原子力顯微鏡的生物力學實驗方法和研究進展

關(guān)東石, 李航宇, 童彭爾

(1. 中國科學院力學研究所 非線性力學國家重點實驗室, 北京 100190; 2. 香港科技大學 物理系, 香港)

0 引 言

生命系統(tǒng)中的力學問題與人類生命健康密切相關(guān)，已經(jīng)成為近年來力學、物理學、生命科學和醫(yī)學等學科所關(guān)注的交叉學科熱點問題。生命系統(tǒng)中的力學問題涉及豐富的復雜流體和微納尺度流動現(xiàn)象，是流體力學致力解決的重要科學問題之一。針對活細胞、細胞組件等生命物質(zhì)的力學性質(zhì)表征，研究其與外界(力學、化學、生物等)環(huán)境的相互作用及其在不同生命活動和狀態(tài)下的動態(tài)變化，是生物力學及其交叉研究的重要內(nèi)容[1-5]。

對生命物質(zhì)進行力學測量，其挑戰(zhàn)在于生命物質(zhì)力學性質(zhì)的獨特性以及流體介質(zhì)的復雜性。一方面，活細胞等生命物質(zhì)彈性模量非常小(千帕量級)，還具有黏彈性、多孔彈性、界面黏附性、各向異性等復雜的力學屬性[4-7]；另一方面，活細胞和組織的形態(tài)與力學性質(zhì)會因生命活動和健康狀態(tài)發(fā)生動態(tài)改變，并受到微環(huán)境中的力學、化學和生物等因素的影響[8-10]；此外，生命系統(tǒng)中的流體介質(zhì)(如細胞液、血液、組織液等)以及生物實驗中使用的細胞培養(yǎng)液多為復雜流體，內(nèi)含大量的多糖、蛋白質(zhì)等生物大分子，在此類流體介質(zhì)中進行力學測量，既要克服流體的阻尼，又要考慮與生物大分子的相互作用。因此，發(fā)展高精度的生物力學實驗測量方法與技術(shù)，是該研究領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。

目前，已利用微管、光鑷、磁鑷、原子力顯微鏡等發(fā)展了多種實驗技術(shù)對各類生命物質(zhì)的力學性質(zhì)進行測定[11-22]。其中，原子力顯微鏡技術(shù)(Atomic Force Microscopy，AFM)是近年發(fā)展起來的一種表面探測技術(shù)。其核心是一根微米尺度的懸臂，懸臂的探針尖端與樣品表面發(fā)生相互作用而產(chǎn)生形變，該形變通過激光的反射被放大和檢測，如圖1所示。原子力顯微鏡具備納米級高分辨率，被廣泛應(yīng)用于納米材料表面形貌、樣品和探針之間各種相互作用力(如范德華力[23]、電磁力[24]、光力[25-27]、毛細力[28-31]等)的測量；還被應(yīng)用于軟材料力學性質(zhì)[31-32]的測量，并進而被應(yīng)用于測量生命物質(zhì)的力學特性[33-36]。常規(guī)原子力顯微鏡技術(shù)一般用于空氣或真空中的精密測量，但在生物力學實驗的液體環(huán)境中，由于液體阻尼(黏滯力)對懸臂的影響，需要對探針的選取和測量條件作進一步考量。

圖1 原子力顯微鏡示意圖

本文旨在從微納尺度力學角度厘清液體環(huán)境中原子力顯微鏡的生物力學實驗方法，綜述本課題組在相關(guān)領(lǐng)域的研究進展(此前，國內(nèi)研究者已分別從力學-生物學-化學耦合[37]、連續(xù)介質(zhì)力學[38]、生物力學到力學生物學的進展[39]等角度對生物力學的交叉領(lǐng)域進行了較為全面的綜述，本文不再贅述)。首先介紹原子力顯微鏡力學測量的基本原理，分析不同測量模式的力學靈敏度和優(yōu)缺點；然后介紹原子力顯微鏡常用的生物力學實驗方法，包括探針的制備與修飾、生物樣品的準備和實驗條件等；最后通過原子力顯微鏡在不同尺度生命物質(zhì)力學測量中的應(yīng)用，闡明原子力顯微鏡系統(tǒng)作為微納尺度力學的實驗平臺為多尺度生物力學問題研究開辟了一條新的道路。

