雜交鏈式反應技術結合納米材料用于核酸檢測的研究進展

劉永新，袁 旦，陳 沁，鈕 冰

(上海大學生命科學學院，上海 200444)

1 前 言

2004年Dirks和Pierce首次提出了一種體外恒溫擴增技術，即雜交鏈式反應(HCR)[1]。HCR的反應過程不需任何核酸工具酶的參與，且在室溫下便可進行，此外，這種信號擴增技術與各類檢測技術如熒光法、比色法和電化學法等都具有較高的兼容性，因而在生物傳感領域的DNA、miRNA、蛋白質以及金屬離子的檢測[2-7]中得到了廣泛關注。

納米尺寸的材料會表現(xiàn)出一些獨特的性質，例如表面效應、體積效應、量子尺寸效應、介電限域效應等。因此，將HCR與納米材料結合，極大程度地提高了靶標DNA、miRNA、蛋白質以及金屬離子的檢測靈敏度，使之甚至可以達到單分子檢測水平。尤其是在核酸檢測方面，與傳統(tǒng)核酸檢測方法(如：PCR、熒光RT-PCR)相比，這種將HCR與納米材料結合的方法不僅可以在常溫下進行，反應過程不需要酶的參與，而且能夠實現(xiàn)可視化檢測，檢測限低至飛摩爾水平，并能有效縮短檢測時間，適合于在現(xiàn)場和實驗條件較簡單的實驗室進行快捷檢測。本文將具體討論HCR與幾種常見的納米材料(銀納米顆粒、金納米顆粒、氧化石墨烯及其他幾種金屬納米材料)結合在核酸檢測方面的研究進展。

2 雜交鏈式反應(HCR)的原理

HCR反應系統(tǒng)包括兩個可雜交互補并帶有粘性末端的DNA發(fā)夾探針(H1和H2)，以及單鏈DNA(ssDNA)引發(fā)劑。在ssDNA(引發(fā)劑)誘發(fā)下，這兩個發(fā)夾探針會自組裝形成長的雙鏈DNA(dsDNA)產物。具體過程如圖1所示：亞穩(wěn)態(tài)的H1和H2在水溶液中共存時并不發(fā)生任何反應，但當引入引發(fā)劑時，引發(fā)劑會激活并打開第一個發(fā)夾探針H1的莖環(huán)結構，隨后，這個打開的H1會立即與第二個發(fā)夾探針H2雜交并打開H2的莖環(huán)結構，從而形成帶有ssDNA粘性末端的dsDNA，這又導致了另一個H1發(fā)夾探針的打開并且誘發(fā)HCR整個過程的延續(xù)，最終產生長的dsDNA產物。這個過程會持續(xù)進行直到這兩個發(fā)夾探針消耗殆盡或者形成的dsDNA產物的濃度達到閾值。

圖1 雜交鏈式反應的原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of hybrid chain reaction

3 HCR與納米材料結合的應用

3.1 與銀納米顆粒(AgNPs)的結合

銀納米材料具有優(yōu)良的導電導熱性能和穩(wěn)定的化學性質，特別是銀納米顆粒(AgNPs)具有表面等離子體共振效應，可以增強表面拉曼散射、表面熒光和催化活性。同時，由于AgNPs具有良好的生物活性和生物相容性，因而被廣泛應用于生物醫(yī)藥領域，如用作某些生物蛋白分子和藥物載體。由于介入的AgNPs還可以增強蛋白酶的催化能力，且其性質接近天然生物組織，不會對人體產生毒副作用，所以細胞可以在其表面生長，從而修復病變組織。AgNPs還具有良好的抑菌效果，Bryaskova等的研究表明，當使用AgNPs對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及銅綠假單胞菌進行抑菌檢測時，AgNPs的濃度顯著影響抑菌效果，而且濃度越高，抑菌效果越好，在0.4%時達到最好的抑菌效果[8]。

