乳腺癌的傅里葉變換紅外光譜成像研究

陸燕飛，朱勇康，趙遠，徐新宇，尹建華*

(1.南京航空航天大學 自動化學院，南京 211106；2.江蘇省腫瘤醫(yī)院 病理科，南京 210009)

1 引言

乳腺癌是全世界女性中最常見的癌癥[1]。據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的2018年全國最新乳腺癌報告，在中國，女性乳腺癌的發(fā)病率和死亡率分別為女性惡性腫瘤的第1位和第5位。21世紀以來，我國女性乳腺癌發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢[2]。乳腺癌患者的生存率與診斷時癌癥的等級密切相關(guān)[3]。因此，對乳腺癌進行精確/分子的研究、及早的發(fā)現(xiàn)和準確的診斷對提高乳腺癌患者的預后和生存率具有決定性意義。

目前，進行乳腺癌研究的方法包括影像學檢查[4](乳腺鉬靶、超聲檢查、CT和MRI掃描)、前哨淋巴結(jié)活檢[5]、細針穿刺吸取細胞檢查[6]、手術(shù)切除活檢[7]、腫瘤標志物檢測[8]、血液學檢查[9]等。除此之外，光譜技術(shù)也被廣泛地應用于癌癥的研究[10-12]。

傅里葉變換紅外(FTIR)光譜與顯微鏡的結(jié)合已廣泛應用于化學工業(yè)和法醫(yī)學中的化學鑒定和結(jié)構(gòu)分析，并且被公認為組織病理學研究的新興工具[13-15]。FTIR成像基于組織中分子的振動躍遷吸收紅外光，提供了構(gòu)成細胞和組織所有大分子(例如DNA，RNA，脂質(zhì)，蛋白質(zhì)和碳水化合物)的化學組成以及空間分布信息，而不需要對組織切片進行任何特定的染色或添加試劑[16-18]。與定性組織染色相比，這些圖像還包含定量信息，可以提取光譜進行數(shù)值分析[19-20]。組織的光譜特征高度代表其組織病理學狀態(tài)，不僅可用于區(qū)分健康和病理標本，還可用于區(qū)分不同類型或等級的腫瘤病變[21-22]。Frederik等[23]通過FTIR成像和新型的分類器自動鑒定新鮮冰凍肺癌組織切片的類型和腺癌亞型。Jayakrupakar等[24]使用紅外光譜微成像以非破壞性方式對10個冷凍結(jié)腸組織樣品(來自5名患者的5個非腫瘤和腫瘤對)進行成像。通過多變量聚類方法處理光譜圖像，以無標記方式識別組織。Xavier等[25]使用紅外光譜成像以及基于遺傳學的新型機器學習技術(shù)進行前列腺癌的診斷，表明這種方法可以改善目前診斷前列腺癌的臨床實踐。M. Verdonck等[26]將FTIR成像與PLS-DA結(jié)合，有效地鑒定石蠟包埋乳房組織切片中存在的主要細胞類型，即上皮細胞、淋巴細胞、結(jié)締組織、血管組織和紅細胞，并且可以區(qū)分健康和腫瘤乳腺上皮細胞。因此，F(xiàn)TIR成像或可成為診斷乳腺癌的有力工具。本文將通過FTIR成像以及光譜分析，對健康和癌變?nèi)橄俳M織進行對比研究。

2 實驗材料與方法

2.1 樣本制備

健康和癌變?nèi)橄俳M織由江蘇省腫瘤醫(yī)院術(shù)中切除后留存。經(jīng)患者知情同意后，共有5組乳腺組織用于FTIR成像實驗。癌變組織樣本和健康組織樣本切成2 mm×2 mm×2 mm大小快速冰凍，然后使用低溫切片機(Leica CM 1950, Germany)在-20℃的條件下將其切成10m厚的切片，最后在室溫下風干用于FTIR成像實驗。

2.2 實驗儀器及數(shù)據(jù)采集

實驗采用PerkinElmer公司的Spotlight-400傅里葉變換紅外光譜成像系統(tǒng)。經(jīng)背景掃描后，再對健康和癌變?nèi)橄俳M織切片進行成像掃描，獲得可見光圖像和(全吸收)紅外光譜圖像。FTIR成像的單個像素大小為6.25m×6.25m，2次掃描。紅外光譜掃描范圍是4000～744 cm-1，光譜分辨率為16 cm-1。

