微流控芯片技術(shù)在血細(xì)胞變形和流動(dòng)性分析研究中的應(yīng)用進(jìn)展

戚曉菁, 李學(xué)進(jìn)

(浙江大學(xué)航空航天學(xué)院工程力學(xué)系 流體工程研究所, 杭州 310027)

0 引 言

微流控芯片(Microfluidics)又稱芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-chip)，是把生物、化學(xué)及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等多種技術(shù)單元靈活組合、規(guī)模集成并完成操控分析的一種微技術(shù)平臺(tái)[1]。由于微流控芯片具有小型化、微量化、定量化及集成化等諸多優(yōu)勢(shì)，因此已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境科學(xué)等研究領(lǐng)域[2-4]。特別地，由于微流控芯片具有設(shè)計(jì)靈活的特點(diǎn)，通過(guò)多通道陣列組合可提供復(fù)雜的微通道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(如直線型、彎曲蛇形、多邊形、折疊形)，可用于模擬生理和病理環(huán)境復(fù)雜的微血管環(huán)境[5-6]。因此，利用微流控芯片技術(shù)研究健康與疾病中血細(xì)胞在微血管內(nèi)的流動(dòng)和變形性能引起了研究人員的廣泛關(guān)注。

血細(xì)胞又稱“血球”，是存在于血液中的細(xì)胞，能隨血液的流動(dòng)遍及全身[7]。血細(xì)胞通常分為3類：紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板。紅細(xì)胞呈雙凹圓盤(pán)狀，直徑約為7～8 μm，有一定的彈性和可塑性，主要功能是運(yùn)送氧；白細(xì)胞體積比紅細(xì)胞大，能作變形運(yùn)動(dòng)，具有機(jī)體防御和免疫調(diào)節(jié)功能；血小板呈圓盤(pán)形，當(dāng)受到機(jī)械或化學(xué)刺激時(shí)，則伸出突起，呈不規(guī)則形，其主要功能是凝血和止血以及修補(bǔ)破損的血管。機(jī)體的生理和病理變化往往會(huì)引起血細(xì)胞數(shù)量或質(zhì)量(功能)的改變，進(jìn)而引起貧血、發(fā)熱、感染、出血和血管栓塞等臨床癥狀。例如，在微血管系統(tǒng)中，紅細(xì)胞在組織的氧合作用中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)紅細(xì)胞流過(guò)狹窄毛細(xì)血管時(shí)，由于存在剪切應(yīng)力，紅細(xì)胞會(huì)在毛細(xì)血管中發(fā)生壓縮變形，進(jìn)而促進(jìn)紅細(xì)胞與周邊組織的氧氣交換[8]。而在病理狀態(tài)下，紅細(xì)胞變形性能的下降阻礙了細(xì)胞通過(guò)微血管的轉(zhuǎn)運(yùn)。

血液是一種具有相當(dāng)黏性的流體,其在血管內(nèi)的流動(dòng)行為有著明顯的黏性流動(dòng)特性[9]：在靠近血管壁處血液流動(dòng)滿足斯托克斯流特征，而在遠(yuǎn)離血管壁的區(qū)域則又呈現(xiàn)明顯的泊肅葉流特征(圖1(a))。因此，血液在血管內(nèi)流動(dòng)時(shí)，紅細(xì)胞在慣性升力和細(xì)胞-血管壁相互作用下會(huì)發(fā)生變形并遷移至血管中間區(qū)域。我們知道，紅細(xì)胞幾乎占據(jù)了40%～45%的血液體積，因此，血管中紅細(xì)胞的遷移及運(yùn)動(dòng)行為主導(dǎo)了血流動(dòng)力學(xué)并致使白細(xì)胞和血小板向血管壁附近區(qū)域遷移(圖1(b))。利用血流這一特殊的動(dòng)力學(xué)特征，人們發(fā)展了多種微流控芯片裝置，用于分離和采集特定類型的血細(xì)胞，并在臨床診斷和個(gè)性化治療等方面發(fā)揮了重要的作用(圖1(c))。本文將結(jié)合國(guó)內(nèi)外最新研究進(jìn)展，以健康和疾病中的血細(xì)胞為例，從單細(xì)胞變形、流動(dòng)、黏附等性能表征及多細(xì)胞分離和遷移動(dòng)力學(xué)等方面簡(jiǎn)單歸納目前微流控芯片技術(shù)在血細(xì)胞力學(xué)分析和表征方面的應(yīng)用進(jìn)展。

圖1 血細(xì)胞在血管內(nèi)流動(dòng)的動(dòng)力學(xué)特征及微流控仿生模型設(shè)計(jì)