3.1.1 HCR與AgNPs結合的比色檢測法

近年來，基于金屬納米顆粒的比色測定方法由于其便于觀察以及制備過程簡單的優(yōu)點而備受關注[9]。在金屬納米粒子中，AgNPs常被用于比色檢測，相較于AuNPs，AgNPs表現(xiàn)出一定程度的優(yōu)勢：具有更高的摩爾吸光系數(shù)、具有優(yōu)異的光學性質、易于觀察其分散狀態(tài)和聚集狀態(tài)之間的顏色轉換[10, 11]。近年來，不同的AgNPs合成和修飾方法被發(fā)展起來用于核酸的微量檢測。例如，Guo等[12]設計了等離子體比色法，在酶的誘導下，AgNPs會在等離子體金納米星(AuNS)上生長，導致AuNS的顏色從藍色變?yōu)樯钏{色，再變?yōu)樽仙?，最終達到橙色。當以DNA為靶分子進行HCR后，可得DNA的檢測范圍從1×10-14到5×10-11mol/L，檢測限為2.6×10-15mol/L。

這種比色方法不僅可以用于檢測DNA，也可以實現(xiàn)對miRNA的檢測。Miao等[13]提出了一種基于HCR介導從而引起AgNPs局部表面等離子體共振(LSPR)發(fā)生改變的方法，用來檢測流感病毒H1N1的生物標志物miRNA-29a-3p，并將這種新型比色分析方法用于臨床診斷，如圖2所示。在這項研究中，阻滯劑DNA被固定在金固體表面，并與另一個HP0探針部分雜交，之后將金固體表面浸入到含有兩個DNA探針HP1和HP2以及AgNPs的膠體系統(tǒng)中，該系統(tǒng)中的HP1和HP2可穩(wěn)定AgNPs的狀態(tài)，使其不受二價陽離子的誘導聚集。當引入靶標miRNA-29a-3p時，該miRNA引發(fā)鏈置換反應，釋放HP0到溶液中，進而觸發(fā)HCR。此時，由于缺乏HP1和HP2，AgNPs發(fā)生聚集，并隨著miRNA濃度的增加，AgNPs膠體系統(tǒng)顏色由金黃色逐漸變淡。這種簡單設計的用于miRNA檢測的方法達到了1×10-12mol/L的檢測限。

圖2 基于HCR與AgNPs的用于miRNA分析的比色策略Fig.2 Colorimetric strategy for miRNA analysis based on HCR and AgNPs

3.1.2 HCR與AgNPs結合的電化學檢測法

為了制造便攜且價格合理的診斷裝置，全世界在開發(fā)和改進金屬生物檢測方面做出了大量努力?；谛滦图{米材料構建的電化學生物傳感器，由于其制備方法簡單、靈敏度高、響應速度快和成本低等優(yōu)點被廣泛應用于食品、制藥、環(huán)境監(jiān)測、生物醫(yī)藥等方面。AgNPs具有較強的電化學性質，如低氧化還原電位、清晰的伏安峰和優(yōu)異的電子傳遞速率[14, 15]。因此，基于AgNPs的生物分析被認為是檢測低濃度分析物的一種有效方法。Zhuang等[16]設計了一種新型無標記金屬生物電化學法，并將其用于超敏感檢測人類免疫缺陷病毒(HIV)相關基因片段。這種方法是基于靶觸發(fā)的遠程自組裝DNA納米結構和DNA雜交鏈式反應，首先在傳感器上固定捕獲探針，然后加入目標DNA以及含有引發(fā)鏈的檢測探針，由于堿基互補配對作用，捕獲探針、目標DNA以及檢測探針之間形成三明治式結構，檢測探針中的引發(fā)鏈在兩個不同的DNA發(fā)夾之間觸發(fā)串級雜交事件，產生類似交變共聚物的刻痕雙螺旋。帶負電荷的DNA聚合物可以遠距離吸附DNA結構上帶正電荷的金屬銀納米標簽，通過監(jiān)測電流的變化，從而間接得到該傳感器可檢測到的DNA的濃度范圍為1×10-15到1×10-14mol/L，檢測限為5×10-16mol/L。