1 原子力顯微鏡力學測量原理

在氣體或液體中，原子力顯微鏡懸臂的運動可以由朗之萬(Langevin)方程[27, 29]精確描述:

(1)

式中，z(t)為t時刻懸臂尖端的縱向位移；等式左側(cè)第一項代表慣性力，m為探針的等效質(zhì)量；第二項代表流體作用于懸臂的黏滯力，ξ為黏滯系數(shù)；第三項代表懸臂彎曲導致的彈性力，kc為懸臂的彈性系數(shù)；Fext(z,t)代表作用于懸臂的外力，F(xiàn)B(t)為流體熱擾動導致的隨機布朗力。根據(jù)懸臂的驅(qū)動形式，原子力顯微鏡的力學測量模式可分為靜態(tài)模式和動態(tài)模式兩大類。

1.1 靜態(tài)模式

靜態(tài)模式(又稱接觸模式)是指原子力顯微鏡工作時不主動對懸臂施加額外的驅(qū)動力。作用于懸臂尖端的力可用胡克定律簡單地描述：

F=kcz

(2)

在靜態(tài)模式下，力靈敏度Fmin由懸臂縱向位移z的不確定度zmin決定。在布朗力FB的作用下,zmin=(kBT/kc)1/2，因此[40]：

(3)

其中，kBT為布朗運動熱噪聲的能量(kB為玻爾茲曼常數(shù)，T為實驗室溫度)。通常，原子力顯微鏡在靜態(tài)模式下的力靈敏度Fmin可達10 pN量級，為準確測量生命物質(zhì)的力學性質(zhì)提供了保障。

靜態(tài)模式是原子力顯微鏡最基本的測量模式，通過控制探針以恒定速度v接近和遠離樣品，可以測量得到探針與樣品之間的力-位置曲線、力-時間曲線等，被廣泛應(yīng)用于單分子拉伸[17, 41]以及單細胞和組織的力壓痕、力弛豫等實驗[8, 34-35]。

1.2 動態(tài)模式

與靜態(tài)模式相比，動態(tài)模式具有額外的周期性驅(qū)動力Fext=F0cos(ωt)，使懸臂以驅(qū)動頻率ω作周期性振蕩。通常Fext?FB，式(1)的穩(wěn)態(tài)解為：

z(t)=Acos(ωt+φ)

(4)

式中，A為懸臂尖端的振幅，與驅(qū)動力振幅F0成正比，φ為懸臂末端位移z相對于驅(qū)動力Fext的相位：

(5)

(6)

圖2展示了典型的振幅A和相位φ隨驅(qū)動頻率ω變化的曲線。當驅(qū)動頻率ω為系統(tǒng)的共振頻率ω0=(kc/m)1/2時，振幅A=F0/(ξω0)，相位φ=-90°。

圖2 振幅A和相位φ在共振頻率附近隨驅(qū)動頻率ω的變化

Fig.2 The amplitudeAand phaseφas a function of driving frequencyωnear resonanceω0

不同于靜態(tài)模式的力靈敏度受到布朗運動熱噪聲的限制，在動態(tài)模式下，原子力顯微鏡的力靈敏度可進一步提高。原子力顯微鏡在動態(tài)模式下利用鎖相技術(shù)跟蹤驅(qū)動頻率ω或相位φ，僅檢測驅(qū)動頻率ω附近帶寬為ΔB范圍內(nèi)的信號，從而消除其他頻率的背景噪聲。因此，動態(tài)模式的力靈敏度大小為[42]：

(7)

式中，Q=(ω0m)/ξ為懸臂的品質(zhì)因數(shù)，F(xiàn)min隨Q的增大而減小，從而力靈敏度越高。在空氣中，F(xiàn)min可達0.1 pN量級。

在液體中，動態(tài)模式的定量力學測量具有一定局限性。一方面，由于液體的黏滯系數(shù)ξ相比空氣大兩個數(shù)量級左右，使得懸臂的品質(zhì)因數(shù)Q小兩個數(shù)量級(通常Q<10)，這導致力靈敏度大幅下降；另一方面，懸臂的周期性振動會引發(fā)周圍液體的流動，與壁面產(chǎn)生復雜的相互作用。例如，當探針與生物樣品的距離在微納尺度時，由于受到流體介質(zhì)黏滯力與生物軟表面黏彈力的共同影響，探針與樣品間的液體流動極為復雜(詳見3.4節(jié))[32,36]。因此，在液體中對生物樣品力學性質(zhì)的定量測量，大多數(shù)采用靜態(tài)模式，或者采用特殊類型的原子力顯微鏡探針(如較小尺寸的探針、長針型探針等)，以減小探針在液體中的阻尼[36,44]。

