μg/ml的1,4-BS二氯甲烷溶液。

取二乙砜約2 mg，精密稱定，置25 ml量瓶中，加適量二氯甲烷溶解，定容，精密量取此溶液5 ml，置10 ml量瓶中，用二氯甲烷定容，得濃度為40 μg/ml的二乙砜二氯甲烷溶液。再精密量取此溶液1 ml，置10 ml量瓶中，用二氯甲烷定容，得濃度為4.0 μg/ml的二乙砜二氯甲烷溶液。

分別量取48 μg/ml的1,4-BS二氯甲烷溶液和40 μg/ml的二乙砜二氯甲烷溶液各1 ml，置10 ml量瓶中，用二氯甲烷定容，即得1,4-BS和二乙砜混合溶液。

精密量取水1 ml，置10 ml離心管中，再精密加入二氯甲烷1 ml，渦旋1 min，靜置分層，取有機(jī)相，得萃取水二氯甲烷溶液。

取二氯甲烷空白溶劑、4.8 μg/ml的1,4-BS二氯甲烷溶液、4.0 μg/ml的二乙砜二氯甲烷溶液、1,4-BS和二乙砜混合溶液、萃取水二氯甲烷溶液和供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法分別進(jìn)樣，二乙砜與1,4-BS的保留時(shí)間分別為6.131 min和8.615 min，分離度遠(yuǎn)大于1.5，且空白溶劑無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4 檢測(cè)限和定量限、線性范圍 取1,4-BS對(duì)照品儲(chǔ)備液并逐級(jí)稀釋、處理，分別進(jìn)樣，分別以信噪比S/N=3和S/N=10時(shí)各對(duì)照品的量為檢測(cè)限和定量限，1,4-BS的檢測(cè)限和定量限分別為0.112 6 ng和0.259 9 ng。

分別精密量取1,4-BS對(duì)照品儲(chǔ)備液0.64、0.84、1.06、1.26、1.46、1.88 ml，分別置10 ml量瓶中，再分別精密加入內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液1 ml，用水定容，得1,4-BS系列對(duì)照品溶液，濃度分別為2.984、3.979、4.973、5.968、6.963、8.952 μg/ml，內(nèi)標(biāo)的濃度均為4.0 μg/ml。精密量取各對(duì)照品溶液1 ml，分別置10 ml離心管中，再分別精密加入二氯甲烷溶液1 ml，渦旋1 min，靜置分層，取有機(jī)相，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖和峰面積。以1,4-丁烷磺內(nèi)酯與內(nèi)標(biāo)的峰面積比(S1,4-BS/S二乙砜，Y)對(duì)1,4-丁烷磺內(nèi)酯的濃度(X)進(jìn)行線性回歸。

圖1 專屬性試驗(yàn)色譜圖

1,4-BS的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.315 4X-0.057 7，r=0.998 9，表明1,4-BS在2.984～8.952 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度和準(zhǔn)確度 取SBE7-β-CD供試品約0.2 g，共9份，按“2.2.3”項(xiàng)方法分別制備供試品溶液，按色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖和峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算，9份SBE7-β-CD供試品中均未檢測(cè)到雜質(zhì)1,4-BS。

取SBE7-β-CD供試品約0.2 g 3份，精密稱定，分別置10 ml離心管中，依次精密加入高、中、低3種濃度(6.048、5.088、4.032 μg/ml)的“2.5”項(xiàng)下的1,4-BS標(biāo)準(zhǔn)溶液1 ml(內(nèi)標(biāo)濃度為4.0 μg/ml)，渦旋溶解，再分別精密加入二氯甲烷溶液1 ml，渦旋1 min，靜置分層，取有機(jī)相，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖和峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算，即為測(cè)得量。每種濃度平行制備3份?；厥章视?jì)算公式：(測(cè)得量-原有量)/加入量×100%，計(jì)算高、中、低3種濃度時(shí)的回收率和RSD。

高、中、低3種濃度的平均回收率分別為101.5%、99.3%、100.3%，RSD為1.6%、1.2%、1.2%，表明該方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確度良好。

2.6 儀器精密度 取7.008 μg/ml的1,4-BS對(duì)照品溶液(內(nèi)標(biāo)濃度為4.0 μg/ml)，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積比(S1,4-BS/S二乙砜)的RSD。測(cè)得1,4-BS與二乙砜峰面積比的RSD為4.6%，表明儀器精密度良好。

2.7 溶液穩(wěn)定性 取SBE7-β-CD供試品約0.2 g，精密稱定，置10 ml離心管中，精密加入7.008 μg/ml的1,4-BS標(biāo)準(zhǔn)溶液1 ml(內(nèi)標(biāo)濃度為4.0 μg/ml)，渦旋溶解，再精密加入二氯甲烷溶液1 ml，渦旋1 min，靜置分層，取有機(jī)相，分別在室溫下放置0、2、4、8 h時(shí)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算RE%值。RE%值按如下公式進(jìn)行計(jì)算：(某小時(shí)濃度-0 h濃度)/0 h濃度×100%，見(jiàn)表1。結(jié)果表明，樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

表1 樣品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 萃取率 分別精密量取“2.5”項(xiàng)下高、中、低3種濃度(6.048、5.088、4.032 μg/ml)的標(biāo)準(zhǔn)溶液1 ml(內(nèi)標(biāo)濃度為4.0 μg/ml)，分別置10 ml離心管中，再分別精密加入二氯甲烷1 ml，渦旋1 min，靜置分層，取有機(jī)相，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖和峰面積，即得一次萃取峰面積。重復(fù)操作3次。