電化學生物傳感器同樣適用于miRNA的快速、靈敏、選擇性檢測。Miao等[17]設計了具有識別發(fā)夾的四面體DNA，并將其固定在金電極上。四面體結構可以增加可接近性和反應性，并避免引入間隔分子。靶miRNA可以打開四面體DNA上的發(fā)夾，然后發(fā)夾上釋放的莖序列與AuNPs表面上的HCR-H0雜交并在電極上募集納米顆粒，游離的HCR-H0進一步與已被AgNPs標記的HCR-H1和HCR-H2發(fā)生HCR。這樣，大量的AgNPs被連接到電極上，通過檢測和分析來自AgNPs的剝離電流峰值，大大提高miRNA的檢測靈敏度，線性范圍從1×10-16到1×10-10mol/L，且檢測限為2×10-18mol/L。另外，該研究還檢測了人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)、人宮頸癌細胞(HeLa)、人腎小管上皮細胞(HK-2)和人乳腺癌細胞(MCF-7)這幾種細胞的裂解物中的miRNA-21，進一步證明了該方法的準確性與實用性。

3.2 與金納米顆粒(AuNPs)的結合

AuNPs是直徑為0.8～250 nm的締合膠體，膠體金顆粒一共分為3層，最外層離子使金溶液由于靜電作用而處于懸浮穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負電的水溶膠。AuNPs具有毒性低、生物相容性強、獨特的光學性質以及易于表面修飾等優(yōu)點，而且能夠精確控制其粒徑、形狀和表面性能[18]?；贏uNPs制備而成的多功能新型材料已被廣泛應用于食品安全檢測、環(huán)境安全監(jiān)測和醫(yī)學檢測分析等領域。此外，使用AuNPs進行敏感性檢測的器件，可以開發(fā)出不同的生物傳感器，實現(xiàn)對金屬離子[19]、分子[20]、蛋白質[21]、核酸[22, 23]等生物靶標的高效檢測。

在納米材料中，AuNPs在20世紀70年代就已作為信號標記分子應用于生物學領域，其主要標記對象是蛋白質和核酸。Faulk等[24]于1971年建立了一種電鏡免疫技術，首次實現(xiàn)了AuNPs標記技術與免疫技術的融合，該技術將蛋白質與AuNPs結合，并通過免疫學反應對細菌進行檢測。之后，Mirkin等[25]于1996年首次將AuNPs應用于核酸檢測，將AuNPs與巰基修飾的寡核苷酸片段結合用于制備一種核酸比色探針，通過比色分析AuNPs溶液顏色的變化實現(xiàn)對特定核苷酸序列的檢測。

3.2.1 基于比色策略的核酸檢測

在比色生物傳感器中，AuNPs以其獨特的性質，如光學、化學以及尺寸依賴的物理性質而引起了極大的關注。由于溶液中AuNPs的聚集過程，使溶液顏色從酒紅色變?yōu)樗{色，而AuNPs的解聚過程又會使溶液從藍色變回酒紅色?；谶@種可逆的顏色變化[26]，將AuNPs與HCR進行耦合，大量的比色生物傳感器被設計出來用于檢測不同的生物分子，如核酸[27]、蛋白質[28]、細胞表面的N-聚糖[29]等。Liu等[30]提出了一種將AuNPs的比色檢測法與DNA雜交鏈式反應擴增相結合的檢測系統(tǒng)。如圖3所示，該檢測系統(tǒng)包括發(fā)夾探針H1和H2、帶負電的AuNPs、鹽溶液。當引入靶標ssDNA時，靶DNA與發(fā)夾探針雜交并誘發(fā)HCR，形成帶切口的雙鏈DNA聚合物。這個長dsDNA暴露出其帶負電的磷酸骨架，由于靜電排斥作用，不能與帶負電的AuNPs結合。此時，在檢測體系中鹽離子的誘導下，游離的AuNPs發(fā)生聚集，使得反應液顏色從淺酒紅色變成藍色，且肉眼檢測的檢測限是1×10-10mol/L。該檢測系統(tǒng)具有一些突出的優(yōu)點，如避免了酶的引入、在完全匹配的靶寡核苷酸和具有單堿基對錯配的靶標之間表現(xiàn)出高度區(qū)分等，重點是通過目視檢查或可見光吸收光譜法便可實現(xiàn)快速、半定量檢測。