2 原子力顯微鏡生物力學實驗方法

如圖3(a)所示，原子力顯微鏡探針懸臂的長度通常為100～200 μm，末端有一個微米尺度的錐型尖端，尖端的最小曲率為10 nm 量級，以提供納米級的空間分辨率。但對于生物樣品(如活細胞)，一方面，鋒利的尖端容易刺破細胞膜，對細胞造成損傷；另一方面，生物介質(zhì)和細胞表面的生物大分子極易吸附于探針表面，產(chǎn)生極強的黏附性并造成空間分辨率的降低。因此，在使用原子力顯微鏡進行生物力學實驗前，要根據(jù)實驗對象對探針尖端形狀及表面進行適當修飾。另外，原子力顯微鏡的生物力學實驗對生物樣品的制備和實驗條件也有一定的特殊要求，本節(jié)對具體的實驗條件和方法給出建議。

圖3 各種原子力顯微鏡探針[36]

2.1 特殊形狀探針的制備

將一個直徑為微米尺度的球形顆粒粘接于懸臂末端，即為膠體探針(這里“膠體”泛指納米至微米尺度的球形顆粒，與顆粒材質(zhì)無關(guān))，如圖3(b)所示(直徑d約26 μm的玻璃球附著于懸臂末端)。作為一種改良的特殊形狀的探針，膠體探針廣泛應(yīng)用于軟物質(zhì)及生命物質(zhì)的力學性質(zhì)測量[23, 33-45]。與錐形尖端探針相比，膠體探針增大了尖端曲率半徑，減小了作用于細胞表面局部的壓強；增大了探針與細胞的接觸面積，可對接觸面積范圍內(nèi)的細胞力學性質(zhì)的不均勻性進行平均；球形的幾何結(jié)構(gòu)為使用Hertz等力學模型刻畫力壓痕實驗的結(jié)果時提供了便利(詳見3.1節(jié))。

長針型原子力顯微鏡探針為另一種新開發(fā)的特殊形狀的探針[32,36]，其懸臂末端粘接了一根細長的玻璃纖維，直徑d的范圍為0.5～5.0 μm，長度L的范圍為100～500 μm，玻璃纖維末端可加工為針尖狀，尖端半徑R為50～500 nm，如圖3(c)所示(圖中玻璃纖維長180 μm，直徑d約2.5 μm；小圖為針尖放大圖，針尖半徑R～200 nm)。以長針型探針進行原子力顯微鏡實驗時，只需把長針尖端浸入液體，懸臂則處于空氣中。這樣的設(shè)計使得作用于長針尖端的阻尼比完全浸入液體時大為減小。在動態(tài)模式下，系統(tǒng)的品質(zhì)因數(shù)Q約為10～50，提高了在液體中測量的力靈敏度。

以上兩種特殊形狀的探針，通常在實驗室中基于普通商業(yè)探針組裝得到。膠體探針的微球通常選擇表面粗糙度較小的玻璃球，其優(yōu)點是便于清洗和進行化學修飾。組裝探針時，在高倍數(shù)體式顯微鏡下，利用三維微操縱系統(tǒng)，先在懸臂末端點涂一滴直徑10 μm左右的膠水滴，再將微球與膠水滴接觸粘接。如操作時間較長，可使用紫外固化膠水。長針型探針組裝與膠體探針組裝類似。其中，微米尺度的玻璃纖維是以毛細管拉制儀將直徑1 mm的玻璃棒拉制而成，再以煅針儀將其末端加工成針尖狀。為確保實驗時玻璃纖維垂直于液體水平面，要根據(jù)探針懸臂與水平面的角度調(diào)整玻璃纖維與懸臂的角度進行組裝。

