細菌M19降解黃曲霉毒素B1降解產(chǎn)物的毒性分析

王佳興 謝巖黎 宋 娟

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院1，鄭州 450001) (河南省糧油食品安全檢測與控制重點實驗室2，鄭州 450001)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑及培養(yǎng)基配置

細胞培養(yǎng)液的配制：在90 mL培養(yǎng)基(RPMI 1640培養(yǎng)基)中加入10 mL胎牛血清，必要時加入1%的雙抗(青鏈霉素混合液)，配制成RPMI 1640完全培養(yǎng)基。

2-氨基芴、大鼠肝S9活化系統(tǒng)、二甲基亞砜(DMSO)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、RPMI-1640培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、CCK-8細胞增殖-毒性檢測試劑盒。

1.1.2 實驗菌株及細胞

鼠傷寒沙門氏菌TA98，TA100：中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

人肝癌細胞系HepG2，由中國科學(xué)院細胞庫提供。

1.2 儀器與設(shè)備

BC-J二氧化碳細胞培養(yǎng)箱；LGT-10C真空冷凍干燥機；BM-37XB倒置顯微鏡； Infinite F50酶標(biāo)儀；血球計數(shù)板。

1.3 實驗方法

1.3.1 Ames實驗1.3.1.1 實驗菌株培養(yǎng)

將兩個菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯(按GB15193.4—2014配置)中，37 ℃搖床(100 r/min)培養(yǎng)10 h，培養(yǎng)過程中注意用錫紙包裹。

1.3.1.2 自發(fā)回變數(shù)的測定

向2 mL頂層培養(yǎng)基(融化狀態(tài))中加入菌液0.1 mL，迅速搖勻倒入底層培養(yǎng)基平板中，轉(zhuǎn)動平板使平板表面平整均勻，37 ℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)每個平板的菌落總數(shù)。

1.3.1.3 AFB1降解后的致突變性(Ames)實驗

1)受試物的準(zhǔn)備

將25μL AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度為100 μg/mL)與975 μL PADE在37 ℃，180 r/min暗處降解72 h，分別在降解0、1、2、3 d的時間點向反應(yīng)體系中加入3 mL的二氯甲烷渦旋進行萃取，獲得降解后的有機相受試物(二氯甲烷層)和水相受試物，有機相在氮氣下吹干重新溶解在DMSO，使原AFB1的濃度分別為2.5、0.5、0.1 μg/mL；水相進行冷凍干燥，重新溶解在DMSO中，與有機相設(shè)置相同濃度稀釋。將DMSO作為溶劑對照，0.1 mg/mL的氨基芴作為陽性對照，所有待檢測溶液都要過濾除菌。

2)平板摻入法測定AFB1降解后的致突變性

與自發(fā)回變數(shù)的操作相同，只是加入菌液的同時加入0.1 mL的受試物溶液(將0.1 mL菌液與0.1 mL受試物溶液提前混合或者先向頂層培養(yǎng)基中加入受試物45 ℃水浴，再加入菌液)，代謝活化組還需要加入0.5 mL大鼠肝S9活化溶液。

1.3.2 CCK-8法檢測細胞增殖-毒性

AFB1的準(zhǔn)備：分別配置1.0、2.5、5.0、10.0μg/mL的AFB1溶液，在氮氣下吹干，用DMSO溶解，再添加RPMI-1640完全培養(yǎng)液，使DMSO的含量為1%。

降解后產(chǎn)物的準(zhǔn)備：降解反應(yīng)結(jié)束后(72 h)，通過二氯甲烷萃取分別獲得有機相和水相，有機相通過氮氣吹干二氯甲烷，殘留物用DMSO(1%)溶解，再用RPMI-1640完全培養(yǎng)液稀釋，使原AFB1濃度分別為1.0、2.5、5.0、10.0 μg/mL；水相通過冷凍干燥去除水分，重新溶解在DMSO(1%)中，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液，配置相應(yīng)濃度的待測物質(zhì)。

將制備的細胞懸液以及不含細胞的完全培養(yǎng)液(100 μL/孔)加入96孔板，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜(待細胞貼壁生長狀態(tài)良好)，再將孔板取出加入10 μL不同濃度的待測物質(zhì)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育1～4 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。設(shè)置空白孔(無細胞的培養(yǎng)液，不加藥)，對照孔(含細胞的培養(yǎng)液，1%DMSO的培養(yǎng)液)，實驗孔(含細胞的培養(yǎng)液，不同濃度的待測物質(zhì))。細胞存活率的計算：

