燈盞花素DSPE-PEG 聚合物膠束的制備及體外性質(zhì)研究

顏寅萍，李霞，吳俊珠

(云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(大理大學(xué))，大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理)

0 引言

燈盞細(xì)辛又名燈盞花、燈盞草，為菊科飛蓬屬植物短葶飛蓬的干燥全草，以根或全草入藥，主要分布于我國(guó)西南地區(qū)，云南、廣西、湖南、貴州等地，用于治療頭痛、風(fēng)濕痛、腦血管疾病引起的癱瘓；對(duì)高血壓、腦溢血、腦血栓形成、腦栓塞、多發(fā)性神經(jīng)炎、慢性蛛網(wǎng)膜炎及其后遺癥具有較好療效，并對(duì)風(fēng)濕病、冠心病也有一定療效[1,2]。燈盞花主要化學(xué)成分為黃酮類和黃酮苷類、芳香酸脂類、揮發(fā)性油類、咖啡酰類、單體化合物類等[3]。燈盞花素 (breviscapine) 為燈盞花的有效成分，是燈盞花中的一類總黃酮，內(nèi)含燈盞花甲素和乙素，其中燈盞乙素占90% 以上。燈盞乙素(scutellarin) 又名野黃芩苷，是對(duì)心腦血管疾病起效的活性成分。燈盞乙素具有改善腦梗塞，增加腦血流量，降低血管阻力和抗血小板凝聚的作用；促進(jìn)纖溶，具有良好的溶栓作用；臨床用于心腦血管疾病，如腦供血不足、腦出血所致后遺癥、急性腦梗死，缺血性腦卒中和冠心病等治療[4-7]。目前已經(jīng)上市的燈盞花素制劑有口服制劑、注射劑，存在半衰期短、生物利用度低等問(wèn)題[8]。

兩親性聚合物在水溶液中能自發(fā)形成聚合物膠束，親水性嵌段形成外殼，疏水性嵌段形成內(nèi)核，在水中形成結(jié)構(gòu)緊密的核-殼結(jié)構(gòu)，可以包載脂溶性分子，具有良好的穩(wěn)定性、體內(nèi)緩慢釋藥，增加藥物的穩(wěn)定性和提高生物利用度的作用[9]。王志玉等以DSPEPEG 2000 為載體材料制備多西紫杉醇膠束，所制備出來(lái)的膠束包封率高，24 h 累積釋放百分率小于30%[10]。二硬脂?；字Ｒ掖及? 聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000) 是在體內(nèi)可降解并經(jīng)美國(guó)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的可用于人體的藥物載體材料，具有良好的生物相容性和安全性[11]。聚合物膠束作為納米遞藥系統(tǒng)可以達(dá)到緩釋及延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間的目的。本文以DSPE-PEG 2000 為載體材料，采用薄膜水化法將難溶性藥物燈盞花素制備成燈盞花素DSPE-PEG 聚合物膠束，對(duì)其包封率和體外釋放度進(jìn)行研究，為后續(xù)開(kāi)展體內(nèi)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

KQ5200DB 型數(shù)控超聲波清洗器( 昆山市超聲儀器有限公司)，TU-1901 雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)( 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，HWS-24 電熱恒溫水浴鍋( 上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，Agilent1200 高效液相色譜儀( 美國(guó)Agilent G1314B VWD 型紫外檢測(cè)器)，TGL-20B 離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，Zetasizer Nano ZS90 粒度測(cè)定儀(英國(guó) Malvern 公司)，JEM-2100F 型透射電鏡(日本電子)，LYZ 恒溫?fù)u床(上海龍躍儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 材料

燈盞花素標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，批號(hào)：Z17O7X22900)，燈盞花素原料藥(南京景竹生物科技有限公司)，二硬脂?；字Ｒ掖及? 聚乙二醇2000(1，2-distearoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000])(DSPE-PEG2000)( 西安瑞喜生物科技有限公司，純度≥95%)，色譜甲醇(利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司)，其他試劑均為實(shí)驗(yàn)室分析純級(jí)別。

2 方法

2.1 燈盞花素聚合物膠束的制備

采用薄膜水化法制備燈盞花素聚合物膠束，稱取20.0mg DSPE-PEG 2000 加入氯仿中，超聲溶解，稱取4.0mg 燈盞花素加入甲醇中，超聲溶解，將燈盞花素的甲醇溶液滴加到DSPE-PEG 2000 溶液中，氮?dú)庀麓蹈?，除盡有機(jī)溶劑，形成含藥脂膜，加入超純水8mL 后，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，37℃水合45min，室溫放置1h 后，將制得的膠束過(guò)φ0.22um 濾頭[12]。

