風(fēng)干腸加工和貯藏過程中蛋白質(zhì)的降解規(guī)律

牛樹彬　田婧　周慧敏　朱子冬　周桓宇　閆歡　張順亮

摘 要：以總氮、非蛋白氮、氨基酸態(tài)氮、揮發(fā)性鹽基氮、游離氨基酸以及不同種類蛋白質(zhì)（肌漿蛋白、肌原纖維蛋白、堿溶蛋白和堿不溶蛋白）為指標(biāo)，分析研究風(fēng)干腸加工和貯藏過程中蛋白質(zhì)的降解規(guī)律。結(jié)果表明：風(fēng)干腸加工和貯藏過程中總氮含量沒有顯著變化;非蛋白氮含量持續(xù)升高，從原料肉的469.4 mg/100 g增加到成品腸的786.4 mg/100 g，貯藏240 d后增加至1 256.1 mg/100 g;多肽氮和氨基酸態(tài)氮含量在加工和貯藏過程中均持續(xù)增加，揮發(fā)性鹽基氮含量在風(fēng)干過程中沒有顯著變化，在貯藏180 d后迅速增加;大部分游離氨基酸含量經(jīng)過加工和貯藏均有所提高，只有半胱氨酸含量明顯降低;在加工過程中，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量均因降解而減少，基質(zhì)蛋白含量明顯增加;在貯藏過程中，肌漿蛋白含量持續(xù)降低，肌原纖維蛋白含量在貯藏前180 d無明顯變化，貯藏至240 d明顯減少，基質(zhì)蛋白含量沒有顯著變化。

關(guān)鍵詞：風(fēng)干腸;加工;貯藏;蛋白質(zhì)組分;動態(tài)變化;降解規(guī)律

Pattern of Proteolysis in Air-Dried Sausages during Processing and Storage

NIU Shubin1， TIAN Jing1， ZHOU Huimin2， ZHU Zidong1， ZHOU Huanyu1， YAN Huan1， ZHANG Shunliang2，*

（1.The Experimental Teaching Center of Traditional Chinese Medicine and Biotechnology， Beijing City University， Beijing 100094， China;

2.Beijing Key Laboratory of Meat Processing Technology， China Meat Research Center， Beijing 100068， China）

Abstract： The pattern of proteolysis in air-dried sausages during processing and storage was analyzed by the detection of total nitrogen （TN）， non-protein nitrogen （NPN）， amino acid nitrogen （AAN）， total volatile basic nitrogen （TVB-N）， free amino acids （FAA）， and various proteins （sarcoplasmin， myofibrillar protein， alkali-soluble protein and alkali-insoluble protein）. The results showed that the TN content did not change significantly during processing and storage. The NPN content increased from 469.4 mg/100 g in raw meat to 786.4 mg/100 g in sausages， and then to 1 256.1 mg/100 g after 240 days of storage. The contents of peptide nitrogen and AAN continued to increase during processing and storage. The content of TVB-N did not change significantly during the air-drying process， but increased rapidly after 180 days of storage. The contents of most of the FAA in raw meat increased after being processed into sausages and gradually increased during storage， while only cysteine content reduced significantly. During processing， both the contents of sarcoplasmic and myofibrillar proteins decreased due to degradation， while the content of matrix protein significantly rose. During the storage process， the content of sarcoplasmic protein continued to decrease， while the content of myofibrillar proteins showed no significant change in the first 180 days and decreased significantly on day 240， and the content of matrix proteins showed no significant change over the entire storage period.

Keywords： air-dried sausages; processing; storage; protein components; dynamic change; degradation pattern

（1）

1.3.3 蛋白質(zhì)組分的分離

參考孫為正[13]的方法。按照1.3.1節(jié)所述取樣方法稱取樣品5 g，加入50 mL溶液A（含15.6 mmol/L Na2HPO4、3.5 mmol/L KH2PO4，pH 7.5），用勻漿機(jī)10 000 r/min勻漿1 min，勻漿液在冷凍離心機(jī)中離心（5 000×g、4 ℃、15 min），此提取過程重復(fù)操作2 次。上清液處理：加入50 g/100 mL三氯乙酸使上清液三氯乙酸質(zhì)量濃度達(dá)到10 g/100 mL，使用冷凍離心機(jī)5 000×g、4 ℃離心15 min，上清液部分為非蛋白氮，沉淀部分為肌漿蛋白。沉淀部分加入10 倍體積溶液B（含0.45 mol/L KCl、15.6 mmol/L Na2HPO4、3.5 mmol/L