基于AuNPs的比色生物傳感器也可用于miRNA的敏感性檢測。Miao等[31]首次開發(fā)了一種基于正電荷AuNPs((+)AuNPs)析出的多功能、靈敏、無標簽的miRNA-21檢測傳感器。利用miRNA-21作為引發(fā)劑誘發(fā)HCR，形成長的dsDNA聚合物，(+)AuNPs可以通過靜電吸附作用結合到dsDNA表面，導致自身吸收光譜的下降并逐漸開始析出，然后可以直接利用UV-vis光譜法檢測上清液中(+)AuNPs的濃度。該方法對miRNA的檢測范圍為2×10-11到1×10-8mol/L，檢測限為6.8×10-12mol/L。此外，該實驗還證明，在包含有鹽、DNA、蛋白質和金屬離子的混合系統(tǒng)中，(+)AuNPs比(-)AuNPs更穩(wěn)定。這一證明不僅完善了該團隊提出的上述檢測方法，而且擴大了基于miRNA的傳感檢測范圍，開發(fā)了(+)AuNPs的新應用。以miRNA作為靶標引起檢測系統(tǒng)顏色變化的方法也可用于miRNA的定量檢測，該團隊將這一檢測策略用于MCF-7、Hela和MCF-10A等細胞中miRNA-21濃度的檢測。Li等[32]將用羧基修飾的磁珠(MNP)與兩個彼此互補的DNA(DNA1和DNA2)連接，在加入miRNA-203后，DNA2釋放并作為引發(fā)劑誘發(fā)已與AuNPs相連接的發(fā)夾探針H1和H2，并發(fā)生HCR，從而使得AuNPs彼此靠近并發(fā)生顏色的改變。隨著miRNA-203濃度的增加，該系統(tǒng)由淺酒紅色變?yōu)樽仙詈笞優(yōu)闇\藍色。該方法對靶miRNA的檢測限為1×10-13mol/L，有效提高了miRNA的檢測靈敏度。該團隊還利用MCF-7作為實際樣品進行了檢測，發(fā)現(xiàn)這種策略對MCF-7表現(xiàn)出較高的有效性與實用性。Cao等[33]首次開發(fā)了一種基于自組裝HCR的光聲(PA)納米探針，用于在乳腺腫瘤發(fā)生和化療期間高度靈敏地原位檢測miRNA-155，PA納米探針實現(xiàn)了對miR-155的體外高靈敏度和選擇性定量檢測，檢測限為2.5×10-10mol/L。

圖3 基于HCR與AuNPs的比色核酸檢測法示意圖Fig.3 Schematic of colorimetric nucleic acid detection based on HCR and gold nanoparticles

3.2.2 基于熒光策略的核酸檢測

AuNPs具有大的比表面積、易于表面功能化、在近紅外到紅外區(qū)域具有強的表面等離子吸收等特性，因而被作為熒光猝滅劑的一種[34]，其在長波長范圍內具有高的熒光猝滅效率并且可以同時猝滅多個熒光基團。利用AuNPs的熒光猝滅特性檢測核酸的方法主要有兩種：一種是納米火焰法，即在AuNPs表面修飾一種能與靶標分子特異性識別的寡核苷酸(識別鏈)，并與修飾有熒光基團的短鏈DNA(報告鏈)進行雜交，由于該短鏈DNA靠近AuNPs表面，熒光發(fā)生猝滅。在引入靶標核酸分子后，該核酸分子與識別鏈互補配對形成長而穩(wěn)定的雙鏈DNA，釋放報告鏈并遠離AuNPs，熒光恢復。通過熒光強度的變化能夠檢測靶標分子。另一種方法是將能特異性識別靶標分子且兩端分別連接巰基與熒光基團的分子信標組裝到AuNPs表面，此時，由于靠近AuNPs，熒光猝滅。當靶標分子存在時，它與分子信標雜交并打開其莖環(huán)結構，熒光基團遠離AuNPs，出現(xiàn)熒光。