2 結(jié)果與分析

2. 1 Ames實驗結(jié)果

2.1.1 實驗菌株生物學(xué)鑒定標(biāo)準(zhǔn)

對于生物學(xué)特性鑒定合格及自發(fā)回變菌落數(shù)在正常范圍內(nèi)(表1)的測試菌株可進行樣品測試。平板摻入法的結(jié)果評價標(biāo)準(zhǔn)為[20-22]，測試菌株TA98的回變菌落數(shù)等于或大于無處理對照組的2倍，其他測試菌株的回變菌落數(shù)等于或大于無處理對照組的2倍，并具有以下兩種情況之一的可判定為陽性結(jié)果：1)有劑量-反應(yīng)關(guān)系；2)某一測試點有可重復(fù)的陽性結(jié)果。

表1 實驗菌株生物學(xué)鑒定標(biāo)準(zhǔn)

注：+表示陽性，-表示陰性。

2.1.2 自發(fā)回變數(shù)的測定

由表2可知，這兩株菌的自發(fā)回變菌落數(shù)均在正常范圍內(nèi)。

表2 測試菌株的自發(fā)回變數(shù)

2.1.3 AFB1降解后的致突變性分析

在未有代謝活化物激活受試物的情況下(圖1)，未降解組(降解0 d)，有機相受試物測試，在2.5 μg/mL濃度時，TA98和TA100的回變菌落數(shù)較大(大于陽性對照組)，且在0.1 μg/mL濃度下，TA98的回變菌落數(shù)與濃度呈比例關(guān)系；在降解1 d的情況下，有機相受試物測試，三個濃度下TA98和TA100的回變菌落數(shù)超過溶劑對照的2倍，但濃度與回變菌落數(shù)之間不存在比例關(guān)系，且與未降解組相比回變數(shù)明顯減少；在降解2 d的情況下，有機相受試物測試，三個濃度下TA98和TA100的回變菌落數(shù)明顯減少(與降解0 d和降解1 d的相比)，濃度與回變菌落數(shù)之間無比例關(guān)系，TA98的回變菌落數(shù)遠超過溶劑對照組的兩倍，TA100的回變菌落數(shù)達到溶劑對照組的一倍多；在降解3 d的情況下，有機相受試物測試，TA98和TA100在三個濃度下的回變菌落數(shù)與溶劑對照組及自發(fā)回變相比，無很大差別。水相受試物測試中，整個過程三個濃度下TA98和TA100的回變菌落數(shù)與溶劑對照的無明顯差別。

注：a、b分別為TA98和TA100在AFB1劑量分別在0.1、0.5、2.5 μg/mL情況下有機相受試物的致突變性；c、d分別為TA98和TA100在AFB1劑量分別在0.1、0.5、2.5 μg/mL情況下水相受試物的致突變性。圖1 待測物致突變性檢測結(jié)果(S9-)

結(jié)果顯示，在降解0 d 時，有機相受試物為致突變陽性，且致突變性極強(較強的致癌性)，在降解1 d到降解2 d時，AFB1已經(jīng)降解一部分，總的來看還是呈現(xiàn)致突變陽性，在降解3 d時，呈現(xiàn)致突變陰性；在該實驗條件下水相受試物對TA98和TA100無致突變作用。

在代謝活化物(S9)活化情況下(圖2)，所有測試組的回變菌落數(shù)與未代謝活化的相比普遍增多。未降解組(降解0 d)，有機相受試物測試，TA98的回變菌落數(shù)在濃度0.1 μg/mL時呈相應(yīng)的比例關(guān)系，TA100的回變菌落數(shù)大于陽性對照組并遠遠大于溶劑對照組；隨著降解時間的延長，三個濃度下TA98和TA100的回變菌落數(shù)均呈下降趨勢。在降解3 d的情況下，有機相呈現(xiàn)致突變陰性。水相受試物測試中，整個過程三個濃度下TA98和TA100的回變菌落數(shù)與溶劑對照的無明顯差別。

結(jié)果顯示，在降解0 d時，有機相受試物(AFB1)表現(xiàn)出強致突變作用；在降解1 d到降解2 d時，降解的量還很少，有機相受試物中還存在較多的AFB1，仍是表現(xiàn)出致突變陽性；在降解3 d的情況下，有機相呈現(xiàn)致突變陰性。在該實驗條件下水相受試物對TA98和TA100均無致突變作用。