1 微流控芯片在血細(xì)胞變形和流動(dòng)性能研究中的應(yīng)用

1.1 血細(xì)胞在毛細(xì)微管道內(nèi)的流動(dòng)和變形

需氧代謝是人體維持生命活動(dòng)的基本條件，血液的運(yùn)輸功能主要依靠紅細(xì)胞來(lái)完成。在血液循環(huán)過(guò)程中(特別是在微循環(huán)過(guò)程中)，紅細(xì)胞必須具有良好的變形性能才能順利地通過(guò)口徑比它小的毛細(xì)血管網(wǎng)和血竇孔隙[7]。然而，在病理?xiàng)l件下，紅細(xì)胞變形性能降低，高切黏度增高，從而增加了血液的外周阻力，影響到血液循環(huán)以及組織和器官的血液供應(yīng)。因此，研究紅細(xì)胞的變形性能，對(duì)理解基本的血液循環(huán)及血液疾病的臨床表現(xiàn)均具有重要意義?；诖?，人們發(fā)展了單通道和多通道等不同類型的微流控芯片裝置，用于探索紅細(xì)胞在毛細(xì)管內(nèi)的流動(dòng)行為和變形性能。單通道微流控芯片指在一個(gè)芯片上僅含有一個(gè)微通道，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，可準(zhǔn)確檢測(cè)單個(gè)血細(xì)胞在毛細(xì)管道內(nèi)的流動(dòng)及變形性能；多通道微流控芯片也稱為集成微通道芯片，其在一塊芯片上包含有多個(gè)微通道，這樣便可以在同一芯片上同時(shí)并行處理多個(gè)樣品，具有高通量和高靈敏度的特點(diǎn)，從而提高了微流控芯片通量及檢測(cè)效率。此外，多通道微流控芯片的多維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可模擬復(fù)雜的血管分支網(wǎng)絡(luò)和血流微循環(huán)環(huán)境，可用來(lái)研究微血管堵塞及血栓形成過(guò)程。由于多通道芯片結(jié)構(gòu)復(fù)雜、控制參量多，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)操作及控制條件(如壓力梯度、來(lái)流速度等)提出了更嚴(yán)格的要求。本文重點(diǎn)綜述這方面的一些研究工作。

1.1.1 單通道微流控芯片

單通道微流控芯片可在高靈敏度下研究紅細(xì)胞在毛細(xì)血管內(nèi)的流動(dòng)，并直接觀察到細(xì)胞、亞細(xì)胞水平的動(dòng)態(tài)和不連續(xù)過(guò)程，從而幫助人們更好地認(rèn)識(shí)幾種紅細(xì)胞疾病。例如，李巨及其合作者設(shè)計(jì)了一種單通道微流控芯片來(lái)研究紅細(xì)胞隨毛細(xì)血流的流動(dòng)特征(圖2)[10]。他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)紅細(xì)胞擠入狹窄的毛細(xì)管道時(shí)(微通道尺寸只有4 μm)，細(xì)胞會(huì)發(fā)生很大的變形(圖2(c))，但一旦穿過(guò)后則很快恢復(fù)其最初的圓盤(pán)狀結(jié)構(gòu)(圖2(d))。同時(shí)，他們基于亞細(xì)胞層面的紅細(xì)胞模型結(jié)果分析，認(rèn)為細(xì)胞骨架重組可能是這種大變形的原因。Quinn等利用類似的微流控芯片裝置，對(duì)紅細(xì)胞在毛細(xì)血管內(nèi)的流動(dòng)規(guī)律進(jìn)行了定量探索[11]。通過(guò)調(diào)節(jié)通道出入口壓力梯度控制流體流速，他們分析了不同壓降下紅細(xì)胞通過(guò)毛細(xì)管的流動(dòng)速度，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞流動(dòng)速度隨壓力梯度近乎呈線性變化。由此可見(jiàn)，基于單細(xì)胞微流控芯片的實(shí)驗(yàn)和亞細(xì)胞層面的模型分析可以幫助人們理解紅細(xì)胞在毛細(xì)血管內(nèi)的流動(dòng)規(guī)律。

人們也通過(guò)電學(xué)測(cè)量的手段研究毛細(xì)管內(nèi)流動(dòng)紅細(xì)胞的變形性能[12-13]。我們知道，流過(guò)毛細(xì)管的紅細(xì)胞經(jīng)歷了瞬時(shí)形狀演變，而其特征形狀的恢復(fù)時(shí)間，可以作為紅細(xì)胞變形性能的標(biāo)志之一。在恒定剪切力下，紅細(xì)胞流過(guò)與其自身尺寸相近的毛細(xì)管時(shí)，會(huì)發(fā)生擠壓變形。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞變形的嚴(yán)重程度與沿微流體通道施加的電流的信號(hào)強(qiáng)度成比例[12]?；诖耍藗兛梢酝ㄟ^(guò)紅細(xì)胞的特征伸長(zhǎng)指數(shù)推斷其變形性能。