2.2 探針表面的化學修飾

在生物力學實驗中，為減弱蛋白質(zhì)等生物大分子對探針表面的黏附，可對探針表面進行適當?shù)幕瘜W修飾，比如在探針表面附著一層Poly(L-Lysine)-graft-Poly(Ethylene Glycol)高分子(PLL-g-PEG)。該分子的PLL端可吸附于玻璃和金屬氧化層表面，暴露在外的PEG端可以極大減弱蛋白質(zhì)對表面的吸附。實驗前，將探針在等離子清洗器中清洗15 min后，浸入0.5 mg/mL的PLL-g-PEG溶液中約2 h，即可完成鍍膜。為確保較好的實驗效果，建議每次實驗前重新鍍膜。

2.3 生物樣品的準備和實驗條件

原子力顯微鏡在進行生物樣品成像和力學測量時，首先要將被測量的樣品“固定”在基底上。以活細胞為例，除了部分表皮細胞可直接牢固地吸附于蓋玻片等基底上，大部分的活細胞對基底的吸附并不牢固。因此，實驗前需要將基底鍍上一層化學或生物膜，如Poly-D-Lysine、Poly-L-Lysine、膠原蛋白、ECL(entactin-collagen IV-laminin)等，再將活細胞栽種于處理后的基底上。

由于生命物質(zhì)對外界環(huán)境(如溫度、酸堿度、培養(yǎng)液成分等)極為敏感，在原子力顯微鏡實驗中，應(yīng)盡量將生物樣品保持于最適宜的生命環(huán)境。例如，大部分哺乳動物的活細胞，應(yīng)在37 ℃、5%二氧化碳濃度、該類細胞的細胞培養(yǎng)液中進行實驗，以確保活細胞的良好生命狀態(tài)。若實驗持續(xù)時間較短，也可選用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替培養(yǎng)液作為介質(zhì)。PBS的優(yōu)點是不含有易吸附于探針表面的蛋白質(zhì)等大分子，缺點是缺乏細胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)，長時間的實驗會使細胞處于饑餓狀態(tài)，進而影響其力學性質(zhì)。

以上不同材質(zhì)的基底和測量條件都會對細胞骨架的形成及其力學性質(zhì)產(chǎn)生影響。因此，生物力學的實驗結(jié)果需指明選用的基底和采用的各種實驗條件，并在相同條件下進行各組生物對照實驗。

3 多尺度生物系統(tǒng)中的力學測量

原子力顯微鏡技術(shù)在生物力學測量中的一大優(yōu)勢是可覆蓋從十納米至百微米尺度的介觀系統(tǒng)，實現(xiàn)從單分子到單細胞的局部與整體，以及組織等不同生命物質(zhì)的力學研究，具有一定的普適性。本節(jié)將以單細胞的力學測量為例，介紹原子力顯微鏡在研究細胞彈性模量中的重要應(yīng)用，進而推廣到對相分離蛋白質(zhì)液滴、生物組織的力學測量，最后介紹一種基于微納尺度流動所研發(fā)的活細胞表面黏彈性成像技術(shù)。

3.1 單細胞的力學測量

利用原子力顯微鏡結(jié)合膠體探針的測量技術(shù)，通過力壓痕實驗測量單細胞的彈性模量E(主要由細胞骨架中的肌動蛋白絲所形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)所決定)，是目前最普遍的單細胞尺度力學實驗方法。2007年，研究者利用該方法發(fā)現(xiàn)癌變細胞的彈性模量E遠小于正常細胞[46]。其后的諸多研究發(fā)現(xiàn)，細胞彈性模量E的大小與其生命活動、健康狀態(tài)密切相關(guān)[1-5]。因此，力學測量提供了一種潛在的單細胞尺度疾病與健康診斷的新方法。

力壓痕實驗的基本方法如圖4(a)所示。在靜態(tài)模式下，膠體探針在細胞上方以恒定速度v向下運動，接觸細胞表面后，繼續(xù)按壓使其發(fā)生形變δ，同時探針感受到細胞的反作用力F(從A至B所示)；當原子力顯微鏡測量到的F達到預設(shè)的最大壓入力FM時，探針反向以恒定速度v撤回(從B至C所示)。

圖4 膠體探針力壓痕實驗

圖4(b)展示了原子力顯微鏡在犬腎細胞(MDCK II)上測得的力壓痕曲線。其中，紅、藍曲線分別為壓入過程和撤回過程中的力F隨壓入深度(細胞形變)δ的變化，可見紅、藍曲線并不完全重合，存在力的遲滯(Hysteresis)現(xiàn)象。