2015年，Zhan等[35]根據(jù)AuNPs的熒光猝滅特性，構建了一種基于HCR的熒光生物傳感器用來靈敏性檢測活體細胞mRNA。首先開發(fā)了一種新的靜電組裝的核酸納米結構，該結構包括AuNPs核心、陽離子肽中間層以及分別被熒光受體基團和熒光供體基團標記的發(fā)夾DNA探針H1和H2組裝的靜電外層。由于AuNPs的有效猝滅，這兩種熒光團產生非常弱的熒光信號。當該組裝結構進入到細胞后，細胞中的mRNA作為引發(fā)劑誘發(fā)HCR，產生長的雙鏈DNA，并從構建的納米組件結構上解離下來。同時，在dsDNA形成過程中，熒光受體與熒光供體之間的距離拉近，發(fā)生熒光共振能量轉移，產生熒光。該實驗對mRNA的檢測限達到5×10-13mol/L。這種基于納米組件的HCR方法比標準HCR更快，有效提高了檢測速度。且這種納米組件具有優(yōu)異的生物相容性，比三甲基化肽對AuNPs修飾的策略更加簡單和低毒。

3.2.3 基于電化學策略的核酸檢測

Wang等[36]提出了一種基于HCR和AuNPs擴增用于DNA檢測的新型高靈敏度電化學發(fā)光生物傳感器。該傳感器靈敏度高、選擇性與重復性好，而且能夠達到5×10-15mol/L的檢出限。2019年，Bao等[37]通過金納米粒子/聚吡咯還原氧化石墨烯(Au/PPy-rGO)，成功開發(fā)了一種靈敏、有效的電化學miRNA傳感平臺。該方法將催化發(fā)夾組裝(CHA)和HCR組合起來，實現(xiàn)了靶向再循環(huán)以及信號的雙重放大。同樣對于檢測miRNA，Zhang等[38]則將具有優(yōu)異催化性能的ZnO納米棒用做 Luminol-O2共反應促進劑，構建了一種用于超靈敏檢測癌細胞中miRNA-21的生物傳感器，該方法為以Luminol為中心的電化學發(fā)光(ECL)生物分析提供了一種有前景的策略。該傳感器1×10-16至1×10-10mol/L表現(xiàn)出良好的線性，且檢測限低至1.86×10-17mol/L。

3.2.4 基于成像策略的核酸檢測

2015年，Jiang團隊[36]開發(fā)了一種新型靜電納米組裝結構，通過HCR進行活細胞中的信號放大。該團隊使用暗場共振光散射成像對Hela細胞中的mRNA進行超靈敏熒光激活成像，實現(xiàn)了接近每個細胞的單個分子的檢測限。2018年，Li等[39]設計了一種將AuNPs與HCR擴增相結合的檢測體系，通過使用暗視野顯微鏡來實現(xiàn)超靈敏核酸比色測定。由于HCR擴增后形成的長而穩(wěn)定的dsDNA無法吸附到AuNPs上，因此在鹽離子的誘導下，游離的AuNPs發(fā)生聚集。通過測量暗場圖像上黃色和紅色點的強度變化，可以準確量化靶DNA的濃度，檢測限為6.6×10-14mol/L。這種比色方法所得的檢測限和線性范圍要優(yōu)于現(xiàn)有方法，而且不需要耗時對AuNPs進行修飾。