紅細(xì)胞血液病是血液系統(tǒng)發(fā)病率較高的疾病。近年來(lái)的研究表明紅細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)及變形性能與很多血液疾病的發(fā)生和發(fā)展都密切相關(guān)。目前，人們通過(guò)微流控芯片可測(cè)定病變紅細(xì)胞的變形性能，從而獲得有關(guān)血液疾病臨床狀態(tài)以及藥物療效的一些關(guān)鍵信息[14-16]。例如，Shelby等設(shè)計(jì)了一種單通道微流控芯片來(lái)測(cè)定惡性瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞(后文簡(jiǎn)稱“瘧疾感染紅細(xì)胞”)的變形性能變化[14]。他們從患者血液中獲取不同感染程度的紅細(xì)胞，并將其放在黏性流體中稀釋，然后使其通過(guò)不同尺寸的狹窄矩形毛細(xì)微管道(圖3)。這些感染的紅細(xì)胞有不同的形狀和剛?cè)嵝?，進(jìn)而影響其在微通道內(nèi)的流動(dòng)行為。他們發(fā)現(xiàn)感染初期的環(huán)狀體(Ring)紅細(xì)胞可正常通過(guò)毛細(xì)微管道(圖3(a1)～(a4))，而處于滋養(yǎng)體(Trophozoite)階段的紅細(xì)胞可通過(guò)較寬尺寸(6和8 μm)的微管道，但無(wú)法順利通過(guò)更狹窄(2和4 μm)的微管道。但是，處在裂殖體(Schizont)階段的紅細(xì)胞變形性能明顯減弱，僅能通過(guò)8 μm的毛細(xì)管(圖3(b1))，而無(wú)法通過(guò)6 μm及以下的毛細(xì)管(圖3(b2)～(b4))。

Guo等設(shè)計(jì)了一種輕便的微流控芯片裝置來(lái)研究瘧疾感染紅細(xì)胞變形性能的變化[15]。這種微流控裝置借助一系列緊壓的“漏斗形收縮”使得紅細(xì)胞變形通過(guò)(圖4(a)～(b))，然后根據(jù)測(cè)定的推動(dòng)細(xì)胞流過(guò)“漏斗形收縮”的壓力大小分析感染紅細(xì)胞的變形性能。結(jié)果表明，在惡性瘧原蟲(chóng)感染紅細(xì)胞的各個(gè)階段實(shí)時(shí)精確測(cè)定感染紅細(xì)胞的變形性能是可能的(圖4(c))。

1.1.2 多通道微流控芯片

利用微流控芯片裝置進(jìn)行血細(xì)胞性能分析時(shí)，由于單個(gè)血細(xì)胞的尺寸很小，因此往往只能對(duì)微量的血液樣本進(jìn)行檢測(cè)。在多數(shù)情況下，感染或者病變血細(xì)胞在微量血液樣本中含量極少。因此，如何從微量血樣中對(duì)含量極少的感染紅細(xì)胞進(jìn)行分析檢測(cè)是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。為此，人們?cè)O(shè)計(jì)了多通道微流控芯片，可在高通量和高靈敏度下對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行直接的力學(xué)分析和變形性能測(cè)量。同時(shí)，微流控芯片的多維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可連通成網(wǎng), 可以模擬復(fù)雜的幾何形態(tài)和更逼真的血流微循環(huán)環(huán)境。目前，多通道微流控芯片已被用于研究健康與疾病中血細(xì)胞的變形、聚集及微血栓形成等方面。根據(jù)本課題組及合作者在此領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)積累，介紹以下3個(gè)方面的研究進(jìn)展。

圖2 基于單通道微流控裝置研究健康紅細(xì)胞在毛細(xì)管內(nèi)的流動(dòng)和變形[10]。(a)～(d)顯示紅細(xì)胞在流過(guò)毛細(xì)管不同區(qū)域時(shí)的變形

Fig.2Invitromicrofluidic model for investigating the translocation process of a healthy human red blood cell (RBC) through a microcapillary[10]. The series of images (a)～(d) show the shape of the RBC as it is squeezed through the narrow microchannel

圖3 基于單通道微流控裝置研究瘧疾感染紅細(xì)胞在不同尺寸的毛細(xì)管內(nèi)的流動(dòng)及堵塞行為[14]。自左至右毛細(xì)管的寬度分別為8、6、4及2 μm。感染初期的環(huán)狀體紅細(xì)胞可順利通過(guò)毛細(xì)管道((a1)～(a4))；感染末期處于裂殖體階段的紅細(xì)胞僅能通過(guò)8 μm的毛細(xì)管道(b1)，但無(wú)法通過(guò)6 μm及以下的毛細(xì)管并導(dǎo)致微通道的堵塞((b2)～(b4))

Fig.3 Micrographs of malaria-infected RBCs traversal across microfluidic channels. Ring-stage infected RBCs can pass through all constricted microchannels ((a1)～(a4)); schizont-stage infected RBCs block all but the 8 μm microchannel ((b1)～(b4))

圖4 基于單通道“漏斗形收縮”微流控裝置研究瘧疾感染紅細(xì)胞的流動(dòng)及變形行為[15]。(a) 感染初期的環(huán)狀體紅細(xì)胞在較小的壓力梯度下可通過(guò)漏斗形收縮微管道；(b) 感染末期處于裂殖體階段的紅細(xì)胞則需要較大的壓力梯度才能通過(guò)微細(xì)管；(c) 基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)得到的不同感染階段的紅細(xì)胞膜皮質(zhì)張力

Fig.4 Analysis of the flow behavior and deformability of malaria-infected RBCs in microfluidic channels with multiple funnel-shaped constrictions. (a) A ring-stage infected RBC could transit rapidly through the funnel constriction at a low pressure; (b) A schizont-stage infected RBC, which is hardly deformed, requires a high pressure to drive through the constriction; (c) Histogram of the measured cortical tension of uninfected and malaria-infected RBCs

