正交設(shè)計法優(yōu)選美白復(fù)方中藥提取工藝及體外抗氧化活性研究

錢春喜 齊祥秋 孫玉娣 于晨慶 王清華 張春平 段靜雨

徐州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院/江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點實驗室, 江蘇 徐州 221004

中國女性對美白的追求歷史悠久，美白類護膚品已成為功效性護膚品的重要組成部分[1]。傳統(tǒng)的人工合成小分子化合物如曲酸、煙酰胺、對苯二酚等雖具抗氧化和美白功效，但使用過程中常出現(xiàn)過敏、不耐受、刺激等諸多問題[2]，而從天然植物資源中提取美白活性成分更顯綠色安全，已成為護膚品研發(fā)領(lǐng)域的熱點。美白機制的核心是抑制皮膚黑色素的生成，其中既催化羥化反應(yīng)又參與氧化反應(yīng)的酪氨酸酶，是黑色素形成過程中的限速酶[3]。因此，可通過抑制酪氨酸酶活性和清除自由基抗氧化的方式來減少黑色素形成，同時根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論，選擇具有行氣活血的中藥，通過紓解郁結(jié)、氣血互補、促進代謝，亦可減少黑色素生成獲得美白功效[4]?，F(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，甘草、桑白皮、懷山藥、白芍和蘆薈具有良好的酪氨酸酶抑制活性和自由基清除作用[5-8]，本研究將上述5種中藥組成復(fù)方，采用正交設(shè)計法，以酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率作為美白活性評價指標，篩選最佳提取工藝，為新型中藥美白妝品的開發(fā)提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 UV752紫外分光光度計(上海精科分析儀器廠)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；HWS24型水浴鍋(西安禾普生物科技有限公司)；電子天平(上海精科分析儀器廠)。

1.2 試劑 0.1 mol/L鹽酸(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；無水乙醇(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；磷酸氫二鈉(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；磷酸二氫鈉(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；DPPH(1,1-Dipheyl-2-picrylhydrazyl radicle，1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基)(日本和光純藥工業(yè)株式會社，批號：ALE1299)；1380 U/mg酪氨酸酶(25 KU)(美國Worthington試劑公司，批號：E608BD0304)；L-多巴胺(上海伊卡生物技術(shù)有限公司，批號：E118BA0025)；甘草(批號：020116296)、桑白皮(批號：020116126)、懷山藥(批號：020116324和白芍(批號：020116193)均為安徽尚德中藥飲片有限公司生產(chǎn)，蘆薈(批號：020114443，廠家：安徽孟氏中藥飲片有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 美白復(fù)方中藥的提取 稱取甘草5 g，桑白皮5 g，白芍5 g，山藥5 g，蘆薈提取物1 g，備用。依據(jù)單因素實驗原理，選取乙醇體積分數(shù)、料液比、提取次數(shù)和提取時間四個因素，在此基礎(chǔ)上開展正交設(shè)計實驗L9(34)。采用加熱回流提取，提取液蒸發(fā)濃縮至15 mL，用無水乙醇稀釋濃縮液制得供試藥液21 mL(約相當于原生藥1 g/mL)，備用。

2.2 美白活性評價

2.2.1 酪氨酸酶抑制率的測定

2.2.1.1 溶液的配制 ①磷酸鹽緩沖液(PBS)的配制 準確稱取磷酸氫二鈉7.16 g和磷酸二氫鈉3.12 g，加去離子水充分溶解，分別轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中定容配制成0.2 mol/L的溶液，以51∶49的比例混合均勻，pH調(diào)至6.8，即得。

②酪氨酸酶溶液的配制 精密稱取一定量的酪氨酸酶(1380 U/mg)，用PBS溶解配成200 U/mg的酶液，-20 ℃保存，用前于4 ℃解凍。

③多巴溶液的配制 精密稱取L-多巴胺0.15 g，加0.1 moL/L的鹽酸溶液預(yù)溶，待完全溶解，加PBS 100 mL稀釋配制1.5 g/L多巴溶液，4 ℃避光保存。

④樣品溶液的配制 用PBS將供試藥液稀釋，使反應(yīng)體系中藥液的終濃度為1 mg/mL。

2.2.1.2 測定方法 參考文獻[9]按照表1，在各試管中分別加入PBS、樣品溶液和酪氨酸酶溶液，混合均勻，于恒溫水浴(37℃)反應(yīng)10 min，分別迅速加入多巴溶液1mL，充分混勻，水浴反應(yīng)5 min，取出后立即于475 nm處測定各反應(yīng)液的吸光度AC1、AC2、AT1、AT2。平行試驗3次，按公式(1)計算供試藥液的酪氨酸酶抑制率。

酪氨酸酶抑制率=(1-(AT1-AT2)/(AC1-AC2))×100%

(1)

2.2.2 DPPH自由基清除率的測定

2.2.2.1 溶液的配制 ①DPPH溶液的配制 精密稱取DPPH 0.0197 g，加無水乙醇定容至50 mL作為儲備液，4 ℃避光保存。精密移取儲備液10 mL，無水乙醇稀釋至100 mL，得100 μmol/L的DPPH溶液，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