2.2 燈盞花素聚合物膠束的表征

取一滴燈盞花素聚合物膠束滴于銅網(wǎng)上，空氣中放置10min，待干燥后滴加2% 的磷鎢酸溶液，放置5min，干燥后測(cè)定。用ZS90 型粒度測(cè)定儀測(cè)定膠束的粒徑、PDI 指數(shù)和zeta 電位。

2.3 波長(zhǎng)的選擇

吸取適量燈盞花素溶液，放入棕色量瓶中，加入適量的甲醇溶液進(jìn)行稀釋、定容至刻度線處，搖勻，配置成0.01mg/mL 的燈盞花素溶液，以甲醇為空白參比，用UV 法進(jìn)行紫外吸收波長(zhǎng)掃描來(lái)確定其最大吸收波長(zhǎng)。吸取適量的DSPE-PEG2000 儲(chǔ)備液，用甲醇溶解稀釋，用UV 法進(jìn)行紫外吸收波長(zhǎng)掃描。

2.4 色譜條件

色譜條件：色譜柱：ZORBAX SB-C18 (4.6×250mm，0.5 um)；流動(dòng)相：( 甲醇：0.1% 磷酸溶液)。流速：0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：335nm；柱溫 25℃；進(jìn)樣量為10ul。

2.5 溶液的制備

0.1 mg/mL 的燈盞花素樣品溶液的制備：精密稱取1.0mg 的燈盞花素原料藥，放入10mL 棕色容量瓶中，加入適量甲醇溶液待其完全溶解后定容，制備0.1mg/mL 的燈盞花素樣品溶液。

0.1 mg/mL 的燈盞花素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱取1.0mg 的燈盞花素標(biāo)準(zhǔn)品，放入10mL 棕色容量瓶中，加入適量甲醇溶液待其完全溶解后定容，制備0.1mg/mL 的燈盞花素標(biāo)準(zhǔn)溶液。用甲醇溶液做為空白組，按照上述色譜條件，用HPLC 檢測(cè)。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

配制不同濃度的燈盞花素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度分別為4.0，6.0，8.0，10.0，15.0，20.0，25.0，30.0，35.0，40.0ug/mL，按照HPLC 法在335nm 處對(duì)這一系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行測(cè)定，得出這一系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積(S)，以峰面積值對(duì)質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.7 精密度及方法回收率考察

分別配制二組低、中、高(20.0、30.0、40.0ug/mL) 三種不同濃度的燈盞花素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)濃度設(shè)置三個(gè)平行組，第一組標(biāo)準(zhǔn)品樣品進(jìn)HPLC，考察回收率。第二組標(biāo)準(zhǔn)品樣品同一天內(nèi)測(cè)定5次峰面積(S)，考察其日內(nèi)精密度，計(jì)算RSD。同法，用上述第二組標(biāo)準(zhǔn)品樣品每天測(cè)定1 次連續(xù)測(cè)定3 天峰面積(S)，考察其日間精密度，計(jì)算RSD。

2.8 燈盞花素聚合物膠束中燈盞花素包封率的測(cè)定

采用微孔濾膜法測(cè)定藥物包封率：精密吸取過(guò)濾后的燈盞花素聚合物膠束，加甲醇破壞膠束，以4000 r/min 的速度離心10 min，取上清液至10 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相定容，φ0.22μm 微孔濾膜濾過(guò)，HPLC 法測(cè)定包封率。

2.9 釋放介質(zhì)的選擇

燈盞花素溶液的穩(wěn)定性隨溫度和pH 升高而降低，在進(jìn)行體外釋放研究時(shí)，為了接近體內(nèi)的生理?xiàng)l件，釋放介質(zhì)的pH 選擇在7.4，溫度選擇在37℃。有研究表明一定濃度的EDTA-2Na 能明顯改善燈盞花素的穩(wěn)定性[13]。最終選擇的緩沖介質(zhì)為pH 7.4 的Tris-EDTA 緩沖液。

2.1 0 聚合物膠束的體外釋放實(shí)驗(yàn)