(1) 基于多通道微流控裝置研究瘧疾感染紅細(xì)胞在毛細(xì)管內(nèi)的流動(dòng)行為。Bow等設(shè)計(jì)了一種多通道微流控裝置，可從僅含有極少量瘧疾感染紅細(xì)胞的血樣中對(duì)感染紅細(xì)胞進(jìn)行直接的變形性能檢測(cè)[17]。他們?cè)O(shè)計(jì)的微流控裝置上有多組并排的、寬度僅為3 μm的微管道陣列(圖5(a))。當(dāng)紅細(xì)胞在微流道內(nèi)流動(dòng)時(shí)，必須通過(guò)變形以流過(guò)微管道陣列(圖5(b)，箭頭所示)。相比健康紅細(xì)胞而言，瘧疾感染紅細(xì)胞更難擠入狹窄微通道，且在微流道內(nèi)流動(dòng)速度更慢，說(shuō)明受感染的紅細(xì)胞變形性能有明顯的降低。同時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)微管道入口的形狀(收縮式入口及發(fā)散式入口)也會(huì)對(duì)紅細(xì)胞的流動(dòng)行為有明顯的影響。相比于發(fā)散式入口微管道結(jié)果，受感染的紅細(xì)胞更容易進(jìn)入收縮式入口微管道，且其在微流道內(nèi)的流速也有明顯的增加。因此，借助該微流控芯片裝置可以更好地分析受感染的紅細(xì)胞的流動(dòng)行為，并幫助醫(yī)學(xué)工作者更好地診斷疾病。

圖5 基于多通道微流控裝置研究受瘧疾感染紅細(xì)胞在毛細(xì)管內(nèi)的流動(dòng)行為[17]。(a) 微流道裝置示意圖。微流道內(nèi)有多組并排的寬度僅為3 μm的微管道陣列，紅細(xì)胞流過(guò)微管道陣列時(shí)需變形才能通過(guò); (b) 通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得的健康紅細(xì)胞(藍(lán)色箭頭所示)和瘧疾感染紅細(xì)胞(紅色箭頭所示)在多通道毛細(xì)管內(nèi)的流動(dòng)現(xiàn)象

Fig.5 Microfluidic platform for studying the flow behavior of malaria-infected RBCs in the microchannel[17]. (a) Schematic diagram of the device design; the spacing between pillars is 3 μm and the depth of the device is 4.2 μm; (b) Micrographs of uninfected (blue arrows) and malaria-infected (red arrows) RBCs in the microchannel

(2) 基于多通道微流控裝置研究鐮狀細(xì)胞貧血癥下紅細(xì)胞的鐮變過(guò)程及其對(duì)細(xì)胞變形和流動(dòng)的影響。鐮狀細(xì)胞貧血癥是一種常見(jiàn)的遺傳性血液疾病，也是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)分子疾病[19]。其臨床表現(xiàn)為慢性溶血性貧血、易感染和再發(fā)性疼痛危象以致局部缺血從而導(dǎo)致器官組織損害[20]。為了探索紅細(xì)胞的鐮變過(guò)程及其導(dǎo)致的毛細(xì)血管堵塞現(xiàn)象，研究人員需要對(duì)紅細(xì)胞所處微環(huán)境的氧氣濃度進(jìn)行調(diào)控并模擬鐮變紅細(xì)胞在毛細(xì)血管內(nèi)的流動(dòng)和堵塞情況。然而，從實(shí)驗(yàn)角度來(lái)看，利用常規(guī)實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)現(xiàn)這樣的細(xì)胞微環(huán)境有較高難度。Du等利用互聯(lián)多通道微流控裝置克服了這一局限[18, 21]。該裝置允許研究人員調(diào)控氧氣水平和脫氧程度，進(jìn)而控制紅細(xì)胞的鐮變過(guò)程并分析紅細(xì)胞從發(fā)生鐮變到誘發(fā)鐮狀細(xì)胞危象的整個(gè)過(guò)程(圖6(a)和(c))。他們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氧氣濃度非常低或處于缺氧狀態(tài)時(shí)，紅細(xì)胞發(fā)生鐮變，不但在外形上由圓盤(pán)狀變成鐮刀狀(圖6(b))，其變形性能也有明顯異常：鐮狀紅細(xì)胞變形性能差，進(jìn)而在微管道陣列中發(fā)生堵塞(圖6(d))。同時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞鐮變的初期是可逆的，給予氧可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞鐮變過(guò)程。所以，一旦把鐮變紅細(xì)胞置于有氧環(huán)境時(shí)，紅細(xì)胞可迅速恢復(fù)圓盤(pán)狀結(jié)構(gòu)且可通過(guò)變形流過(guò)微管道[21]。