對力壓痕實驗結(jié)果的定量分析，通常采用Hertz模型[47]。當探針尖端為球形時：

(8)

其中，υ為泊松系數(shù)(活細胞通常采用不可壓縮的假設(shè)，υ=0.5)，R=1/(1/R1+1/R2)為系統(tǒng)的有效半徑，R1和R2分別為膠體探針和被測細胞的半徑。如圖4(b)所示，虛線為Hertz模型對按壓曲線的擬合，Hertz模型可以很好地描述膠體探針按壓細胞過程中的力F隨壓入深度δ的變化曲線。通過式(8)的擬合，可以測定單細胞的彈性模量E。通?；罴毎腅在1～100 kPa范圍內(nèi)。

Hertz模型在描述活細胞的力壓痕曲線時具有一定的局限性。首先，Hertz模型的前提假設(shè)為各向同性的純彈性材料，且在應(yīng)變較小的情況下成立；而對活細胞而言，以上假設(shè)通常并不滿足，所測定的E為單細胞表觀的彈性模量。其次，Hertz模型并不能解釋壓入和撤回曲線的力遲滯現(xiàn)象。力遲滯現(xiàn)象的產(chǎn)生，是因為活細胞屬于具有黏彈性的軟物質(zhì)(以聚合物、膠體和許多生命物質(zhì)為代表的軟物質(zhì)，表現(xiàn)出不同于剛性材料的力學特性，兼具液體的黏性和固體的彈性。由于黏彈性的存在，軟物質(zhì)的形變落后于應(yīng)力變化，呈現(xiàn)出力遲滯現(xiàn)象或松弛現(xiàn)象)。對于活細胞，其黏性來源于細胞形變過程中細胞骨架、細胞質(zhì)、生物大分子之間相對運動的能量耗散。最后，由于細胞的黏彈性，使得力壓痕曲線以及通過Hertz模型所測得的彈性模量E具有速度依賴性，即E隨探針按壓速度v的增大而增大，且呈近似指數(shù)的依賴關(guān)系(E～vα)[48]。由此可見，Hertz模型并不能全面描述活細胞的力學性質(zhì)；而其他的接觸力學模型，如JKR模型(Johnson-Kendall-Roberts model)、DMT模型(Derjaguin-Müller-Toporov model)等，雖在Hertz模型的基礎(chǔ)上進一步考慮了探針與細胞之間的黏附性，但仍不適用于描述細胞的黏彈性。從力學角度在實驗和理論兩個方面揭示細胞的本構(gòu)關(guān)系與黏彈特性，仍是當前單細胞力學的核心科學問題。

3.2 液-液相分離液滴的力學測量

液-液相分離與相變本是物理學概念，如油與水的液-液相分離、氣態(tài)水蒸氣-液態(tài)水-固態(tài)冰的相變等。近十年來，生物學家發(fā)現(xiàn)細胞中存在相分離和相變現(xiàn)象[49-50]。在原本相對均一的環(huán)境中，某些蛋白質(zhì)或核酸分子通過多價相互作用(生物大分子間有多個結(jié)合位點)，形成無膜的細胞結(jié)構(gòu)，例如核內(nèi)的核仁、著絲粒、核孔復合物以及胞質(zhì)中的應(yīng)激顆粒、神經(jīng)顆粒等。相分離不僅是生物體內(nèi)一種極為普遍的功能調(diào)控方式，更具有重要的生物學功能，例如介導細胞特定區(qū)域的信號傳導、賦予生物體應(yīng)對脅迫環(huán)境的能力等[35]。相分離所形成的細胞結(jié)構(gòu)通常呈現(xiàn)出液態(tài)或膠體態(tài)的特征，它們的物理性質(zhì)(表面張力、黏度、彈性等)是判斷和區(qū)分相分離的重要依據(jù)。另外，相分離結(jié)構(gòu)的物理性質(zhì)及其隨時間的演化也與其生物功能密切相關(guān)。因此，對相分離液滴力學性質(zhì)的表征至關(guān)重要。

