響應(yīng)面法優(yōu)化玫瑰茄花青素提取工藝及穩(wěn)定性研究

（天津天獅學(xué)院，天津301700）

玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa L.）是錦葵科木槿屬的一年生草本植物，是傳統(tǒng)藥食兩用植物。玫瑰茄原產(chǎn)于熱帶和亞熱帶，在福建、廣東、廣西、臺(tái)灣均有分布，云南臨滄元謀、永仁等地區(qū)已形成規(guī)模種植[1-2]。玫瑰茄花萼呈紫紅色，富含花青素、黃酮、多酚等生物活性成分，具有抗氧化、抗炎、降血壓、降血脂、降血糖[3-6]及抗腫瘤[7]等功效。玫瑰茄花含有蛋白質(zhì)、維生素C、β-胡蘿卜素、鈣、鐵等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且具有顯著生理活性特性，目前主要用于花茶、果脯、蜜餞、果醬[2]、飲料、發(fā)酵乳等[8-9]食品的生產(chǎn)。研究表明，超聲波法可以縮短提取時(shí)間，增大花青素、黃酮類物質(zhì)提取率[10-12]，優(yōu)化花色苷提取工藝。Hellstrom J等[13]研究指出，花色苷受自身化學(xué)結(jié)構(gòu)、溫度、濃度、氧氣等內(nèi)外因素的影響，高度不穩(wěn)定，容易降解。文獻(xiàn)指出溫度對(duì)龍葵果花色苷提取物有一定影響，隨著溫度升高，花色苷降解速率增大[14-15]。趙玉紅等[16]研究巴氏殺菌處理對(duì)龍葵果果汁特性的影響，指出果汁中多酚、花色苷、單寧含量隨著殺菌溫度的升高和殺菌時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。本試驗(yàn)采用響應(yīng)面試驗(yàn)法優(yōu)化玫瑰茄花青素提取工藝，并分析花青素的熱穩(wěn)定性，為玫瑰茄資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

云南玫瑰茄：市售；無(wú)水乙醇（分析純）：天津江天化工技術(shù)有限公司；濃鹽酸、冰乙酸（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙酸鈉、氯化鉀（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

UV2550紫外分光光度計(jì)：島津儀器蘇州有限公司；ME204E分析天平、ME4002TE精密天平：梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；SB-3200D超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；TG18K高速離心機(jī)：長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；ZN-02型小型中藥粉碎機(jī)：中科耐馳技術(shù)（北京）有限公司；60目不銹鋼實(shí)驗(yàn)室分樣篩：上海雷熙五金絲網(wǎng)制品有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 玫瑰茄花青素的提取工藝

用ZN-02型中藥粉碎機(jī)將玫瑰茄原料粉碎，過60目篩，放入棕色試劑瓶中密封保存。稱取經(jīng)過預(yù)處理的玫瑰茄樣品粉，按照一定的料液比加入乙醇溶液，進(jìn)行超聲波輔助提取。將玫瑰茄提取液冷卻、離心后制得上清液，采用pH示差法測(cè)定玫瑰茄花青素得率[14，17]。分別移取配制好的玫瑰茄提取液1.0mL，用pH=1.0、pH=4.5的緩沖液稀釋至10 mL比色管中，平衡穩(wěn)定60 min后在波長(zhǎng)520 nm和700 nm處測(cè)定吸光度，按照公式1計(jì)算花青素得率。

式中：A為（A520nmpH1.0-A700nmpH1.0）-（A520nmpH4.5-A700nmpH4.5）；ε為摩爾消光系數(shù)，26 900 L/（mol·cm）；L為光程，1 cm；M為-矢車菊活化素-3-葡萄糖苷的分子量，449.2；DF 為稀釋因子；V 為提取液體積，mL；W 樣品質(zhì)量，g。

1.3.2 玫瑰茄花青素提取單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的玫瑰花樣品1 g，置于250 mL磨口三角瓶中，在提取溫度50℃條件進(jìn)行超聲功率、提取時(shí)間、乙醇濃度、料液比的花青素提取單因素試驗(yàn)，確定各因素的優(yōu)水平。

1.3.3 玫瑰茄花青素提取響應(yīng)面試驗(yàn)

基于玫瑰茄花青素單因素試驗(yàn)的結(jié)果，應(yīng)用Design-Expert10軟件對(duì)提取時(shí)間、超聲功率、乙醇濃度、料液比做響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其試驗(yàn)因素水平編碼表詳見表1。

表1 花青素響應(yīng)面試驗(yàn)編碼水平表Table 1 Factors and levels in Box－Benhnken design of anthocyanin

1.3.4 玫瑰茄花青素穩(wěn)定性分析

1.3.4.1 溫度對(duì)花青素穩(wěn)定性影響

按照試驗(yàn)方法1.3.1提取玫瑰茄花青素，配制成稀釋5倍、10倍、15倍花青素稀釋液。吸取2 mL花青素稀釋提取液于 25 mL 比色管中，在 65、70、75、80、85、90 ℃的水浴鍋中分別熱處理 30、60、90、120 min，放入冷水中快速冷卻，按照方法1.3.1測(cè)定熱處理后花青素濃度，計(jì)算花青素保留率[14]。