此外，鐮變紅細(xì)胞還可使血液黏滯性增加，血流緩慢，加之變形性能差，易堵塞毛細(xì)血管和小靜脈血管，從而引起局部缺氧和炎癥反應(yīng)導(dǎo)致相應(yīng)部位產(chǎn)生疼痛危象[20]。為了探索鐮變紅細(xì)胞如何與血管相互作用引發(fā)血管栓塞，Papageorgiou等人利用互聯(lián)多通道微流控芯片裝置研究了鐮狀紅細(xì)胞黏附毛細(xì)管道壁的動(dòng)力學(xué)過(guò)程[22-23]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鐮變初期的紅細(xì)胞在毛細(xì)管中可顯著地黏附于管道壁，缺氧會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)這些紅細(xì)胞的黏附，但是對(duì)鐮變末期的紅細(xì)胞無(wú)明顯影響；同時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)鐮狀網(wǎng)織紅細(xì)胞表現(xiàn)出獨(dú)特的黏附動(dòng)力學(xué)行為：鐮狀網(wǎng)織紅細(xì)胞可以從細(xì)胞表面向外生長(zhǎng)的鐮狀纖維處產(chǎn)生新的黏附位點(diǎn)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞黏附。該互聯(lián)多通道微流體模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了鐮變初期的紅細(xì)胞在微環(huán)境中導(dǎo)致血管栓塞形成的重要作用。該芯片的設(shè)計(jì)接近體內(nèi)微血管通道，可作為一種易于使用的體外模型，用來(lái)探索毛細(xì)微通道中病變紅細(xì)胞的黏附及流動(dòng)行為。

(3) 血液疾病微血管阻塞及血栓模型。微血栓是微循環(huán)的血管中由于血細(xì)胞或纖維蛋白互相粘結(jié)而成的一種均質(zhì)無(wú)結(jié)構(gòu)的微小血栓。由于微血栓尺寸小，所以在一般的病理檢查(包括X光、B超、心電圖等)時(shí)難以發(fā)現(xiàn)，其在體內(nèi)的形成過(guò)程更難以檢測(cè)。近年來(lái)，人們借助微流控芯片技術(shù)嘗試研究微血管阻塞及微血栓形成過(guò)程[5, 24]。例如，Tsai等設(shè)計(jì)了一種微流控器件來(lái)模擬變狹窄的小動(dòng)脈血管，可以在生理和病理血流下分析微血管堵塞及血栓形成的過(guò)程[25]。該微流控器件內(nèi)含有多組互通且分叉的微管道(最小尺寸為30 μm)，以模擬毛細(xì)血管后小靜脈和動(dòng)脈形成的復(fù)雜血管網(wǎng)絡(luò)(圖7)。利用該微流控芯片可模擬包括血液-內(nèi)皮細(xì)胞黏附、多細(xì)胞聚集等力學(xué)因素導(dǎo)致的血流動(dòng)力學(xué)環(huán)境的變化，以及模擬包含腫瘤壞死因子a (TNF-a)、突觸融合蛋白2 (STX2)等在內(nèi)的多種生化因素促使微血管血栓形成的過(guò)程。借助該微流控芯片，他們還定量研究了羥基脲(Hydroxyurea)藥物對(duì)鐮狀細(xì)胞貧血癥引發(fā)的微血管堵塞的影響，發(fā)現(xiàn)該藥物可降低微血管栓塞的幾率，從而為解釋該藥在臨床上的藥效作用提供了細(xì)胞水平的依據(jù)。該研究表明，基于微流控芯片的微血管堵塞及血栓模型是連接體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的一座橋梁，為血液疾病微血管栓塞的病理研究及相關(guān)藥物篩選提供了條件。

圖6 基于多通道微流控裝置研究鐮狀細(xì)胞貧血癥下紅細(xì)胞的流動(dòng)和變形性能[18]。(a) 通過(guò)調(diào)控氧氣水平和脫氧程度控制紅細(xì)胞的鐮變和可逆轉(zhuǎn)鐮變過(guò)程;(b) 當(dāng)處于缺氧狀態(tài)時(shí)，紅細(xì)胞發(fā)生鐮變后導(dǎo)致其形狀發(fā)生變化(黃色箭頭所示)；(c) 微流道裝置示意圖。微流道內(nèi)有多組并排的寬度僅為4 μm的微通道陣列，紅細(xì)胞需變形才能通過(guò)；(d) 在有氧(上圖)和脫氧條件(下圖)下，觀察紅細(xì)胞在毛細(xì)管道內(nèi)的流動(dòng)及堵塞現(xiàn)象

Fig.6 Microfluidic platform for studying sickle cell behavior under transient hypoxic conditions[18]. (a) Schematic diagram of microfluidic device; (b) Visual determination of cell sickling events from morphological changes in RBC membrane; (c) Schematic diagram of microfluidic device; the microfluidic channel contains periodic obstacles forming 15-μm-long, 4-μm-wide and 5-μm-high microgates; (d) Individual RBC behavior under oxygenated (Oxy, upper) and deoxygenated (DeOxy, lower) states[18]

圖7 基于多通道微流控裝置模擬微血管堵塞及血栓形成過(guò)程[25]。(a) 微流控芯片裝置圖；(b) 微流控芯片中多通路微管道網(wǎng)絡(luò)示意圖，其中最中間一排的微管道寬度只有30 μm；(c) 微流控芯片上“內(nèi)皮細(xì)胞化”微血管分叉結(jié)構(gòu)；(d) 血細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏附及多細(xì)胞聚集導(dǎo)致的微血管堵塞現(xiàn)象

Fig.7Invitromicrofluidic microvasculature model for modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic disease[25]. (a)～(b) Illustration of the device design; (c) Characterization of the “endothelialized” microvasculature on the chip; (d) The observation of microchannel occlusion due to a combination of increased adhesion and cell stiffness