KH2PO4，pH 7.5），于勻漿機(jī)中12 000 r/min勻漿，勻漿液在5 000×g、4 ℃條件下離心15 min，重復(fù)提取過程2 次，合并上清液得鹽溶部分，即肌原纖維蛋白，沉淀部分為總基質(zhì)蛋白?？偦|(zhì)蛋白再用10 倍體積0.1 mol/L NaOH連續(xù)攪拌提取8 h，5 000×g、4 ℃離心15 min，上清液為堿溶蛋白，沉淀為堿不溶蛋白。

1.3.4 蛋白質(zhì)組分含量測定

采用凱氏定氮法，參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》并略作修改。

1.3.5 非蛋白氮含量測定

采用凱氏定氮法，按照1.3.1節(jié)所述方法準(zhǔn)確稱取樣品2 g，加入40 mL 10 g/100 mL三氯乙酸，搖床振蕩30 min，過濾并用少量10 g/100 mL三氯乙酸洗滌沉淀。收集濾液后用10 g/100 mL三氯乙酸定容到100 mL，取20 mL進(jìn)行消化、定氮。同時進(jìn)行不加樣品的空白對照實驗。

1.3.6 揮發(fā)性鹽基氮含量測定

采用自動凱氏定氮儀法，按照1.3.1節(jié)取樣方法稱取樣品10 g，具體參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》進(jìn)行測定。

1.3.7 氨基酸態(tài)氮含量測定

采用酸度計法，按照1.3.1節(jié)取樣方法稱取樣品5 g，具體參照GB 5009.235—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》進(jìn)行測定。

1.3.8 多肽氮含量測定

多肽的提取參照胡亞亞[14]的方法。取樣品25 g，絞碎后加入100 mL pH 7.0磷酸緩沖液，冰浴勻漿4 次（22 000 r/min，每次10 s）;勻漿液于4 ℃條件下靜置2 h后離心（4 ℃、12 000×g、20 min），取上清液加入3 倍體積分?jǐn)?shù)40%乙醇，放置12 h后再次離心（4 ℃、12 000×g、20 min），所得上清液用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至pH 7.0;上清液經(jīng)冷凍干燥后置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。多肽含量測定參考方細(xì)娟[15]的方法。

1.3.9 游離氨基酸含量測定

參考張順亮等[16]的方法，按照1.3.1節(jié)取樣方法準(zhǔn)確稱取樣品5 g，加入去離子水40 mL，靜置30 min后，加入10 g/100 mL磺基水楊酸混合均勻，于4 ℃條件下放置17 h，用0.2 μm微孔濾膜過濾，采用全自動氨基酸分析儀測定，主要參數(shù)：陽離子交換樹脂（4.6 mm×60 mm）;自帶配套緩沖液;流速

0.4 mL/min;加熱溫度135 ℃;等光程凹面衍射光柵分光光度計檢測，檢測波長為440 nm和570 nm;EZChrom Elite for Hitachi AAA控制。具體參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》。

1.3.10 蛋白質(zhì)水解指數(shù)計算

非蛋白氮含量占總氮含量的比例即為蛋白質(zhì)水解指數(shù)，按式（2）計算。

（2）

1.3.11 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）

采用12%分離膠、6%濃縮膠。取樣品40 μL與10 μL 5×Loading Buffer混合后煮沸10 min，上樣量20 μL，電泳條件為30 mA恒流。電泳結(jié)束后采用考馬斯亮藍(lán)染色1 h，去離子水脫色1 h，重復(fù)脫色3 次。采用熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

稱取的肉質(zhì)量按1.3.2節(jié)公式換算成干基質(zhì)量。所有實驗平行測定3 次，測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 22軟件Duncans檢驗進(jìn)行組間數(shù)據(jù)的差異顯著性分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 風(fēng)干腸加工和貯藏過程中非蛋白氮的變化

2.1.1 非蛋白氮含量變化

總氮含量是風(fēng)干腸中所含全部氮的含量，包括非蛋白氮和蛋白氮，蛋白質(zhì)水解指數(shù)是非蛋白氮含量占總氮含量的比例，可以反映風(fēng)干腸加工和貯藏過程中蛋白質(zhì)降解的總體趨勢。

由表1可知，在風(fēng)干腸的加工過程中，總氮含量（以干基計）略有波動，但變化不顯著，即加工過程對總氮含量影響不大。非蛋白氮含量從原料肉中的469.4 mg/100 g增加到成品風(fēng)干腸中的786.4 mg/100 g，蛋白質(zhì)水解指數(shù)由8.44%增加到14.52%，整體呈上升趨勢，這主要是由蛋白質(zhì)降解造成的，與烘烤法和日曬法生產(chǎn)的廣式臘腸變化規(guī)律均相似[12]。