1.3.4.2 pH值對(duì)花青素穩(wěn)定性影響

按照1.3.4.1中制備稀釋5倍花青素稀釋液，用1 moL/L 鹽酸溶液調(diào) pH 值為 3、4、5、6、7 5種花青素樣品溶液[18]。在溫度90℃條件下熱處理120min，按1.3.4.1方式計(jì)算花青素保留率，分析pH值對(duì)玫瑰茄花青素的穩(wěn)定性影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 玫瑰茄花青素提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲波功率對(duì)花青素提取效果的影響

在提取時(shí)間30 min、乙醇濃度 70%、料液比1∶20（g/mL）條件下，溫度設(shè)定為50℃，考察超聲功率對(duì)玫瑰茄花青素得率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 超聲功率對(duì)花青素得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the yield of anthocyanin

由圖1可知，超聲功率增加到144 W時(shí)玫瑰茄花青素得率為3.68 mg/g。超聲功率低于或高于144 W，玫瑰茄花青素得率呈現(xiàn)不同程度的降低，可能是由于一定功率的超聲波可以促進(jìn)花青素的溶出，但功率過大可能會(huì)破壞花青素的結(jié)構(gòu)，確定超聲波功率144 W為花青素提取的較優(yōu)水平。

2.1.2 料液比對(duì)花青素得率的影響

在超聲功率144 W、提取時(shí)間30 min、乙醇濃度70%條件下，超聲溫度50℃，分析料液比對(duì)玫瑰茄花青素得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對(duì)花青素得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of anthocyanin

由圖2可知，玫瑰茄花青素得率隨溶劑體積的增加而出現(xiàn)先增大后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，在料液比1∶30（g/mL）時(shí)花青素得率較高為3.80 mg/g?？赡苁怯捎谔崛∪軇┰龃笥欣诨ㄇ嗨匚镔|(zhì)溶出，但料液比增加至1∶30（g/mL）后玫瑰茄花青素基本都溶出，繼續(xù)增大料液比效果不明顯，確定料液比1∶30（g/mL）為較優(yōu)水平。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)花青素得率的影響

在超聲功率 144 W、料液比 1∶30（g/mL）、乙醇濃度70%、超聲溫度50℃條件下，分析提取時(shí)間對(duì)玫瑰茄花青素得率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)花青素得率的影響Fig.3 Effect of exaction time on the yield of anthocyanin

提取時(shí)間30 min玫瑰茄花青素得率最高為3.42（mg/g），隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的現(xiàn)象，可能提取時(shí)間延長(zhǎng)使部分花青素被氧化，導(dǎo)致花青素得率降低，選擇提取時(shí)間30 min為較優(yōu)水平。

2.1.4 乙醇濃度對(duì)花青素得率的影響

在超聲功率 144 W、料液比 1 ∶30（g/mL）、提取時(shí)間30 min、提取溫度50℃的條件下，分析提取溶劑乙醇濃度對(duì)玫瑰茄花青素得率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇濃度對(duì)玫瑰茄花青素得率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the yield of anthocyanin

由圖4可知，花青素得率隨著乙醇濃度的升高呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì)，乙醇濃度70%得率最大為3.63 mg/g?？赡苁怯捎谝恍┐既苄噪s質(zhì)、親脂性強(qiáng)的成分與乙醇、水分子結(jié)合，導(dǎo)致花青素得率下降，故確定乙醇濃度為70%為較優(yōu)水平。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化玫瑰茄花青素提取條件

2.2.1 玫瑰茄花青素響應(yīng)面提取試驗(yàn)結(jié)果

在分析玫瑰茄花青素提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design Expert 10進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，分析提取時(shí)間、超聲功率、乙醇濃度、料液比對(duì)玫瑰茄花青素得率的影響，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果詳見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Results of Box-Benhnken design

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Continue table 2 Results of Box-Benhnken design

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析

對(duì)表2玫瑰茄花青素響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，各差異源對(duì)花青素得率的影響分析詳見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 ANOVA for Box-Benhnken design

由表3可知，C、BC、D2對(duì)花青素提取得率的影響顯著，B、AD、A2、B2、C2對(duì)提取效果的影響非常顯著。通過比較差異源F值的大小，提取時(shí)間、超聲功率、乙醇濃度、料液比在所設(shè)定的范圍內(nèi)對(duì)玫瑰茄花青素提取得率的影響程度依次為B＞C＞D＞A。