1.2 血細(xì)胞分離和采集

血細(xì)胞分離和采集是從全血中把某種特定類型的血細(xì)胞(如紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板等)分離、純化并進(jìn)行采集，在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究以及血液疾病臨床診斷和治療中具有非常重要的作用[26-27]。通過(guò)微流控芯片裝置可以對(duì)少量血樣快速、高效地檢測(cè)并分離出不同種類的血細(xì)胞。目前，以微流控芯片為研究平臺(tái)的血細(xì)胞分離采集方法主要有2種：(1) 以細(xì)胞微結(jié)構(gòu)和物理/力學(xué)特性為基礎(chǔ)的細(xì)胞被動(dòng)分離[28-29]；(2) 通過(guò)在微流控通道中施加外加力場(chǎng)驅(qū)動(dòng)細(xì)胞分離[30-31]。

1.2.1 以血細(xì)胞微結(jié)構(gòu)和物理/力學(xué)特性為基礎(chǔ)的細(xì)胞分離

流體流動(dòng)時(shí)，在黏彈性效應(yīng)和慣性效應(yīng)作用下，大顆粒將向靠近側(cè)壁的橫向位置遷移。類似地，當(dāng)血液在血管中流動(dòng)時(shí)，尺寸較小的柔性紅細(xì)胞將遷移至血管中間區(qū)域，而尺寸較大的剛性白細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞將向血管壁周?chē)w移。利用這一特殊的血流動(dòng)力學(xué)特征，一些課題組設(shè)計(jì)了微流控芯片用于分離并采集不同類型的血細(xì)胞。例如， Liu等基于細(xì)胞物理特性和流體黏彈性效應(yīng)設(shè)計(jì)了一種微流控芯片，不同大小的細(xì)胞在微流道內(nèi)流動(dòng)至不同的通道：紅細(xì)胞匯聚在中間通道，而腫瘤細(xì)胞在兩側(cè)通道內(nèi)富集[28]，成功實(shí)現(xiàn)了循環(huán)腫瘤細(xì)胞和紅細(xì)胞的完全分離。此外，他們通過(guò)改變作用于囊泡的流體力，成功實(shí)現(xiàn)了外泌體從胞外囊泡的分離采集[32]。類似地，Zhang等利用該方法實(shí)現(xiàn)了紅細(xì)胞與血漿的加速分離[33]。Hou等設(shè)計(jì)了一種可以控制液體流動(dòng)的微流控芯片，通過(guò)不同的管道設(shè)計(jì)與流速調(diào)節(jié)改變微流道內(nèi)的流體力學(xué)特征，進(jìn)而利用血細(xì)胞在大小、形狀及剛?cè)崃W(xué)特性的不同，從微量血液樣品中分離出了特定的血細(xì)胞，包括瘧疾感染的紅細(xì)胞[34]、循環(huán)腫瘤細(xì)胞[35]及不同種類的白細(xì)胞[36-37]，最終達(dá)到了檢測(cè)的目的。

圖8 基于慣性效應(yīng)和黏彈性效應(yīng)設(shè)計(jì)的微流控裝置用于特定類型血細(xì)胞的分離采集[34-35]。(a) 微流道內(nèi)瘧疾感染紅細(xì)胞和健康紅細(xì)胞的分離[34]；(b) 微流道內(nèi)循環(huán)腫瘤細(xì)胞、白細(xì)胞和紅細(xì)胞的分離[35]

Fig.8 Schematic illustration of cell separation in microfluidic channels based on cell size and deformability[34-35]. (a) Separation of malaria-infected RBCs and uninfected RBCs in microfluidic channel[34]；(b) Separation of RBCs, white blood cells (WBCs) and tumor cells in microfluidic channel[35]

1.2.2 通過(guò)在微流控通道中施加外加力場(chǎng)驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞分離

通過(guò)在微流控通道中施加外加力場(chǎng)驅(qū)動(dòng)細(xì)胞分離的方式主要包括介電電泳力驅(qū)動(dòng)、磁場(chǎng)作用力驅(qū)動(dòng)、超聲波驅(qū)動(dòng)等3種。

(1) 介電電泳力驅(qū)動(dòng)。介電電泳技術(shù)描述的是位于非均勻電場(chǎng)的中性微粒由于介電極化的作用而產(chǎn)生的平移運(yùn)動(dòng)。當(dāng)處于非均勻電場(chǎng)中時(shí)，血細(xì)胞產(chǎn)生極化現(xiàn)象，其表面會(huì)產(chǎn)生偶極矩，進(jìn)而在介電電泳力的作用下，向更強(qiáng)的電場(chǎng)強(qiáng)度方向移動(dòng)(陽(yáng)性介電電泳)或者更弱的電場(chǎng)強(qiáng)度方向移動(dòng)(陰性介電電泳)。由于血細(xì)胞所受介電電泳力的大小取決于血細(xì)胞的大小和形狀、以及懸浮媒介的介電性質(zhì)和黏度特性等因素，因此在微流控芯片上進(jìn)行介電電泳可實(shí)現(xiàn)血細(xì)胞的分離[38-39]。介電電泳細(xì)胞分離技術(shù)具有無(wú)需標(biāo)記、無(wú)需表面修飾和特異性高的特點(diǎn)，因此， 以微流控芯片介電電泳為基礎(chǔ)的分離采集技術(shù)在血細(xì)胞分離領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用。例如，Nascimento等利用微流控介電電泳實(shí)現(xiàn)了受寄生蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞與健康紅細(xì)胞的分離采集[40]。當(dāng)紅細(xì)胞受到寄生蟲(chóng)感染后，其細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)和表面抗原會(huì)發(fā)生一定程度的變化，同時(shí)，細(xì)胞膜通透性也會(huì)有一定程度的增強(qiáng)，導(dǎo)致感染紅細(xì)胞和健康紅細(xì)胞在介電場(chǎng)中所受介電電泳力的方向和大小都有不同，進(jìn)而遷移至不同的微通道，實(shí)現(xiàn)分離采集的目的。

