HPLC法測(cè)定不同種源辣木葉花莖中異槲皮苷和新綠原酸的含量

普天磊，鄧紅山，廖承飛，羅會(huì)英，范建成，金杰，韓學(xué)琴

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所元謀干熱河谷植物園，云南元謀651300）

辣木為辣木科辣木屬植物Moringa oleifera Lam，為多年生熱帶落葉喬木。辣木葉、花、莖、果實(shí)等部位含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和藥用成分，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥[1-2]、食品[3-4]、動(dòng)物飼料[5]、凈水[6]等領(lǐng)域，被譽(yù)為“奇跡之樹(shù)”。辣木的活性成分主要有黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)、多糖類(lèi)、生物堿等[7]。其中，黃酮和酚酸類(lèi)成分是辣木發(fā)揮抗氧化、抗菌消炎、肝臟保護(hù)、降血壓等藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，是辣木中較為重要的活性成分[8-10]。

辣木并無(wú)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)的質(zhì)量控制文獻(xiàn)報(bào)道也較為罕見(jiàn)，辣木活性成分的含量測(cè)定主要集中于黃酮及酚酸類(lèi)，對(duì)于該類(lèi)成分中的單體化合物的含量、性質(zhì)等研究甚少。目前，辣木中的黃酮和酚酸類(lèi)成分的測(cè)定研究主要采用的是紫外分光光度法[11-13]，該法雖然具有操作簡(jiǎn)單、分析速度快、設(shè)備成本低等優(yōu)勢(shì)，但特異性差，對(duì)與待檢物有相同吸收波長(zhǎng)的雜質(zhì)也會(huì)產(chǎn)生吸收，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確[14]。高效液相色譜法根據(jù)待測(cè)物的極性進(jìn)行分離檢測(cè)，可有效避免上述不足，同時(shí)方法靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，廣泛應(yīng)用于單體成分的分析檢測(cè)[15]。植物的來(lái)源地、使用部位不同，活性成分種類(lèi)、含量差別較大，而活性成分的含量將直接影響其生理功能[16]，因此有必要對(duì)不同種源辣木各部位的黃酮和酚酸類(lèi)的含量進(jìn)行系統(tǒng)研究。然而，目前并沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)辣木不同種源、不同部位中的黃酮和酚酸類(lèi)成分的具體分布情況進(jìn)行報(bào)道。吉莉莉表明[17]，異槲皮苷為辣木葉黃酮的主要單體成分，且具有降血糖、減輕氧化應(yīng)激、抑制炎性反應(yīng)、降血脂等生理功能。高秋玉等[18]發(fā)現(xiàn)除異槲皮苷為代表的黃酮類(lèi)成分有較強(qiáng)清除自由基能力外，以新綠原酸為代表的酚酸類(lèi)成分也表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，具有抗氧化、抗菌解熱、抗血栓、抑制血小板聚集等藥理作用[19]。本文在查閱相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜法（high performunce liguid chromatography，HPLC）同時(shí)測(cè)定辣木中異槲皮苷及新綠原酸的含量，對(duì)采集的17份辣木樣品的葉、花、莖部位進(jìn)行了含量分析，為辣木的質(zhì)量控制及合理開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

1260 InfinityⅡ高效液相色譜儀，包括G7114A可變波長(zhǎng)檢測(cè)器、G711A四元泵、G7129A進(jìn)樣器：美國(guó)安捷倫公司；超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；電子分析天平：島津公司；MDJ-A01Y1磨粉機(jī)：小熊電器股份有限公司。

1.1.2 試劑

異槲皮苷對(duì)照品（純度＞98%）、新綠原酸對(duì)照品（純度＞98%）：成都瑞芬思生物科技有限公司；乙腈（色譜純）：SIGMA試劑公司；磷酸（優(yōu)級(jí)純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；乙醇（分析純）：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；水為超純水。

辣木樣品：采摘于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所辣木創(chuàng)新研究基地，YLM為不同來(lái)源地的辣木樣品；GY和GYZH均為云南省苴林辣木種植基地所選育的材料，其中GY為種植基地中選育的產(chǎn)量較高的植株，GYZH為苴林基地選育的開(kāi)花較早的產(chǎn)量較高的植株。辣木樣品信息見(jiàn)表1。