應(yīng)用Design-Expert10軟件對(duì)提取時(shí)間、超聲功率、乙醇濃度、料液比4個(gè)因素進(jìn)行回歸擬合分析，建立多元回歸模型：R1=-25.022 8+0.174 9A+0.164 4B+0.269 8C+0.357 6D-1.490 0×10-3A2-9.722 2×10-5AB-1.250 0×10-4AC-2.100 0×10-3AD-6.257 7×10-4B2+4.722 2×10-4BC-6.111 1×10-4BD-2.227 5×10-3C2-9.000 0×10-4CD-2.260 0×10-3D2。多元回歸模型統(tǒng)計(jì)量 P＜0.000 1＜0.01，失擬項(xiàng) P=0.187 3＞0.05，決定系數(shù) R2=0.927 4，表明回歸方程顯著、失擬項(xiàng)不顯著，響應(yīng)面回歸方程的擬合程度良好。

2.2.3 響應(yīng)面圖分析

應(yīng)用Design-Expert10對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，繪制出響應(yīng)曲面圖5～圖10。

圖5 提取時(shí)間與超聲功率對(duì)花青素得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time and ultrasonic wave power on the yield of anthocyanin

圖6 提取時(shí)間與乙醇濃度對(duì)花青素得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time and ethanol concentration on the yield of anthocyanin

由響應(yīng)面回歸方程及響應(yīng)曲面圖可知，因素BC、CD的交互作用明顯。采用軟件優(yōu)化分析得出最佳提取條件為提取時(shí)間27.1 min、超聲功率137.9 W、乙醇濃度 67.5%、料液比 1∶34.4（g/mL）。

圖7 提取時(shí)間與料液比對(duì)花青素得率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic time and liquid ratio on the yield of anthocyanin

圖8 超聲功率與乙醇濃度對(duì)花青素得率的影響Fig.8 Effect of ultrasonic wave power and ethanol concentration on the yield of anthocyanin

圖9 超聲功率與料液比對(duì)花青素得率影響Fig.9 Effect of ultrasonic wave power and liquid ratio on the yield of anthocyanin

為了便于控制玫瑰茄花青素超聲提取條件，提取參數(shù)設(shè)置為時(shí)間27 min、超聲功率138 W、乙醇濃度68%、料液比 1∶34（g/mL），其預(yù)測(cè)值為3.94 mg/g。以所得優(yōu)化條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，玫瑰茄花青素得率為（3.93±0.04）mg/g，與模擬預(yù)測(cè)值接近，表明預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值有較好的擬合度，多元回歸方程可靠。

2.3 玫瑰茄花青素穩(wěn)定性分析

2.3.1 溫度對(duì)花青素穩(wěn)定性影響

圖10 乙醇濃度與料液比對(duì)花青素得率影響Fig.10 Effect of ethanol concentration and liquid ratio on the yield of anthocyanin

依據(jù)試驗(yàn)方法1.3.1制備玫瑰茄花青素提取液，測(cè)定花青素濃度為128.25 μg/mL，配制成稀釋度5倍、10倍、15倍玫瑰茄花青素樣液。對(duì)不同稀釋倍數(shù)的花青素提取液分別熱處理30、60、90、120 min，計(jì)算花青素保留率，如圖11～圖13所示。

圖11 稀釋5倍花青素?zé)岱€(wěn)定性分析Fig.11 Analysis on stability of anthocyanin diluted 5 times

圖12 稀釋10倍花青素穩(wěn)定性分析Fig.12 Analysis on stability of anthocyanin diluted 10 times

圖13 稀釋15倍花青素穩(wěn)定性分析Fig.13 Analysis on stability of anthocyanin diluted 15 times

同樣熱處理?xiàng)l件下，稀釋倍數(shù)越大、熱處理溫度越高花青素穩(wěn)定性越差，玫瑰茄花青素在90℃、120 min條件下減少量最大為42.05%。稀釋倍數(shù)增大增強(qiáng)花青素分散性，熱處理溫度增高促使酚羥基不穩(wěn)定，使花青素易氧化，故保留率降低。

2.3.2 pH值對(duì)花青素穩(wěn)定性影響

在分析溫度對(duì)花青素穩(wěn)定性分析基礎(chǔ)上，計(jì)算在90℃條件下熱處理溫度時(shí)間120 min后，不同pH值花青素提取液的穩(wěn)定性，如圖14所示。

圖14 pH值對(duì)花青素穩(wěn)定性影響Fig.14 Influence of pH on stability of anthocyanin

pH 3～4玫瑰茄花青素保留率變化較大，pH 5～7保留率變化較小，說明在pH值在3～7范圍內(nèi)，pH值越大花青素穩(wěn)定性越差。

3 結(jié)論

以云南產(chǎn)玫瑰茄為原料，在分析超聲功率、提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design-Expert10進(jìn)行玫瑰茄花青素提取響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到最佳提取條件為時(shí)間27 min、超聲功率138 W、乙醇濃度 68%、料液比 1∶34（g/mL），花青素得率為（3.93±0.04）（mg/g），與模擬預(yù)測(cè)值接近。玫瑰茄花青素提取液稀釋倍數(shù)越大、熱處理溫度越高花青素穩(wěn)定性越差，玫瑰茄花青素在90℃、120 min條件下減少量最大為42.05%。隨著pH值增大花青素穩(wěn)定性降低。