(2) 磁場(chǎng)作用力驅(qū)動(dòng)。對(duì)目標(biāo)血細(xì)胞用微型磁珠進(jìn)行磁性標(biāo)記，被磁性標(biāo)記的血細(xì)胞流經(jīng)磁場(chǎng)區(qū)域時(shí)，磁場(chǎng)作用力使目標(biāo)血細(xì)胞偏離原來(lái)的運(yùn)動(dòng)軌道。不同大小和磁化率的血細(xì)胞流經(jīng)梯度磁場(chǎng)時(shí)所受磁場(chǎng)作用力不同從而實(shí)現(xiàn)分離采集。例如，Karabacak等利用慣性效應(yīng)及磁場(chǎng)效應(yīng)設(shè)計(jì)了一種微流控芯片裝置，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離富集[30]。這套微流控裝置前半部分的微通道內(nèi)布滿了傾斜的微柱陣列，尺寸小的紅細(xì)胞/血小板和尺寸大的白細(xì)胞/癌細(xì)胞在微柱陣列中受到慣性升力不同而分離至不同的微通道(圖9(a))。接下來(lái)，白細(xì)胞和癌細(xì)胞的懸浮液經(jīng)過(guò)中間微通道流經(jīng)磁場(chǎng)區(qū)域，在磁場(chǎng)作用力和流體驅(qū)動(dòng)力的共同驅(qū)動(dòng)下流向不同的收集通道，從而將低濃度的癌細(xì)胞從白細(xì)胞中分離出來(lái)(圖9(a))。Zhao等利用磁流體對(duì)不同類型細(xì)胞的作用力不同設(shè)計(jì)了2種微流控裝置(圖9(b))，實(shí)現(xiàn)了循環(huán)腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞/紅細(xì)胞的分離[41]。另外，利用磁流體方法可測(cè)量紅細(xì)胞在磁性介質(zhì)中的懸浮情況，進(jìn)而評(píng)估紅細(xì)胞的變形性能。例如，Tasoglu等將紅細(xì)胞浸入溶液里，然后注入夾在2個(gè)磁體中間的毛細(xì)管中[42]。磁力從毛細(xì)管底部到頂部垂直減小，因此紅細(xì)胞的最終平衡位置由細(xì)胞的密度確定。這種方法可以區(qū)分并分離健康和被感染的紅細(xì)胞。

圖9 微流控通道中細(xì)胞分離示意圖。(a)～(b) 基于慣性升力和磁場(chǎng)效應(yīng)從微量血液樣品中實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞和血細(xì)胞的分離采集[30, 41]；(c)～(d) 通過(guò)超聲波微流控裝置從血細(xì)胞混合液中分離腫瘤細(xì)胞[43-45]

Fig 9 Schematic illustration of cell separation in microfluidic channel. (a)～(b) Separation of blood cells and tumor cells in ferrofluids[30, 41]；(c)～(d) acoustic separation of tumor cells from blood samples[43-45]

(3) 超聲波驅(qū)動(dòng)。對(duì)通過(guò)微通道的流體施加一定角度的聲波，其產(chǎn)生的壓力可推動(dòng)懸浮在液體中的顆粒移動(dòng)。與正常的血細(xì)胞相比，聲波對(duì)癌細(xì)胞的推力更大，故可將腫瘤細(xì)胞推到單獨(dú)的微通道。例如，Ding等人設(shè)計(jì)了一個(gè)外加表面聲波的微流控裝置實(shí)現(xiàn)了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離捕獲[44]。這套微流控裝置的兩端裝有2個(gè)產(chǎn)生聲波的傳感器(圖9(c))。當(dāng)兩股聲波相遇時(shí)，產(chǎn)生的壓力能推動(dòng)細(xì)胞移動(dòng)。他們利用此方法從乳腺癌患者的血液中成功檢測(cè)到極為罕見(jiàn)的腫瘤細(xì)胞[45]。Collins等使用高頻聚焦表面聲波垂直作用于流體，進(jìn)而推動(dòng)流體流動(dòng)并在微通道中產(chǎn)生流體渦流[43]。他們利用流體渦流形成的渦旋實(shí)現(xiàn)了多種不同尺寸顆粒的分離捕獲，并從紅細(xì)胞和癌細(xì)胞混合液中成功捕獲了乳腺癌細(xì)胞(圖9(d))?；谖⒘骺爻暡?qū)動(dòng)的細(xì)胞分選具有無(wú)需配體、無(wú)需標(biāo)記和生物兼容的特點(diǎn)，同時(shí)，由于每個(gè)細(xì)胞僅在不到1 s的時(shí)間內(nèi)經(jīng)歷聲波，因此，與其他細(xì)胞分離捕獲技術(shù)相比，該技術(shù)顯得更為溫和，對(duì)分離血細(xì)胞損傷的風(fēng)險(xiǎn)大大降低。