表1 辣木樣品信息Table 1 The sample information of Moringa oleifera

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的配制

精密稱(chēng)取新綠原酸對(duì)照品7.5mg，異槲皮苷對(duì)照品7.6 mg，加入乙醇充分溶解并定容至25 mL容量瓶，配制成濃度為0.300 mg/mL新綠原酸、0.304 mg/mL異槲皮苷的混合對(duì)照品溶液。

1.2.2 辣木供試品溶液的配制

辣木樣品用磨粉機(jī)充分粉碎，過(guò)40目篩，備用。稱(chēng)取1.0g辣木粉置于25mL容量瓶中，加入50%乙醇20mL，冷浸3h，超聲處理30min，放冷，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm有機(jī)系微孔濾膜過(guò)濾，即得。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.05%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5min，10%B；5min～20min，30%B；20 min～25 min，10%B）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；柱溫 30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密吸取1.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品適量，用50%乙醇分別配制成含 0.015 2、0.030 4、0.076、0.152、0.228 、0.304 mg/mL 的異槲皮苷，及 0.015、0.03、0.075、0.15、0.225、0.300 mg/mL的新綠原酸混合對(duì)照品溶液，按1.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.5 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液適量，按1.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6次，計(jì)算RSD（%）。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取辣木樣品，按1.2.2方法制備供試品溶液，在配制后0、4、8、12、24 h按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算RSD（%），考察樣品在室溫放置24 h的穩(wěn)定性。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取辣木樣品6份，按1.2.2方法制備供試品溶液，按1.2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算RSD（%）。

1.2.8 回收率試驗(yàn)

精密取1.0g辣木樣品，分別加入3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，再按1.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.9 樣品含量測(cè)定與分析

辣木葉、花、莖樣品，按1.2.2項(xiàng)下條件制備供試品溶液，精密吸取5 μL，按1.2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，各樣品平行測(cè)定3次，測(cè)量樣品中異槲皮苷及新綠原酸的含量。測(cè)定結(jié)果采用SPSS 19軟件進(jìn)行多重比較分析和聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

在該色譜條件下，樣品各成分色譜峰分離效果好，且出峰時(shí)間與對(duì)照品出峰時(shí)間一致，對(duì)照品及樣品溶液的HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)液及樣品溶液HPLC色譜圖Fig.1 The HPLC chromatogram of mixed standard solution and sample solution

2.2 線(xiàn)性關(guān)系考察

以對(duì)照品濃度C為橫坐標(biāo)，色譜峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得異槲皮苷的回歸方程為：Y1=8 122.5X-17.884，R2=0.999 7，新綠原酸的線(xiàn)性回歸方程為：Y2=15 812X-63.331，R2=0.999 6，結(jié)果表明，異槲皮苷、新綠原酸濃度分別在0.015 2 mg/mL～0.304 mg/mL、0.015 mg/mL～0.300 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn)

按1.2.5項(xiàng)下方法進(jìn)行精密度試驗(yàn)，組分峰面積結(jié)果見(jiàn)表2，表明儀器精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of accuracy test

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按1.2.6項(xiàng)下方法進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，組分在各時(shí)間段的峰面積結(jié)果見(jiàn)表3，表明樣品溶液在室溫放置24 h基本穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The result of stability test

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

按1.2.7項(xiàng)下方法進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，組分的峰面積結(jié)果見(jiàn)表4，表明本方法重復(fù)性良好。

2.6 回收率試驗(yàn)

按1.2.8項(xiàng)下方法進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果表明，異槲皮苷、新綠原酸的平均加標(biāo)回收率符合分析測(cè)定要求，結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The result of repetitive test

表5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The results of sample recovery rate

2.7 含量測(cè)定

2.7.1 不同部位、不同種源辣木樣品活性成分含量顯著性分析

辣木樣品中異槲皮苷、新綠原酸的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6及圖2～圖4。

表6 不同部位辣木樣品中異槲皮苷、新綠原酸差異分析Table 6 The difference analysis of isoquercitrin and neochlorogenic acid of different parts in Moringa oleifera samples