2.3 光譜圖像分析方法

FTIR圖像中每個像素代表了對應位置的一條紅外光譜，并且通過偽彩色表示該像素點對紅外光的平均吸光度[27]，同時特征帶圖像分析可以直觀地展現(xiàn)樣本切片中各種成分的空間分布以及它們的含量變化。首先對所采集的FTIR圖像提取紅外光譜；再以該光譜的兩個特征譜帶的吸光度比值為第三維變量自動繪制圖像(特征比圖像)。紅外光譜圖像的平均或單像素光譜的提取及光譜分析是采用該成像系統(tǒng)自帶的Spotlight 400軟件完成，并用來生成特征帶吸光度比的紅外圖像。

3 結(jié)果與討論

3.1 FTIR圖像分析

圖1所示為較具代表性的乳腺組織切片圖像，分別為健康和癌變組織切片的全吸收FTIR圖像及對應的可見光圖像。通過這些圖像對比發(fā)現(xiàn)無論是健康組織還是癌變組織，其成分和形貌微觀上都是非均勻分布，意味著可能的異質(zhì)結(jié)構(gòu)。然而它們卻無法有效區(qū)分健康和癌變?nèi)橄俳M織，因此進行光譜分析和圖像分析是必要的。

圖1 健康(a)和癌變(b)乳腺組織樣本的全吸收紅外及可見光圖像，圖像大小為1000 m×250 m

Fig.1 The corresponding visible and (total abs.) FTIR images of healthy (a) and cancerous (b) breast samples. The size of each image is of 1000m×250m

圖2所示為提取自健康乳腺組織(圖1(a))中某一像素點的紅外光譜，各個特征峰的分配見表1[28-30]。其中各特征帶1740、1455、1400 cm-1都和脂類相關(guān)，1650、1550 cm-1來自蛋白質(zhì)分子，1238、1087 cm-1則與核酸相關(guān)。這些特征帶的分配或者它們之間的吸光度比值均含有較強的大分子濃度信息，暗示著在不同生理或病癥條件下的生物大分子的構(gòu)成甚至結(jié)構(gòu)的變化。具體如下文及圖3所示。

圖2 健康乳腺組織切片的紅外光譜

表1 乳腺組織FTIR譜帶的分配[28-30]

Table 1 The characteristic IR bands of breast tissue and assignments

波數(shù)(cm-1)振動模式分配1740νC=O脂類1650AmideI蛋白質(zhì)1550AmideII蛋白質(zhì)1455δC-H脂類相關(guān)1400δC-H,δC-O-H脂類相關(guān)1238νas,PO-2核酸相關(guān)1160νC-O,δC-O-H,δC-O-C碳水化合物1087νs,PO-2核酸相關(guān)

注：ν 伸縮振動，νs對稱伸縮振動，νas反對稱伸縮振動，δ 面內(nèi)彎曲振動

圖3所示為健康和癌變組織切片的FTIR圖像在不同特征帶吸光度比(峰面積比)的情況下生成的特征比圖像。圖像中顏色的深淺代表該比值的高低(A表示吸光度)，反映了組織中特征成分含量的變化。從圖中顏色對比可以直觀發(fā)現(xiàn)，相對于健康組織，癌變組織的特征吸光比A1087/A1455、A1238/A1455、A1550/A1455、A1650/A1455明顯增加；A1160/A1087、A1740/A1550則減小。圖像結(jié)果直觀地反映了健康和癌癥乳腺組織成分含量的變化。

具體來看，A1550/A1455、A1650/A1455為蛋白質(zhì)相對于脂類的含量。在癌變組織中癌細胞代謝旺盛消耗能量，脂肪在組織癌變時難以積累，含量減少[31]。與此同時，蛋白質(zhì)合成增加，所以A1550/A1455和A1650/A1455比值增加。A1740/A1550表明脂質(zhì)與蛋白質(zhì)的含量比，同上，很容易理解癌變組織中的比值小于健康組織。

A1087/A1455、A1238/A1455表現(xiàn)為核酸相對于脂類的含量。與健康組織相比，癌變組織中癌細胞增加，DNA無限復制。并且，癌細胞易出現(xiàn)多倍體，導致染色體組數(shù)增加[32]。因此，癌變組織中核酸含量增加，同時伴以脂肪減少，導致癌變時A1087/A1455和A1238/A1455比值明顯增加。1160 cm-1譜帶為碳水化合物的吸收帶，隨著癌細胞的劇烈分裂，大量的糖作為營養(yǎng)物被消耗并且核酸含量相對增加，因此，癌變時A1160/A1087比值減小。