3.3 與氧化石墨烯(GO)的結合

氧化石墨烯(graphene oxide,GO)是1859年Brodie用強酸處理石墨后得到的一種石墨烯衍生物[40]，它含有羧基、羥基、環(huán)氧基等含氧基團，具有電學性能優(yōu)良、導熱性好、力學強度高、比表面積大等特點[41-43]。近年來，GO由于制備成本低、易合成、以及良好的水溶性和生物相容性而被廣泛用于DNA檢測、重金屬離子檢測等方面，以及食品分析、生物成像、生物醫(yī)學等領域[43, 44]。其中，生物活性分子的檢測引起了研究者的極大興趣，特別是利用GO-DNA的熒光傳感器進行的各種分子檢測。

在大多數(shù)熒光生物傳感中，熒光共振能量轉移起著重要的作用。熒光共振能量轉移(FRET)是指當一個熒光基團(供體)的發(fā)射光譜與另一個熒光基團(受體)的吸收光譜具有一定的重疊，且距離比較近時，就會產生熒光能量從供體向受體轉移的現(xiàn)象。GO在FRET過程中表現(xiàn)出優(yōu)異的猝滅能力，所以當標記有熒光基團的單鏈DNA、dsDNA或發(fā)夾型DNA等吸附到GO基底時，由于熒光基團與GO距離較近，熒光被猝滅。當存在有靶標分子時，它能特異性識別探針，使得熒光基團遠離GO表面，熒光恢復。

基于GO的熒光核酸檢測法不僅操作簡單，而且選擇合適的熒光分子還能有效降低背景信號[45]，這些熒光分子主要包括有機熒光染料和熒光納米粒子兩種。Zhang等[46]開發(fā)了一種基于銀納米團簇(AgNCs)與GO結合的通過HCR進行DNA檢測的熒光生物傳感器。如圖4所示，首先在能夠部分互補的發(fā)夾探針H1和H2的末端分別標記上AgNCs，在沒有靶標分子(TDNA)時，由于H1與H2的穩(wěn)定性，不能觸發(fā)HCR。此時，由于發(fā)夾探針的另一游離端能夠通過π-π堆積緊密吸附到GO表面，使得AgNCs靠近GO表面，熒光猝滅。但是在引入TDNA后，TDNA會與H1與H2發(fā)生HCR，產生多條長的dsDNA。這種dsDNA與GO的結合力比較弱，很容易從GO表面分離下來，進而能夠產生較強的熒光信號。Zhang等在該實驗方案中以人類免疫缺陷病病毒DNA(HIV-DNA)作為靶標分子，而且對HIV-DNA的檢測限達到1.18×10-9mol/L，可用于臨床樣品。Yuan等[47]也利用GO的熒光猝滅特性設計了一種在同一個GO紙芯片上檢測兩種DNA(花生和大豆)并能有效區(qū)分其他DNA的方法，達到了1×10-9mol/L的檢測限。這一檢測方法不需要酶的參與，且紙芯片廉價、容易制備，有效縮短了檢測時間，降低了檢測成本。最近，Tang等[48]對HCR與GO結合的檢測方案進行改進，提出了金黃色葡萄球菌的無酶熒光檢測方法。該團隊提出，協(xié)同使用FAM熒光基團和熒光染料SYBR Green I從而大幅增強擴增熒光信號，且在最佳條件下，對16SrRNA有更低的檢測限，達5×10-11mol/L。該方法成功應用于牛奶中的金黃色葡萄球菌的檢測，檢出限為4×102CFU/mL。

圖4 基于HCR與GO的用于核酸的熒光檢測示意圖Fig.4 Schematic of fluorescence detection of nucleic acids based on HCR and GO