圖5(a)所示為利用膠體探針對液-液相分離所形成的神經(jīng)元突觸后致密區(qū)的蛋白質(zhì)液滴(圖中小圓圈)所進行的力學測量，其力壓痕實驗結(jié)果如圖5(b)所示。圖中，壓入曲線為實線，撤回曲線為虛線；黑色、紅色分別代表由構(gòu)成神經(jīng)元突觸后致密區(qū)的主要6種和2種蛋白質(zhì)組分所重構(gòu)的蛋白質(zhì)液滴的測量結(jié)果；綠色虛線為Hertz模型與壓入曲線的擬合。首先，從壓入和撤回過程的力曲線遲滯可判斷相分離液滴呈現(xiàn)軟物質(zhì)的黏彈性；其次，撤回曲線經(jīng)歷了很長的負值段，表明界面具有極強的黏附性。

圖5 利用膠體探針對液-液相分離所形成的神經(jīng)元突觸后致密區(qū)的蛋白質(zhì)液滴進行的力學測量[35]

Fig.5 Mechanical measurement of the postsynaptic density protein droplets formed by liquid-liquid phase separation using an AFM colloidal probe[35]

實驗發(fā)現(xiàn)相分離液滴的力學性質(zhì)與其內(nèi)部蛋白質(zhì)的構(gòu)成和功能密切相關(guān)。圖5(b)中黑色曲線所代表的6種組分重構(gòu)的蛋白質(zhì)液滴，相比紅色曲線所代表的2種組分重構(gòu)的液滴，其發(fā)生相變的臨界蛋白質(zhì)濃度更低，但彈性模量更大。由Hertz模型測得的彈性模量分別為3.5 kPa(6種組分)、2.5 kPa(2種組分)。這是由于相分離液滴中6種蛋白質(zhì)通過多價相互作用相結(jié)合，一部分形成蛋白質(zhì)支架，另一部分附著于支架上，形成具有生物功能的整體。由于真實突觸中的蛋白質(zhì)種類更多，多價相互作用更強，因此，神經(jīng)元突觸后致密區(qū)的力學性質(zhì)會更接近于凝膠、玻璃化材料。

在實驗中，我們還發(fā)現(xiàn)相分離液滴的老化、隨時間變硬的趨勢[35]，對應(yīng)著人在衰老過程中，一部分與腦疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)或多肽會發(fā)生纖維化。這一力學研究成果將有助于對神經(jīng)突觸的形成及調(diào)節(jié)機制的研究，也將有助于闡明一系列因突觸蛋白編碼基因突變引起的腦疾病的病理機制，最終或可以幫助精神障礙的早期診斷與治療。

3.3 球形上皮囊泡組織的力學測量

由形態(tài)相似、功能相同的多個細胞組成的生命結(jié)構(gòu)即為組織。其中，球形上皮囊泡是構(gòu)成肺、腎臟等器官的一種重要組織，如圖6(a)所示，它由單層細胞構(gòu)成球形的外殼，內(nèi)腔由組織液填充(圖中，藍、紅、綠色分別表示細胞核、F-肌動蛋白、層粘連蛋白，黃色虛線圓表示與基底結(jié)合的區(qū)域)。在壓力驅(qū)動下，球形上皮囊泡會產(chǎn)生較大形變，其力學測量與機理研究對認識肺泡、腎小球等結(jié)構(gòu)的生理功能和工作原理具有重要意義。

圖6(a)所示為通過生物工程手段在體外形成的球形上皮囊泡[34]。圖6(b)為通過原子力顯微鏡結(jié)合膠體探針的測量技術(shù)得到的球形上皮囊泡的力壓痕曲線(圖中虛線為壓入曲線與Hertz模型、球殼模型的擬合)。以Hertz模型擬合按壓過程的力曲線，可以得到該球形囊泡的表觀彈性模量約為0.58 kPa。然而，由于該組織存在內(nèi)腔結(jié)構(gòu)，Hertz模型并不能真實地描述該生物結(jié)構(gòu)的力學性質(zhì)，而應(yīng)采用描述球殼型結(jié)構(gòu)的力學模型，如：

圖6 球形上皮囊泡的熒光與明場圖像以及力壓痕曲線[34]

Fig.6 The fluorescence and bright-flied images and the force-indentation curves of the epithelial cyst[34]

(9)

等式右邊第一項、第二項分別代表球殼彎曲和拉伸對彈性力的貢獻。其中，Es為球殼的彈性模量，h為球殼厚度，Rs為球殼半徑，ε=δ/(2Rs)為球殼的應(yīng)變。通過式(9)擬合得到的彈性模量Es=8.2 kPa，略大于該類上皮細胞單細胞的彈性模量5～7 kPa。