分別取0.37mg/mL 的燈盞花素聚合物膠束及0.37mg/mL 的甲醇溶解的燈盞花素原料藥各2mL，分別放入預(yù)先處理好的透析袋中，每個(gè)樣品配置3 份。將透析袋分別放入20.0mL 釋放介質(zhì)中，采用恒溫振蕩法，37℃水浴避光恒速100r/min 振搖，分別在0.083、0.17、0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、12、24h，用移液槍精密吸取1mL 釋放介質(zhì)，稀釋后采用HPLC 法測(cè)定，補(bǔ)充同溫等量的釋放介質(zhì)。采用HPLC 法測(cè)定樣品的峰面積(S)，計(jì)算累計(jì)釋放率，繪制釋放曲線。

3 結(jié)果

3.1 燈盞花素聚合物膠束的表征

結(jié)果見(jiàn)表1 和圖1、圖2、圖3。燈盞花素聚合物膠束zeta 電位為-29.6mV。在TEM 觀察下呈形狀大小均勻的球形或類球形。

3.2 波長(zhǎng)的選擇

分別取燈盞花素甲醇溶液和DSPE-PEG 2000 甲醇溶液進(jìn)行紫外掃描，確定燈盞花素檢測(cè)波長(zhǎng)，其結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4 結(jié)果顯示，燈盞花素在289nm 和335nm 都有顯著吸收峰，DSPE-PEG 2000 在289nm 波長(zhǎng)處對(duì)燈盞花素有一定干擾，而在335nm 波長(zhǎng)處幾乎沒(méi)有吸收。故選擇335nm 為含量測(cè)定的紫外吸收波長(zhǎng)。

3.3 色譜條件

HPLC 結(jié)果見(jiàn)圖5。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

其 線 性 方 程 為：Y=13.77X+4.2819，R2=0.9995。 表 明 在4.0～40.0ug/mL 范圍內(nèi)，峰面積(S) 和不同濃度(C) 的燈盞花素溶液之間存在著良好的線性關(guān)系。

3.5 精密度及方法回收率考察

日 內(nèi) 精 密 度RSD 為0.50%，0.46%，0.17%，日 間 精 密 度RSD 為0.16%，0.05%，0.02%，平 均 回 收 率 為99.02%，98.80%，101.34%，RSD 分別為0.13%，0.10%，0.03%。RSD 值均小于3%，滿足含量測(cè)定的要求。

表1 燈盞花素聚合物膠束的表征

圖1 燈盞花素聚合物膠束的粒徑分布圖，a 空白膠束b 燈盞花素聚合物膠束

圖2 燈盞花素聚合物膠束的zeta 電位分布圖

圖3 燈盞花素聚合物膠束TEM 圖

圖4 燈盞花素和DSPE-PEG 2000 的UV 吸收光譜圖

圖5 HPLC 色譜圖 A：燈盞花素標(biāo)準(zhǔn)品，B：燈盞花素原料藥樣品，C：破乳后的燈盞花素

3.6 燈盞花素聚合物膠束中燈盞花素包封率的測(cè)定

結(jié)果見(jiàn)表2，燈盞花素/DSPE-PEG 2000 的包封率為(83.78±2.52)%，載藥量為(14.3±1.89)%(n=3)，且重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。

表2 燈盞花素聚合物膠束的包封率和載藥量

3.7 燈盞花素聚合物膠束的累積釋放曲線

結(jié)果如圖6，5h 時(shí)原料藥、載藥聚合物膠束的累積釋放百分率分別為86.76% 和57.89%。24h 時(shí)原料藥、載藥聚合物膠束的累積釋放百分率分別為100%和75.35%。結(jié)果提示，燈盞花素聚合物膠束具有一定的緩釋作用。

圖6 燈盞花素累計(jì)釋放百分率(n=3)

4 討論

本研究以DSPE-PEG 2000 為載體材料采用薄膜水化法制備燈盞花素聚合物膠束，對(duì)制備的燈盞花素膠束進(jìn)行體外性質(zhì)研究，聚合物膠束具有適宜的包封率。體外釋放實(shí)驗(yàn)表明，燈盞花素聚合物膠束相對(duì)于燈盞花素原料藥具有一定的緩釋作用，可能對(duì)燈盞花素在血漿中的藥物濃度的維持具有幫助，本研究可為后續(xù)開(kāi)展體內(nèi)研究提供參考依據(jù)。