精密量取48 μg/ml的1,4-BS二氯甲烷溶液和40 μg/ml的二乙砜二氯甲烷溶液適量，配制成高、中、低3種濃度(6.048、5.088、4.032 μg/ml)的二氯甲烷溶液(內(nèi)標(biāo)濃度為4.0 μg/ml)，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖和峰面積，即得直接溶解峰面積。依此法重復(fù)操作3次。

萃取率按如下公式計(jì)算：一次萃取峰面積/直接溶解峰面積×100%，計(jì)算高、中、低3種濃度時(shí)的萃取率和RSD。

1,4-BS高、中、低3種濃度的平均萃取率分別為81.6%、73.0%、71.8%，RSD分別為14.3%、5.4%、6.3%；二乙砜高、中、低3種濃度的平均萃取率分別為59.0%、62.4%、50.5%，RSD分別為10.9%、7.6%、10.2%，表明一次萃取能夠滿足定量的要求，見(jiàn)表2。

表2 萃取回收率試驗(yàn)結(jié)果(靜置分層)

2.9 1,4-BS的含量測(cè)定 3批SBE7-β-CD供試品(20131104，20131105，20131106)按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，利用已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算3個(gè)批號(hào)的SBE7-β-CD中1,4-BS含量。3個(gè)批次SBE7-β-CD供試品中均沒(méi)有檢測(cè)到雜質(zhì)1,4-BS。

3 討論

3.1 分析方法與檢測(cè)器的選擇 1,4-BS為淡黃色黏稠液體，屬磺酸內(nèi)酯類化合物，水溶性低(54 g/L，20 ℃)。由于1,4-BS無(wú)紫外吸收，所以不能使用常規(guī)的紫外檢測(cè)器進(jìn)行分析。筆者曾嘗試采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定1,4-BS，結(jié)果未出現(xiàn)色譜峰，推測(cè)可能是因?yàn)?,4-BS的沸點(diǎn)較低(153 ℃，19 kPa)，與反相色譜常用流動(dòng)相水、甲醇的沸點(diǎn)相差不大，因此在蒸發(fā)光散射檢測(cè)器中易與流動(dòng)相一起揮發(fā)，不能很好地形成可產(chǎn)生散射的小液滴。根據(jù)1,4-BS沸點(diǎn)較低的特點(diǎn)，之后選擇毛細(xì)管氣相色譜方法進(jìn)行研究。考慮到1,4-BS中含有硫原子，最初采用對(duì)硫原子專屬的火焰光度檢測(cè)器(Flame photometric detector，F(xiàn)PD)進(jìn)行檢測(cè)。但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)1,4-BS在FPD檢測(cè)器中的淬滅效應(yīng)非常嚴(yán)重，導(dǎo)致靈敏度極低，改用FID檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果滿意。

3.2 供試品不脫水與脫水處理的考察 本試驗(yàn)采用從水中萃取供試品的處理方法。二氯甲烷溶劑色譜圖基線較平滑，而萃取水后所得有機(jī)相則出現(xiàn)了一些雜峰，見(jiàn)圖1a、e。筆者考察了供試品溶液經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水處理與不經(jīng)脫水處理的情況，發(fā)現(xiàn)兩種情況下色譜圖無(wú)明顯差異。因此可以判定萃取水后出現(xiàn)的雜質(zhì)峰并非由水蒸汽產(chǎn)生的，而是由水中的雜質(zhì)產(chǎn)生的。由于目前的方法還不能除去水中的雜質(zhì)，因此試驗(yàn)中供試品處理方法無(wú)需采用無(wú)水硫酸鈉的脫水處理。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線法與外標(biāo)一點(diǎn)法的比較 本研究在計(jì)算精密度和準(zhǔn)確度的同時(shí)也比較了外標(biāo)一點(diǎn)法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法的準(zhǔn)確性。標(biāo)準(zhǔn)曲線法高、中、低3種濃度中1,4-BS含量測(cè)定結(jié)果的RSD分別為1.6%、1.2%、1.2%，平均回收率分別為101.5%、99.3%、100.3%；外標(biāo)一點(diǎn)法高、中、低3種濃度中1,4-BS含量測(cè)定結(jié)果的RSD分別為1.5%、1.1%、1.2%，平均回收率分別為98.4%、100.0%、102.4%。兩種方法所得結(jié)果無(wú)明顯差異，因此在今后試驗(yàn)中可以考慮采用更為簡(jiǎn)便的外標(biāo)一點(diǎn)法。

3.4 萃取后分層方法的比較 試驗(yàn)還考察了萃取后靜置分層(約15 min)和離心分層(9 500×g)的效果。靜置分層時(shí)二乙砜高、中、低3種濃度的平均萃取率分別為59.0%、62.4%、50.5%，RSD分別為10.9%、7.6%、10.2%；離心分層時(shí)二乙砜高、中、低3種濃度的平均萃取率分別為56.1%、57.7%、52.8%，RSD分別為18.8%、24.8%、13.9%?？梢?jiàn)，靜置分層比離心分層的穩(wěn)定性更好，故選擇靜置分層的處理方法。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化色譜條件和供試品處理方法，建立了快速、準(zhǔn)確測(cè)定SBE7-β-CD中的雜質(zhì)1,4-BS的方法，可用于其質(zhì)量控制。