上皮細胞的一大特征是呈現(xiàn)出明顯的極性，即上皮細胞的兩端在結(jié)構(gòu)(如圖6(a)所示)和功能上具有明顯的差別。朝向有腔結(jié)構(gòu)的一面，稱為游離面；與游離面相對的另一面稱為基底面。上皮細胞極性的建立和維持，對其力學性質(zhì)有重要的影響。例如，尚未生長成熟的上皮組織或紊亂的實心囊腫，由于上皮細胞的極性無法建立，其彈性模量大幅度減小[34]。

與單細胞和相分離蛋白質(zhì)液滴類似，球形上皮囊泡的力曲線也呈現(xiàn)出遲滯現(xiàn)象。由此可見，對于不同尺度的生命物質(zhì)，從亞細胞結(jié)構(gòu)到單細胞，再到組織，軟物質(zhì)的黏彈性是生命物質(zhì)中最具代表性的力學特性。對傳統(tǒng)軟物質(zhì)力學性質(zhì)的研究是揭示生命軟物質(zhì)力學性質(zhì)的基礎(chǔ)。

3.4 細胞表面的黏彈性成像

以上實驗結(jié)果，皆系利用原子力顯微鏡結(jié)合膠體探針的測量技術(shù)，基于材料各向同性的力學假設(shè)，將研究對象整體的力學性質(zhì)進行表征。然而，許多生命物質(zhì)存在力學的各向異性以及微觀的力學不均一性，因此亟需一種力學手段，在光學成像的基礎(chǔ)上，對活細胞等生命物質(zhì)實現(xiàn)更小尺度的力學成像。

利用原子力顯微鏡結(jié)合長針型探針的測量技術(shù)(下文簡稱“長針式原子力顯微鏡”)，可以在掃描單細胞形貌的同時，實現(xiàn)細胞表面黏彈性分布等多個物理量的測量[36]。如圖7(a)所示，在掃描細胞形貌的過程中，長針式探針在靠近細胞表面處作周期性振蕩，在此驅(qū)動下，流體周期性地被排出和回流至探針與細胞表面的間隙之中。圖7(a)中的放大圖顯示了探針尖端和細胞表面間隙區(qū)域的液體流動的幾何結(jié)構(gòu)。通過該微納尺度的流動和流固耦合效應(yīng)，可以定量測量下方固壁(即細胞)的力學性質(zhì)。由水的潤滑方程和表述軟物質(zhì)的線性黏彈性理論[51]，可以解出力的反饋函數(shù)K*(D)=Fh/A隨探針與細胞表面距離D的變化關(guān)系(Fh為作用于探針尖端的水動力，A為探針驅(qū)動的振幅)。由于細胞具有黏彈性，K*(D)通常為復數(shù)，實部K′(D)代表彈性響應(yīng)，虛部K″(D)代表黏性響應(yīng)。

圖7 在活細胞上測量力反饋函數(shù)K*(D)[36]

如圖7(b)所示，在長針型探針靠近細胞表面的過程中，可測得活細胞表面某位置的K′(D)和K″(D)。圖中，紅色數(shù)據(jù)為調(diào)頻模式下的測量結(jié)果，紅色圓圈代表K′(D)，紅色三角形代表K″(D)；綠色虛線表示適用于剛性基底雷諾阻尼的變化規(guī)律，黑色虛線表示特征轉(zhuǎn)變距離Dc=100 nm，黑色實線為數(shù)值計算結(jié)果與實驗數(shù)據(jù)的擬合。

由圖7(b)可見，在此微納尺度流動體系中，黏性響應(yīng)K″(D)占主導地位。當D大于某一特征尺度Dc時，K″(D)服從雷諾阻尼的變化關(guān)系K″(D)=6πη0ωR/D，其中η0為液體黏度，ω為驅(qū)動頻率，R為探針尖端半徑[52]；當D

由于細胞并不是理想的各向均一性材料，在其不同位置進行測量時，力的反饋K*(D)和黏彈性信息各異。為此，我們設(shè)計了在探針掃描細胞形貌的同時對每個位置的力學性質(zhì)進行測量的力學成像方法，如圖8所示。在懸臂的兩個共振頻率同時驅(qū)動探針運動，其中，在第一個共振頻率作調(diào)幅的輕敲模式，掃描每一點的高度，進而得到活細胞的形貌、厚度和體積信息；在第二個共振頻率作調(diào)頻的共振模式，通過前述方法，測量每一點的黏彈性信息，由此可以實現(xiàn)對細胞表面的形貌、黏彈性等多個物理量的同時測量。