②樣品溶液的配制 精密量取供試藥液0.5 mL，無水乙醇稀釋至50 mL，得樣品溶液(相當于原生藥濃度10 mg/mL)。

2.2.2.2 測定方法 參考文獻[10]按照表2，在各試管中加入對應(yīng)溶液，混合均勻，避光反應(yīng)30 min，于517 nm處分別測定吸光度A0、A1、A2。平行試驗3次，按公式(2)計算供試藥液DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(2)

2.3 單因素試驗考察美白活性中藥的提取工藝 選取乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間和提取次數(shù)4個因素，各因素設(shè)置 4個不同水平，研究各因素最佳范圍，優(yōu)化提取工藝。根據(jù)文獻[11]，綜合酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率，設(shè)置權(quán)重為7∶3定義美白度，作為評價優(yōu)化美白中藥復(fù)方提取工藝的指標。美白度綜合評分按公式(3)計算。

美白度綜合評分=酪氨酸酶抑制率× 0.7+DPPH自由基清除率×0.3

(3)

2.3.1 乙醇體積分數(shù)對提取物美白功效的影響 設(shè)置乙醇體積分數(shù)為40 %、60 %、80 %和95 % ，分別回流提取1次，每次1 h，料液比1∶7，測定酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率，美白度綜合評分分別為56.69%、57.59%、58.02%和69.89%，表明95%乙醇提取美白活性最佳。

2.3.2 料液比對提取物美白功效的影響 設(shè)置料液比為1∶6、1∶7、1∶8 和1∶10，用95%乙醇分別回流提取1次，每次1 h，測定酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率，美白度綜合評分分別為66.04%、65.57%、48.75%和64.18%，表明料液比1∶6提取美白活性最佳。

2.3.3 提取次數(shù)對提取物美白功效的影響 設(shè)置提取次數(shù)為1、2、3和4，用95%乙醇分別回流提取1 h，料液比1∶6，測定酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率，美白度綜合評分分別為 67.95%、54.66%、48.9%和48.24%，表明提取1次美白活性最佳。

2.3.4 提取時間對提取物美白功效的影響 設(shè)置提取時間為1、1.5、2和3 h ，用95%乙醇分別回流提取1 次，料液比1∶6，測定酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率，美白度綜合評分分別為54.99 %、43.51 %、59.95 %和57.03 %,表明提取2 h 美白活性最佳。

2.4 正交試驗 以單因素試驗為基礎(chǔ)，對乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間及提取次數(shù)進行L9(34)正交試驗。分別按下表3進行試驗，結(jié)果及極差分析見表4，方差分析見表5。

表3 因素水平

表4 L9(34)正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表5 方差分析

由表4的極差結(jié)果可知，各因素對提取物美白活性影響順序為A(乙醇體積分數(shù))>B(料液比)>C(提取時間)>D(提取次數(shù))。依據(jù)試驗結(jié)果，美白組合物最佳提取工藝為 A2B2C2D1，即乙醇體積分數(shù)為 80%，料液比1∶7，提取2 h，提取 1次。按上述提取工藝進行3批藥材的驗證試驗，提取物美白度綜合評分分別為84.34%、83.88%、84.76%，RSD為0.52%，證明本提取工藝穩(wěn)定可靠，且所得提取物美白活性較高。

3 討論

本研究篩選出5種具有優(yōu)良美白活性的中藥，即甘草中有效成分甘草黃酮具有抑制酪氨酸酶的活性、抑制多巴色素互變異構(gòu)酶的活性及阻止吲哚-5、6-醌的聚合，可有效抑制黑色素生成；桑白皮提取物具有顯著的清除超氧陰離子自由基和OH自由基的功效，減少黑色素形成的內(nèi)在因素，懷山藥為酪氨酸酶抑制劑，與甘草協(xié)同抑制酪氨酸酶活性，增強美白功效；蘆薈可吸收紫外線，是一種優(yōu)良的天然防曬劑，減弱黑色素形成的外在條件；白芍具有促進皮膚血液循環(huán)和活血養(yǎng)顏的功效[5-8]；故將上述中藥配伍使用，作用于黑色素形成的不同環(huán)節(jié)，協(xié)同增效，以實現(xiàn)全方位美白的護膚理念。

本研究以酪氨酸酶抑制率和DPPH 自由基清除率作為指標評價復(fù)方中藥的美白活性。因美白提取物可抑制酪氨酸酶活性導(dǎo)致其催化反應(yīng)的有色產(chǎn)物多巴醌生成減少，于475 nm 處測量吸光度間接反映美白提取物對酪氨酸酶的抑制活性[12]。當提取物中抗氧化成分加至DPPH 自由基溶液，其孤對電子被配對，深紫色的DPPH自由基被還原成黃色DPPH-H非自由基形式，于517 nm 處測定吸光度間接反映提取物抗氧化能力[13]。此法測定時間短、操作簡便、適于對美白活性成分的大范圍初篩。

4 結(jié)論

合理復(fù)配篩選出的5種中草藥，在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用正交設(shè)計，以酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率為綜合評價指標，優(yōu)化美白復(fù)方中藥醇提工藝為乙醇體積分數(shù) 80 %，料液比1∶7 ，提取2 h，提取 1次，以此工藝制得提取物美白度平均84.33%。本研究將抑制黑色素形成和清除自由基抗氧化等途徑有機結(jié)合，充分貫徹中藥多成分、多靶點、多機制的協(xié)同作用理念指導(dǎo)開發(fā)中藥美白妝品，為中藥資源在化妝品領(lǐng)域的研發(fā)提供參考。