由表2可知，采用真空包裝、25 ℃貯藏的風(fēng)干腸貯藏過程中非蛋白氮含量依然持續(xù)升高，從成品腸的786.4 mg/100 g增加到貯藏240 d的1 256.1 mg/100 g，蛋白質(zhì)降解指數(shù)從14.52%增加到22.97%。由于真空包裝能夠有效抑制好氧微生物的生長，風(fēng)干腸中蛋白質(zhì)的降解可能主要是由肌肉組織中的組織蛋白酶、二肽酶和氨肽酶等酶的作用引起的[13]。國外研究表明，干腌火腿和干腌香腸成熟過程中，在組織蛋白酶、鈣蛋白酶和氨基態(tài)酶等酶的作用下非蛋白氮含量會持續(xù)升高[17-18]。趙改名[19]研究表明，金華火腿中的蛋白質(zhì)也會在組織蛋白酶、二肽酶和氨肽酶的作用下持續(xù)降解。另外，真空包裝下厭氧微生物的滋生也可能是貯藏期非蛋白氮含量升高的原因[12]。

2.1.2 非蛋白氮組成變化

腌臘肉制品中的非蛋白氮包括多肽氮、氨基酸態(tài)氮、揮發(fā)性鹽基氮、核酸氮和其他含氮化合物等，其中最主要的是多肽氮、氨基酸態(tài)氮和揮發(fā)性鹽基氮。對金華火腿的研究表明，這3 種形式的氮占金華火腿非蛋白氮的65%左右[20]。蛋白質(zhì)首先由組織蛋白酶、鈣蛋白酶和二肽酶降解生成小分子肽，再由氨基態(tài)酶降解生成游離氨基酸，大量氨基酸再通過Strecker降解和美拉德反應(yīng)形成酮、醛、酸、醇、酯、吡嗪和含硫化合物等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[21]。因此，多肽氮和氨基酸態(tài)氮含量在蛋白質(zhì)降解過程中處于動態(tài)變化中。

由表3可知，風(fēng)干腸加工過程中多肽氮含量持續(xù)升高，從原料肉的68.8 mg/100 g增加到成品腸的256.5 mg/100 g，這是由內(nèi)源組織蛋白酶活躍引起的，或者是由于好氧微生物滋生產(chǎn)生的外源肽酶的作用[22]。氨基酸態(tài)氮含量在風(fēng)干腸加工過程中也呈升高趨勢，但是在風(fēng)干3 d后增加不顯著，一方面是由于氨基酸底物增多導(dǎo)致Strecker降解和美拉德反應(yīng)加速，另一方面可能是由于風(fēng)干腸風(fēng)干后缺水造成微生物活躍程度下降所致。揮發(fā)性鹽基氮含量不但可以用來評價肉制品風(fēng)味，也是衡量肉制品腐敗變質(zhì)的指標(biāo)，不同類型肉制品中其含量也有差異[13，23]。風(fēng)干腸中揮發(fā)性鹽基氮含量在加工初期的腌制和烘干階段明顯提高，進(jìn)入風(fēng)干期后無明顯變化，成品腸中含量為15.9 mg/100 g，與廣式臘腸中揮發(fā)性鹽基氮含量相似[12]，與發(fā)酵火腿相比則相差較大[22]。

由表4可知，風(fēng)干腸貯藏過程中多肽氮含量在貯藏初期增長較為緩慢，貯藏60 d和120 d差異不顯著，但貯藏后期顯著增加，這是由于在貯藏初期，真空包裝抑制了好氧微生物的生長，從而阻止了蛋白質(zhì)降解。貯藏后期厭氧微生物生長加速，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的快速降解。氨基酸態(tài)氮和揮發(fā)性鹽基氮含量在整個貯藏過程中均持續(xù)升高，氨基酸態(tài)氮含量升高速率比較穩(wěn)定，揮發(fā)性鹽基氮含量升高速率逐漸加快，貯藏初期（60 d）揮發(fā)性鹽基氮含量提高6.87 mg/100 g，貯藏120 d時比貯藏60 d時又提高5.8 mg/100 g，貯藏180 d時為35.69 mg/100 g，與廣式臘腸研究結(jié)果相似[12]，貯藏240 d時提高到47.29 mg/100 g。

2.1.3 游離氨基酸組成變化

游離氨基酸是決定腌臘肉制品風(fēng)味的重要組分，不同產(chǎn)品中呈味氨基酸含量不同[13，24]。由表5可知，風(fēng)干腸加工過程中游離氨基酸含量整體呈上升趨勢，從原料肉的415.28 mg/100 g增加到成品腸的911.44 mg/100 g。除天冬氨酸、半胱氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸外，其他氨基酸含量均大幅度提高，特別是其中對腌臘肉制品風(fēng)味產(chǎn)生重要影響的谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸和甲硫氨酸含量增加極為顯著[25]，6 種氨基酸總量提高2.4 倍，這與廣式臘腸中的變化相似[12]。風(fēng)干腸加工過程中天冬氨酸和和羥脯氨酸含量無明顯變化，半胱氨酸和脯氨酸含量呈先上升后下降的趨勢，尤其是半胱氨酸，在風(fēng)干3 d時含量為58.89 mg/100 g，但在風(fēng)干6 d真空包裝后驟然降至0.03 mg/100 g。