通過以上分析可見，對于健康和癌變的不同樣本，F(xiàn)TIR特征帶圖像分析可以明確給出健康與癌變組織的差異以及癌變過程中主要大分子含量的變化。

3.2 FTIR光譜分析

圖4是從健康和癌變?nèi)橄俳M織切片的FTIR圖像中提取的平均紅外光譜，反映的是整個成像樣本的平均效果(光譜)。圖中可見，2條譜線在1740(1455), 1650及1160 cm-1處有明顯的特征區(qū)別，分別反映了癌變過程中脂肪含量的減少、蛋白質(zhì)的增加及碳水化合物含量的降低。然而卻不能表征出癌變過程中核酸含量的變化。為此，分別計算各個譜帶的吸光度及它們之間的比值(含平均誤差)，如表2所示。從表2中可以發(fā)現(xiàn)健康與癌變樣本組織之間的變化規(guī)律，癌組織的A1087/A1455、A1238/A1455、A1550/A1455、A1650/A1455比值相對于健康組織明顯增大，A1160/A1087、A1740/A1550則減小，這些結(jié)果與實驗中多組乳腺組織樣本的FTIR圖像分析是一致的。

圖3 健康和癌變?nèi)橄俳M織的特征譜帶吸光度比值的紅外圖像。圖像大小為1000 m×250 m

Fig.3 FTIR images of the characteristic band absorbance ratios of healthy and cancerous breast tissues, The size of each image is of 1000m×250m

圖4 健康和癌變?nèi)橄俳M織切片F(xiàn)TIR圖像的平均光譜

Fig.4 The mean IR spectra extracted from entire slices of healthy and cancerous breast tissues, respectively

綜上，圖1和3中FTIR圖像不僅實現(xiàn)了樣本的微觀成像，相較于FTIR成像的單像素大小(6.25m×6.25m)來說，某種程度上也體現(xiàn)了組織樣本局部的綜合效果。因此圖3的結(jié)果一定程度上一致于成分含量變化的平均效應。如果進一步縮小圖像大小，在更微小區(qū)域體現(xiàn)不同樣本成分含量的變化，則隨機變化增加，有時會得出和平均結(jié)果不同的結(jié)果，這則體現(xiàn)出生物組織樣本內(nèi)部結(jié)構(gòu)的非均一化或異質(zhì)異構(gòu)的存在，這一點在圖1的全吸收FTIR圖像及可見光圖像甚至圖3的比較中也是明顯可見的。因此，對FTIR圖像分析，根據(jù)所選擇區(qū)域大小及圖像處理的方式方法，如單像素取譜、整區(qū)域提取平均光譜、單一特征帶成像(chemimap)及特征帶間吸光度比圖像(chemimap of ratio)等，證實FTIR成像技術(shù)可同時實現(xiàn)微觀測量和小面積宏觀測量、主成分含量變化分析等，從而可滿足于不同診測的需求。

表2 健康及癌變?nèi)橄俳M織平均紅外光譜的吸光度(峰面積)比

Table 2 Absorbance (peak area) ratios of mean IR spectra of healthy and cancerous breast tissues with mean error in brackets

吸光度比健康(6.0%)癌變(9.0%)A1087/A14551.86195.5231A1238/A14551.35143.5650A1550/A14553.52659.6962A1650/A14557.978923.8922A1160/A10870.15470.0022A1740/A15500.26640.0057

4 結(jié)論

本文采用FTIR成像技術(shù)對乳腺組織切片進行研究，通過FTIR圖像分析表明FTIR成像可以用于準確區(qū)分判斷健康和癌變?nèi)橄俳M織。結(jié)合FTIR光譜分析結(jié)果，更加證明了特征比圖像的判別準確性和直觀性。本研究不僅從分子層次對乳腺的癌變進行了研究，同時也進一步表明了FTIR成像技術(shù)在乳腺癌診斷方面的可行性，是進行基礎(chǔ)研究甚至是臨床醫(yī)學診斷的一種準確有效的工具手段。如果進一步結(jié)合圖像處理和算法進行深度分析處理，有可能獲得事半功倍準確高效的研究結(jié)果，有效促進未來的醫(yī)學發(fā)展和實驗室研究，相信這也是本領(lǐng)域未來的一個熱點方向。

致謝：感謝國家自然科學基金(61378087)，江蘇省六大人才高峰計劃(SWYY-034)，江蘇省研究生科研與實踐創(chuàng)新計劃項目(KYCX18_0321)資助，感謝上海海洋大學許長華副教授課題組及Perkin Elmer公司工程師的實驗協(xié)助。