GO與HCR結合的傳感平臺也可用于miRNA的檢測。例如，F(xiàn)an等[49]提出了一種基于GO的熒光生物傳感器，將其用于miRNA的檢測。在該實驗中，利用let-7a這一miRNA作為靶標分子，發(fā)夾探針H1和H2的粘性末端帶有熒光基團，而且H1和H2通過π-π堆積連接到GO表面，熒光被GO有效猝滅。在加入let-7a、解旋酶RecQE和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)后，RecQE在ATP的驅動下與發(fā)夾探針結合并解開發(fā)夾探針的雙鏈部分，使得let-7a可以快速觸發(fā)HCR從而形成雙鏈DNA產物，并使熒光顯著增強。這一檢測策略對miRNA的檢測限達到4.2×10-15mol/L，同時，這種解旋酶輔助的HCR/GO傳感平臺的靈敏度比沒有酶的普通HCR/GO傳感平臺高2個數(shù)量級，并有效縮短了檢測時間。

3.4 與其它金屬納米材料的結合

除了以上論述的幾種應用比較廣泛的納米材料，還有一些其他的納米材料與HCR結合用來檢測核酸，本文主要論述銅納米材料、鉑納米材料以及磁性納米珠。近年來，銅納米材料受到研究人員的廣泛關注，特別是具有出色的光穩(wěn)定性和生物相容性的低毒素或無毒素的銅納米團簇(CuNCs)[50]。Liao等[51]通過將原位生成的銅納米團簇作為電化學發(fā)光體和二氧化鈦(TiO2)作為核心加速器，成功構建了用于檢測乳腺癌潛在生物標志物miRNA-21的超靈敏生物傳感器。實驗表明，這一生物傳感器在1×10-16到1×10-10mol/L濃度范圍內具有明顯的線性關系，檢測限為1.905×10-17mol/L，而且已成功應用于人宮頸癌與人乳腺癌細胞裂解液的檢測。

2019年，Guo等[52]提出了基于HCR和酶誘導金屬化的雙信號放大策略，構建了用于miRNA-21的超靈敏電化學傳感器，這種雙重擴增策略將電化學信號增強了約120倍，并將其檢測限有效降低至1.2×10-16mol/L。該方法靈敏度高、特異性強、線性動態(tài)范圍寬，在疾病的早期診斷中具有很大的潛力。

Chen等[53]則首次提出使用DNA與鉑納米顆粒(PtNPs)之間的納米組裝進行比色法核酸檢測。在室溫下簡單地將含有Pt前體(K2PtCl4)和DNA的溶液與NaBH4溶液混合來制備DNA-Pt雜化納米顆粒，這種雜化納米顆粒幾乎沒有過氧化物酶樣活性。將TMB/H2O2比色底物溶液以及DNA-Pt雜化納米顆粒溶液加到紙基上，該雜化溶液幾乎無催化效率，因而會在紙的表面產生可見的藍色沉淀。將靶標DNA與生物素修飾的捕獲探針(S1)進行雜交以形成帶有生物素粘性末端的探針(P1)，然后P1通過生物素-鏈霉親和素相互作用與磁珠進行結合。磁選后收集上清液并用于合成DNA-Pt雜化納米顆粒。當存在靶DNA時，發(fā)夾探針H1和H2組裝在一起并且在磁分離后可以有效地去除，合成的DNA-Pt雜化納米顆粒通過上述紙基法表現(xiàn)出一定的顏色變化。Chen等提出的這種DNA與PtNPs的非共價自組裝過程不僅快速方便，而且能夠有效測出靶DNA的濃度值。

4 結 語

從以上論述可以看出，AuNPs、AgNPs、GO以及文中涉及的其它金屬納米材料等都具有一些優(yōu)良的生物性質?；贖CR的生物傳感器是一種無需酶的參與、在常溫下就可進行反應的簡單、快速、高靈敏、低成本的生物傳感器。將這種基于HCR的生物傳感器與以上幾種納米材料結合，已經成功用于核酸、蛋白質等生物分子以及金屬離子的高靈敏甚至超靈敏檢測。然而，對于一些非核酸類的物質如蛋白質、細胞等，有時需要設計合適的適配體才能進行檢測，因此未來可以開發(fā)一些能夠與HCR結合的新材料、篩選一些更有親和力的核酸適配體，用于蛋白質、細胞等物質的現(xiàn)場、快速、高靈敏性檢測。