結(jié)果表明，AFB1經(jīng)過降解后，其致突變性明顯降低，降解3 d后，其降解產(chǎn)物已表現(xiàn)出致突變陰性結(jié)果。李文明[23]研究AFB1降解產(chǎn)物的致突變性，將反應(yīng)體系經(jīng)旋蒸干燥重新溶解，通過Ames實驗的平板摻入法檢測降解產(chǎn)物的致突變性，得到降解產(chǎn)物是低毒或無毒的結(jié)果，與本研究結(jié)果相似。Alberts等[24]和Rao等[25]均將有機相和水相進行了Ames實驗檢測，得到了相似的結(jié)論。

注：a、b分別為TA98和TA100在AFB1劑量分別在0.1、0.5、2.5 μg/mL情況下有機相受試物的致突變性；c、d分別為TA98和TA100在AFB1劑量分別在0.1、0.5、2.5 μg/mL情況下水相受試物的致突變性。圖2 待測物致突變性檢測結(jié)果(S9+)

2.2 細胞毒性實驗

2.2.1 AFB1處理HepG2細胞后的細胞存活率

HepG2細胞在1.0、2.5、5.0、10.0 μg/mL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液作用24 h后，利用cck-8法檢測細胞存活率。結(jié)果顯示，以未經(jīng)任何處理的細胞作為對照，AFB1作用24 h后的細胞活性隨著 AFB1濃度的增加而呈下降趨勢，2.5 μg/mL時細胞活性已低于72%，10.0 μg/mL時細胞活性已低于56%。

2.2.2 AFB1降解后的細胞毒性

在所測濃度范圍內(nèi)，降解后產(chǎn)物對HepG2細胞的抑制率均小于17%，降解后有機相的細胞毒性隨著AFB1的濃度增加略有提高但無明顯差異，初始濃度為2.5 μg/mL的AFB1經(jīng)降解后，有機相降解液作用于細胞的存活率達到92%；初始濃度為10.0μg/mL的AFB1經(jīng)降解后，有機相降解液作用于細胞的存活率達到83%，降解后水相對HepG2的細胞存活率均在91%以上。數(shù)據(jù)分析，降解后的細胞毒性與降解前相比明顯降低，只有微量毒性，這與Liu等[26]研究結(jié)果相似。

2.2.3 不同濃度的AFB1及其降解物對HepG2細胞的影響

對照組(未處理)細胞呈多邊形密度大。經(jīng)過AFB1處理的細胞，數(shù)量明顯減少，部分細胞形態(tài)發(fā)生顯著改變，細胞褶皺，有些細胞死亡而不再緊密貼壁，有些細胞呈圓形，還有些細胞呈現(xiàn)半透明狀態(tài)推測其即將凋亡(圖3)。

圖3 不同濃度AFB1處理下的HepG2細胞狀態(tài)

不同濃度AFB1降解后作用于HepG2細胞后，細胞其數(shù)量稍有減少(倒置顯微鏡下觀察)。圖4為有機相降解液對HepG2細胞生長狀態(tài)的影響，整體上細胞濃度有所減少，有些細胞邊界不清晰，折光性差。圖5為水相降解液對HepG2細胞生長狀態(tài)的影響，整體細胞狀態(tài)比有機相降解液處理的細胞狀態(tài)稍好，細胞形態(tài)稍有改變，折光性稍差。在5.0 μg/mL的濃度下，細胞有些稀少；在10.0 μg/mL的濃度下，細胞密度大，可見對細胞的毒害較小，這與前人的研究結(jié)果相似[27]。

圖4 不同濃度有機相降解液對HepG2細胞形態(tài)的影響

圖5 不同濃度水相降解液對HepG2細胞形態(tài)的影響

3 結(jié)論

本研究對AFB1經(jīng)PADE降解后的產(chǎn)物進行毒性分析，將降解后的產(chǎn)物分為有機相和水相，分別對有機相和水相進行Ames實驗和細胞毒性實驗分析。

1)Ames實驗結(jié)果表明，AFB1經(jīng)PADE降解后對鼠傷寒沙門氏菌TA98、TA100的致突變作用顯著小于空白對照組(未降解的AFB1)，甚至與自發(fā)突變無顯著差異，降解3 d后，其降解產(chǎn)物已表現(xiàn)出致突變陰性結(jié)果。

2)細胞毒性實驗表明，與未處理細胞組相比，經(jīng)AFB1降解產(chǎn)物作用的細胞存活率均達到83%以上。AFB1經(jīng)PADE降解后其細胞毒性明顯降低(與AFB1相比)，在低濃度AFB1經(jīng)過降解的情況下，降解后無細胞毒性。