圖2 辣木葉中異槲皮苷和新綠原酸含量Fig.2 The contents of isoquercitrin and neochlorogenic acid in Moringa oleifera leaves

圖3 辣木花中異槲皮苷及新綠原酸含量Fig.3 The contents of isoquercitrin and neochlorogenic acid in Moringa oleifera flowers

圖4 辣木莖中異槲皮苷及新綠原酸含量Fig.4 The contents of isoquercitrin and neochlorogenic acid in Moringa oleifera stems

表6為17份辣木樣品中活性成分在不同部位的含量分布情況（用Mean±SD表示），結(jié)果可知，17個(gè)辣木樣品的不同部位活性成分含量高低特征為：葉＞花＞莖。其中，辣木葉中異槲皮苷和新綠原酸的含量均顯著高于花和莖，而花和莖中的異槲皮苷含量無(wú)顯著性差異，新綠原酸在辣木花和莖中的含量有顯著性差異。此外，不同辣木樣品的莖與花部位，活性成分含量呈現(xiàn)出趨勢(shì)為：異槲皮苷＞新綠原酸，這種現(xiàn)象尤其在辣木莖中表現(xiàn)更為明顯。

不同辣木樣品的有效成分含量差異較大，其中辣木葉中異槲皮苷含量最高的5個(gè)樣品依次為：GYZH-4（6.14 mg/g）、YLM-3（5.94 mg/g）、GY-2（5.80 mg/g）、YLM-1（5.18 mg/g）、YLM-4（4.57 mg/g），新綠原酸含量最高的5個(gè)樣品依次為：GY-4（6.14 mg/g）＞GY-2（5.51 mg/g）＞YLM-3（5.28 mg/g）＞GYZH-3（5.18 mg/g）＞YLM-5（5.12 mg/g）。辣木花中異槲皮苷含量最高的5個(gè)樣品分別為：GYZH-4 （2.46 mg/g）、GYZH-2（2.16 mg/g）、GY-1（2.14 mg/g）、GYZH-3（2.01 mg/g）、YLM-3（1.61 mg/g），新綠原酸含量最高的5個(gè)樣品依次為：GYZH-6（1.28 mg/g）、GY-2（1.23 mg/g）、GYZH-2（1.20 mg/g）、GY-3（1.13 mg/g）、YLM-2（1.12 mg/g）。辣木莖中活性成分含量最高的5個(gè)樣品，異槲皮苷依次為：YLM-3（1.92 mg/g）＞GYZH-1（1.79 mg/g）＞GYZH-2（1.74 mg/g）＞GYZH-3（1.72 mg/g）＞YLM-4（1.69 mg/g）；新綠原酸依次為：GYZH-1（0.66 mg/g）、GYZH-6（0.61 mg/g）、GY-2（0.57 mg/g）、YLM-5（0.50 mg/g）、YLM-4（0.50 mg/g）。對(duì)于不同來(lái)源地的辣木樣品而言，來(lái)源于古巴的YLM-3葉、花、莖3個(gè)部位異槲皮苷（分別為 5.94 mg/g、1.61mg/g、1.92 mg/g） 和新綠原酸含量（分別為 5.28、1.06、0.49 mg/g）均較高，來(lái)源于老撾的YLM-1僅葉和花中異槲皮苷含量高，值分別為5.18、1.57 mg/g；來(lái)源于美國(guó)的YLM-2和印度的YLM-4活性成分在葉、花、莖內(nèi)含量適中（異槲皮苷含量在4.57 mg/g～0.92 mg/g之間，新綠原酸含量在4.79 mg/g～0.40 mg/g之間）；來(lái)源于馬里的YLM-5僅葉中新綠原酸含量高，為5.12 mg/g。