1.3 血細(xì)胞機(jī)械疲勞損傷

軟物質(zhì)材料會(huì)在長(zhǎng)期的循環(huán)應(yīng)變作用下發(fā)生損傷和斷裂，也就是機(jī)械疲勞。類似的，在生物細(xì)胞中，例如紅細(xì)胞，在循環(huán)應(yīng)力的作用下也會(huì)產(chǎn)生機(jī)械疲勞。Du及其合作者基于介電電泳技術(shù)設(shè)計(jì)了一種包含振幅調(diào)制電極的微流控芯片，研究了循環(huán)機(jī)械應(yīng)變下單個(gè)紅細(xì)胞的機(jī)械疲勞損傷行為[46-47]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在一定的循環(huán)載荷下，紅細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生機(jī)械疲勞效應(yīng)；同時(shí)，在相同的累積加載時(shí)間和相同的最大載荷下，動(dòng)態(tài)循環(huán)載荷比靜態(tài)載荷對(duì)紅細(xì)胞膜的損傷更大[48]。此外，他們發(fā)現(xiàn)不同的載荷形態(tài)(如方波載荷、擬正弦波載荷等)對(duì)紅細(xì)胞膜損傷的影響程度也有所不同：與擬正弦波載荷實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，循環(huán)方波載荷對(duì)紅細(xì)胞膜機(jī)械變形影響更為顯著。他們還發(fā)現(xiàn)機(jī)械疲勞效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致磁滯和能量耗散，持續(xù)的機(jī)械疲勞對(duì)血細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性和生物學(xué)功能有著不利影響。這樣的疲勞測(cè)試平臺(tái)可用來(lái)定量表征血液循環(huán)過(guò)程中單個(gè)血細(xì)胞累積的細(xì)胞膜損傷，幫助人們了解血細(xì)胞的應(yīng)力波動(dòng)對(duì)其生物力學(xué)特性的影響。

2 總結(jié)及展望

紅細(xì)胞變形性能對(duì)血流性質(zhì)有重大影響，它是決定高切率下血液黏率的關(guān)鍵因素。許多血液病變是由于紅細(xì)胞變形性能低下導(dǎo)致的。例如，瘧疾感染紅細(xì)胞和貧血癥下鐮狀紅細(xì)胞的變形性能會(huì)減弱，不利于紅細(xì)胞通過(guò)狹窄毛細(xì)血管[49-50]；遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥下球形紅細(xì)胞由于體表比增加進(jìn)而使紅細(xì)胞很難變形[51-52]。目前，人們已發(fā)展一些實(shí)驗(yàn)技術(shù)來(lái)研究病變紅細(xì)胞的變形性能及生物力學(xué)響應(yīng),然而，在單細(xì)胞水平研究紅細(xì)胞的變形和流動(dòng)特征仍面臨很大挑戰(zhàn)。近些年來(lái)迅速發(fā)展的微流控芯片技術(shù)憑借其特有的優(yōu)勢(shì)為健康與疾病中的紅細(xì)胞力學(xué)性能研究提供了一個(gè)很好的平臺(tái)。隨著微流控芯片技術(shù)的不斷發(fā)展，如何模擬更復(fù)雜的幾何形態(tài)和更逼真的血流微環(huán)境，把血細(xì)胞形狀的動(dòng)態(tài)變化和各種疾病的病理變化及臨床表現(xiàn)聯(lián)系起來(lái)，將是未來(lái)工作的一個(gè)重點(diǎn)和難點(diǎn)。

同時(shí)，基于微流控芯片技術(shù)的器官芯片(Organ-on-a-chip)近幾年來(lái)發(fā)展迅速，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了體外模擬多種活體細(xì)胞、組織及器官微環(huán)境[53]。為適應(yīng)人類器官及血管的復(fù)雜性，未來(lái)的研究需要建立更加復(fù)雜的多器官微流控芯片(Multi-organ-on-a-chip)系統(tǒng)，將不同器官芯片模型應(yīng)用到類似人體的血液循環(huán)環(huán)境中。目前熱門(mén)的3D生物打印技術(shù)具有精確的控制能力和個(gè)性化特點(diǎn)，使得“定制”人體組織器官成為可能。通過(guò)在芯片上打印特定帶血管的器官，可以更好地模擬細(xì)胞、血管及組織微環(huán)境并建立患者特異化(Patient-Specific)的血管及器官模型，進(jìn)而從細(xì)胞-組織-器官等不同層面多尺度探索相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制，并進(jìn)行更加系統(tǒng)的藥物毒性檢測(cè)和藥效評(píng)估。