高效液相色譜法測定趕黃草中槲皮素的含量

鐘茂團，何德中，林劍，鐘小莉

（四川逢春制藥有限公司，四川 中江）

0 引言

隨著對中醫(yī)藥學研究的增多，加之藥物檢測技術(shù)的不斷發(fā)展進步，使得中藥有效成分的研究取得了較大成效。通過測定不同中藥中有效成分的含量，能夠更好地控制中藥制劑的質(zhì)量。趕黃草為虎耳科植物扯根菜的干燥全草，臨床用于保肝退黃，制劑廠家用于生產(chǎn)肝蘇顆粒、肝蘇糖漿等。標準收載于《湖南省中藥材標準》2009 年版[1]，標準中沒有含量測定。筆者參考肝蘇顆粒，用高效液相色譜法測定槲皮素的含量，結(jié)果專屬性強、耐用性好、精密度高，認為此法可用于測定趕黃草中的槲皮素含量。具體實驗方法如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀，紫外分光光度計，電子分析天平，槲皮素對照品由中檢院提供，其余試劑為分析純。

2 檢測波長

取槲皮素對照品溶液（濃度為10.0μg/ml），在200-600nm 波長處進行掃描，最大吸收波長為370nm，所以選擇檢測波長為370nm。

3 測定條件

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.2%磷酸水（45 ∶55）為流動相，流速1.0ml/min，檢測波長370nm。理論板數(shù)按槲皮素峰計不低于1800。

4 供試溶液的制備

4.1 對照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥24h 的槲皮素對照品0.01250g，置于250ml 量瓶中，用50% 甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2ml，置10ml 量瓶中, 用50% 甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1ml 中含槲皮素10μg）。

4.2 提取溶劑的選擇

取趕黃草藥材細粉適量，共4 份，分別加10%鹽酸甲醇溶液、2.3% 鹽酸甲醇溶液、1% 鹽酸甲醇溶液、甲醇溶液，加熱回流3h，比較含量變化，結(jié)果：用2.3%鹽酸甲醇溶液作提取溶劑，藥材中槲皮素的提取較完全。結(jié)果見表1。

表1 提取溶劑的考察結(jié)果

4.3 提取方法的考察

取趕黃草藥材細粉適量，共2 份，分別用兩種方法：（1）用2.3%鹽酸甲醇溶液回流提取3h；（2）用2.3%鹽酸甲醇溶液浸泡24h，置索氏提取器中，85℃水浴加熱回流3h，對樣品進行處理，比較含量變化，結(jié)果：采用方法2 提取更完全。見表2。

表2 提取方法的選擇

5 線性范圍的考察

精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥24h 的槲皮素對照品0.01250g，置250ml 量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取該對照品溶液0.25ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml 于7 個10ml 量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，分別精密吸取20μl 注入高效液相色譜儀，測定，峰面積分別為109.69、224.38、459.54、900.34、1358.21、1785.32、2230.52，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行回歸處理，得回歸方程：A=89.211C+6.0906（n=7）,γ=0.9999。結(jié)果：槲皮素在1.25-25μg 之間呈良好的線性關(guān)系。

6 重復性試驗

取同一批號樣品6 份，按供試品溶液制備方法制備，依法測定槲皮素含量，平均值為0.6483mg/g，RSD=0.77%；見表3。結(jié)果：本方法的重復性良好。

表3 重復性試驗

7 精密度的考察

取槲皮素對照品溶液（濃度為10μg/ml），重復進樣5 次，測定峰面積，峰面積分別為900.34、906.08、901.17、901.39、908.87，平均值為903.57，RSD=0.41%。結(jié)果：精密度良好。

8 加樣回收實驗

分別精密稱取同批樣品約0.5g（已知槲皮素含量為0.6483mg/g），置于6 個索氏提取器中，并在對應的平底燒瓶中，分別精密加入槲皮素對照品(32μg/ml)10.0ml,按上述供試品溶液制備方法，制備加樣回收供試品溶液，測定含量，計算回收率，結(jié)果回收率分別為(%)：96.42、97.38、95.81、96.93、97.24、95.31。結(jié)果：回收率在95%-98%之間，加樣回收均良好。

9 穩(wěn)定性試驗

將上述同批號的樣品按供試品溶液制備方法制備供試品溶液。分別于0h、2h、4h、6h、8h 精密吸取該供試品溶液20μl 注入高效液相色譜儀中，測定峰面積，結(jié)果峰面積分別為895.519、882.104、915.126、871.233、912.083，平 均 值 為895.273，RSD（%）為2.11。結(jié)果：在本實驗條件下，槲皮素含量在8h 內(nèi)穩(wěn)定。

10 耐用性試驗

將上述同批號的樣品按供試品溶液制備方法制備供試品溶液。分別用同一類型不同廠家的色譜柱、在不同的柱溫、不同流速、不同進樣量條件下測定含量。結(jié)果：理論塔板數(shù)及分離度均達到要求，且含量結(jié)果無顯著性差異。

11 討論

中藥材趕黃草具有利水除濕、祛瘀止痛的功效，可用于黃疸、跌打損傷、水腫等情況的治療[2,3]。槲皮素為趕黃草中的一種有效成分。近年來隨著對中醫(yī)藥學研究的增多，也發(fā)明出了很多中藥制劑，而對藥物中有效成分含量進行測定則是保障藥物治療的重要措施[4-6]。為了測定趕黃草中槲皮素的含量，本研究使用了高效液相色譜法，這是測定藥物有效成分含量的常用方法[7,8]。研究結(jié)果表明，槲皮素在1.25-25μg/ml 之間呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率為96.52%，RSD 為0.85%(n ＝6)，說明高效液相色譜法準確性高，可用于測定趕黃草中槲皮素的含量[9,10]。