由表6可知，風(fēng)干腸貯藏過程中游離氨基酸含量依然呈顯著上升趨勢。鮮味氨基酸天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量分別提高11.4、2.9、1.6、2.3 倍，其他對腌臘肉制品風(fēng)味影響較大的氨基酸，除酪氨酸含量降低以外，亮氨酸、賴氨酸和甲硫氨酸含量分別提高2.06、2.34、1.47 倍。

2.2 風(fēng)干腸加工和貯藏過程中蛋白氮的變化

2.2.1 蛋白質(zhì)組成變化

由表7可知，基質(zhì)蛋白是風(fēng)干腸中蛋白的主要成分，在加工過程中含量整體呈上升趨勢，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量在風(fēng)干3 d前均呈降低趨勢，造成這一現(xiàn)象的主要原因有2 個：一是加熱導(dǎo)致肌漿蛋白和肌原纖維蛋白部分變性，從而轉(zhuǎn)化成基質(zhì)蛋白;二是肌原纖維蛋白和肌漿蛋白降解產(chǎn)生氨基酸和肽。這一結(jié)果與廣式臘腸[14]和宣恩火腿[23]的研究結(jié)果一致。但是風(fēng)干3 d后到成品腸的制作工程中3 種蛋白含量無顯著變化，一方面是由于后續(xù)的加工過程中沒有加熱過程，另一方面是由于風(fēng)干后水分含量降低，導(dǎo)致蛋白降解的微生物活性和酶活性降低[26]。

由表8可知，風(fēng)干腸貯藏過程中，肌漿蛋白含量呈下降趨勢，但下降速率較慢，貯藏120 d時才觀察到顯著降低。貯藏至240 d時，風(fēng)干腸肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量均明顯下降，這是由于蛋白酶的持續(xù)作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解的蓄積所致。在貯藏240 d內(nèi)，基質(zhì)蛋白含量的變化不顯著。

2.2.2 蛋白質(zhì)電泳分析

肌漿蛋白主要由磷酸化酶、肌酸激酶、磷酸激酶或磷酸丙糖異構(gòu)酶等構(gòu)成[26]。由圖1A可知：風(fēng)干腸加工過程中肌漿蛋白中大分子質(zhì)量蛋白（97.2 kDa）含量呈遞減趨勢，小分子質(zhì)量蛋白（60 kDa左右）含量則有所增加;貯藏60 d時，分子質(zhì)量66.4 kDa以上的蛋白幾乎全部降解，貯藏到240 d時分子質(zhì)量60 kDa左右的蛋白發(fā)生降解，分子質(zhì)量44 kDa左右的蛋白增加，說明在加工和貯藏階段引起肌漿蛋白降解的蛋白酶不同。肌原纖維蛋白主要包括肌球蛋白、肌動蛋白和肌鈣蛋白等[27]。由圖1B可知，在風(fēng)干腸加工過程中肌原纖維蛋白含量無明顯變化。在貯藏階段，分子質(zhì)量66.4 kDa以上的大分子蛋白大量降解，分子質(zhì)量66.4 kDa以下的蛋白無明顯變化。堿溶蛋白主要由肌漿蛋白和肌原纖維蛋白轉(zhuǎn)化而來。由圖1C可知，在風(fēng)干腸加工進(jìn)程中堿溶蛋白含量增加，在貯藏期堿溶蛋白的變化不明顯，但是分子質(zhì)量97.2 kDa以上的蛋白明顯降解，與肌漿蛋白和肌原纖維蛋白變化相似。堿不溶蛋白主要包括膠原蛋白、彈性蛋白和網(wǎng)狀蛋白。由圖1D可知，堿不溶蛋白主要是大分子質(zhì)量蛋白，在整個加工和貯藏過程中變化都不大。

3 結(jié) 論

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DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2014.07.039.

收稿日期：2020-02-03

基金項目：“十三五”國家重點(diǎn)研發(fā)計劃重點(diǎn)專項（2017YFD0400105）

第一作者簡介：牛樹彬（1982—）（ORCID： 0000-0003-1694-2513），男，副教授，博士，研究方向為食品加工與安全。

E-mail： niushubin0704@163.com

通信作者簡介：張順亮（1985—）（ORCID： 0000-0001-5810-8653），男，高級工程師，碩士，研究方向為畜產(chǎn)品加工。

E-mail： 270157988@qq.com