2.7.2 不同辣木樣品活性成分的聚類(lèi)分析

采用SPSS19軟件以系統(tǒng)聚類(lèi)法對(duì)不同種源不同部位的17份辣木樣品中異槲皮苷和新綠原酸的含量進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同辣木樣品活性成分的聚類(lèi)分析Fig.5 Cluster analysis of active ingredients of different Moringa oleifera varieties

在歐式距離為10時(shí)，可將辣木樣品分為5類(lèi)，其中，YLM-3和GY-2為I類(lèi)群，其特點(diǎn)為異槲皮苷和新綠原酸在辣木葉、花、莖中的含量均較高。YLM-1和GYZH-4為II類(lèi)群，特點(diǎn)為異槲皮苷在辣木葉和花中的含量高，在莖中含量為中下等水平，新綠原酸在葉、花、莖中的含量低。YLM-2、YLM-4、GY-1、GY-3、GYZH-1、GYZH-2、GYZH-3、GYZH-5、GYZH-6、GYZH-8為III類(lèi)群，特點(diǎn)為辣木葉、花、莖中活性成分含量適中，既沒(méi)有偏高也沒(méi)有偏低的表現(xiàn)。YLM-5和GY-4為IV類(lèi)群，特點(diǎn)為新綠原酸在葉中含量高，在花和莖中含量整體偏低，異槲皮苷的在葉、花、莖中的含量偏低。GYZH-7為V類(lèi)群，特點(diǎn)為兩種活性成分在不同部位的含量分布均較低。

3 討論

異槲皮苷及新綠原酸分別為黃酮及酚酸類(lèi)成分，呈親水性，在乙醇、乙腈、甲醇等溶液中溶解性良好，考慮到異槲皮苷及新綠原酸在乙醇溶液中溶解性良好，且乙腈、甲醇等溶液毒害性較強(qiáng)，因此采用乙醇作為本試驗(yàn)的溶媒。

已有相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)辣木中不同部位的多糖類(lèi)成分進(jìn)行比較研究，孫鳴燕等[20]表明，辣木多糖在不同部位的含量趨勢(shì)為：根＞葉＞種子＞葉柄；任飛等[21]表明辣木多糖在莖中含量最高，葉片中次之，葉柄中最低。酚酸和黃酮類(lèi)物質(zhì)是辣木發(fā)揮抗氧化及抗菌功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[9]，其在辣木不同部位中的分布情況并未進(jìn)行系統(tǒng)的比較研究，本研究發(fā)現(xiàn)辣木異槲皮苷及新綠原酸的含量高低趨勢(shì)為：葉＞花＞莖，目前辣木中黃酮與酚酸的研究部位絕大多數(shù)為葉片，與本文研究相符[22-23]，因此，在對(duì)辣木中的黃酮及酚酸類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行研究時(shí)，推薦選擇葉片作為研究部位。此外，辣木花和莖活性成分中，異槲皮苷的含量大于新綠原酸，特別是在辣木莖中，異槲皮苷的值明顯高于新綠原酸。

來(lái)源地會(huì)對(duì)植物中的活性成分種類(lèi)和含量造成影響，不同來(lái)源地的辣木樣品中異槲皮苷和新綠原酸均被檢出，但含量有一定差異，這可能與生態(tài)環(huán)境、土壤、氣候、種植等因素有關(guān)，開(kāi)發(fā)者可根據(jù)不同用途和需求選擇相應(yīng)的材料及使用部位。若用于降血糖、抑制炎性反應(yīng)、降血脂等領(lǐng)域，可選YLM-1的葉和花部位[24]；若用于抗氧化、抗菌解熱、抗血栓、抑制血小板聚集等領(lǐng)域，可選YLM-5的葉部位[19，25]。此外，與GY相比，開(kāi)花較早的GYZH早熟辣木材料的活性成分并沒(méi)有偏高或低的表現(xiàn)趨勢(shì)，即早熟特性不對(duì)辣木中的活性成分造成影響。

本研究建立的HPLC法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性、穩(wěn)定性好，樣品測(cè)定時(shí)間適宜，可同時(shí)測(cè)定辣木全株中異槲皮苷和新綠原酸的含量，為其質(zhì)量控制提供方法和參考依據(jù)。