圖9(a)和(c)為采用長針式原子力顯微鏡測量得到的一個HeLa細胞的形貌與彈性分布圖。如圖9(c)所示，單細胞表面的彈性模量數(shù)值在較大范圍內(nèi)(20～80 kPa)連續(xù)變化，且呈現(xiàn)出不均一的分布。前述的水動力學方法在細胞表層的力學探測深度為幾百納米，該區(qū)域的彈性模量主要由靠近細胞膜內(nèi)側(cè)的肌動蛋白層所主導。因此，相對于力壓痕實驗測量得到的單細胞表觀的彈性模量E，細胞表面的彈性模量約大一個數(shù)量級。

實驗發(fā)現(xiàn)，細胞表層彈性模量的分布與細胞的狀態(tài)密切相關(guān)。例如，當細胞由分裂間期(圖9(a)和(c))進入有絲分裂期時(圖9(b)和(d))，細胞形態(tài)由平鋪狀變?yōu)榻魄驙?，同時彈性模量由不均一狀態(tài)變?yōu)榫粻顟B(tài)。力學性質(zhì)對于處于分裂期的母細胞至關(guān)重要，轉(zhuǎn)變?yōu)榫粻顟B(tài)，有利于在分裂過程中將內(nèi)部染色體和細胞質(zhì)等組件均勻分裂至兩個子細胞中去。此外，實驗還發(fā)現(xiàn)：處于遷移過程中的細胞的彈性模量呈極性分布，彈性模量在朝向遷移方向的前部遠大于后部[36]。

圖8 原子力顯微鏡通過雙頻調(diào)制同時進行形貌掃描與黏彈性測量的控制流程圖[36]

圖9 原子力顯微鏡測得的活細胞三維形貌和彈性圖像[36]

4 結(jié)論與展望

本文介紹了原子力顯微鏡技術(shù)的力學測量原理及其在生物力學研究中的實驗方法，綜述了該技術(shù)在從亞細胞結(jié)構(gòu)到組織的多尺度力學研究中的具體應(yīng)用，強調(diào)了液體的流動和生命物質(zhì)的黏彈性對測量結(jié)果的影響。作為一個較為通用且有效的微納尺度力學實驗工具，原子力顯微鏡技術(shù)已被越來越多地應(yīng)用于生物力學領(lǐng)域，并在此交叉學科的實驗研究中發(fā)揮著重要作用。

在創(chuàng)新實驗技術(shù)的推動下，研究者對細胞整體力學性質(zhì)和局部力學行為的認識愈來愈清楚。但由于生命系統(tǒng)的復雜性，對生命物質(zhì)力學性質(zhì)的研究仍處于探索階段，仍有許多力學問題亟需解決。

首先，由Hertz等純彈性力學模型測得的彈性模量E依賴于測量速度等實驗條件，無法完善地描述具有黏彈性的生命物質(zhì)，亟待發(fā)展更為完善的接觸力學模型以揭示生命物質(zhì)的本構(gòu)關(guān)系。

其次，在不同生命狀態(tài)、細胞癌變遷移的過程中，可能涉及多個物理量的動態(tài)轉(zhuǎn)變。但與彈性模量E相比，目前對生命物質(zhì)的其他力學性質(zhì)(如表面張力系數(shù)、黏度系數(shù)等)的研究仍然較少。

最后，雖然原子力顯微鏡在生物力學的體外實驗(invitro)中應(yīng)用廣泛，但在體內(nèi)實驗(invivo)中的應(yīng)用存在極大的困難。

綜上，生物力學領(lǐng)域亟需新實驗技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，通過多種力學測試方法的對比研究和多個物理量的同時測量，幫助跨學科的研究者更為全面地認識和了解復雜生命物質(zhì)的力學性質(zhì)，進一步探究力學性質(zhì)的轉(zhuǎn)變與人類重大疾病的關(guān)聯(lián)，挖掘力學檢測在醫(yī)藥應(yīng)用中的潛在價值。