補(bǔ)陽還五湯對(duì)Cav-1敲除小鼠腦缺血后mTOR通路的影響

陳博威　周勝?gòu)?qiáng)　易健　羅琳　劉柏炎　謝勇

〔摘要〕 目的 探討小窩蛋白（caveolin-1， Cav-1）對(duì)腦缺血后哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）信號(hào)通路的影響及補(bǔ)陽還五湯抗腦缺血的可能作用機(jī)制。方法 將Cav-1基因敲除（knock out， KO）與野生型（wild type， WT）小鼠隨機(jī)分為KO假手術(shù)組、KO模型組、KO補(bǔ)陽還五湯組（補(bǔ)陽組）、WT假手術(shù)組、WT模型組及WT補(bǔ)陽組。采用大腦中動(dòng)脈栓塞法建立腦缺血模型，干預(yù)14 d后觀察小鼠神經(jīng)功能評(píng)分;免疫組化檢測(cè)大腦mTOR、磷酸化核糖體S6蛋白激酶（phospho-ribosomal S6 kinase， p-S6K1）、磷酸化真核細(xì)胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白-1（phospho-eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1， p-4E-BP1）的蛋白表達(dá);qRT-PCR檢測(cè)大腦mTOR的mRNA水平。結(jié)果 與同類假手術(shù)組比較，其他4組神經(jīng)功能評(píng)分、mTOR、p-S6K1、p-4E-BP1蛋白表達(dá)及mTOR mRNA表達(dá)明顯上升（P<0.01）;與同類模型組比較，KO補(bǔ)陽組、WT補(bǔ)陽組神經(jīng)功能評(píng)分明顯下降（P<0.01），各蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)明顯上升（P<0.01）;與WT模型組比較，KO模型組神經(jīng)功能評(píng)分上升（P<0.05），各蛋白與mRNA表達(dá)明顯下降（P<0.01）;與WT補(bǔ)陽組比較，KO補(bǔ)陽組神經(jīng)功能評(píng)分明顯上升（P<0.01），各蛋白及mRNA明顯下降（P<0.01）。結(jié)論 Cav-1基因的缺失會(huì)導(dǎo)致mTOR通路活性降低并加重腦缺血后神經(jīng)功能損傷;補(bǔ)陽還五湯可能通過Cav-1調(diào)控mTOR信號(hào)通路的活性，發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。

〔關(guān)鍵詞〕 腦缺血;mTOR信號(hào)通路;補(bǔ)陽還五湯;Cav-1基因敲除

〔中圖分類號(hào)〕R285.5;R743.3? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.04.007

Effects of Buyang Huanwu Decoction on mTOR Pathway in Cav-1 Knock Out

Mice after Cerebral Ischemia

CHEN Bowei1， ZHOU Shengqiang2， YI Jian3， LUO Lin1， LIU Baiyan1，4*， XIE Yong5

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The Affiliated Hospital of Hunan Provincial Academy of Traditional Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China; 3. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 4. Yiyang Medical College， Yiyang， Hunan 413000， China; 5. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of caveolin-1 （Cav-1） on mammalian target of rapamycin （mTOR） signaling pathway after cerebral ischemia and the possible mechanism of Buyang Huanwu Decoction （BHD） in anti-cerebral ischemia. Methods Cav-1 knock out mice （KO） and wild type mice （WT） were randomly divided into a KO sham operation group， a KO model group and a KO BHD group， a WT sham operation group， a WT model group， and a WT BHD group. Cerebral ischemia model was established by middle cerebral artery occlusion （MCAO）. After 14 days of intervention， the neurological function scores of each group were observed. The protein expression of mTOR， phospho-Ribosomal protein S6 kinase beta-1 （p-S6K1）， phospho-eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1 （p-4E-BP1） were detected by immunohistochemical method， and mTOR mRNA was detected by qRT-PCR. Results Compared with the sham group， the neurological function scores， the expression of mTOR， p-S6K1， p-4E-BP1 protein and mTOR mRNA of the other 4 groups were significantly increased （P<0.01）. Compared with the similar model group， the neurological function scores of the KO BHD group and the WT BHD group decreased significantly （P<0.01）. The expression of each protein and mRNA increased significantly （P<0.01）. Compared with the WT model group， the neurological function scores of the KO model group increased （P<0.05）， and the expression of each protein and mRNA decreased significantly （P<0.01）. Compared with the WT BHD group， the neurological function scores of the KO BHD group increased significantly （P<0.01）， and each protein and mRNA decreased significantly （P<0.01）. Conclusion The deletion of Cav-1 gene can reduce the activity of mTOR pathway and aggravate the neurological damage after cerebral ischemia; BHD may regulate the activity of mTOR signaling pathway through Cav-1 and play a role in resisting cerebral ischemic injury.

〔Keywords〕 cerebral ischemia; mTOR signaling pathway; Buyang Huanwu Decoction; Cav-1 gene knock out

缺血性腦血管疾病因其高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率給社會(huì)、患者家庭及個(gè)人帶來沉重的痛苦和負(fù)擔(dān)[1]。小窩蛋白（caveolin-1， Cav-1）在腦缺血損傷中具有抑制炎癥反應(yīng)[2]、促進(jìn)血管新生作用[3]，因而改善保護(hù)神經(jīng)。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）信號(hào)通路是一條能調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)[4]、蛋白合成及自噬的經(jīng)典通路[5]。課題組前期研究表明，Cav-1可以通過調(diào)控mTOR/失調(diào)51樣激酶1（uncoordinated 51 like kinase-1， ULK1）通路的活性，抑制腦缺血后半暗帶自噬，減輕腦缺血損傷[6]。但是Cav-1是否能在腦缺血后通過mTOR通路調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)及蛋白質(zhì)合成來減輕腦損傷，目前還未見報(bào)道。補(bǔ)陽還五湯作為治療缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證的經(jīng)典名方，其療效已經(jīng)經(jīng)過臨床證實(shí)[7]。本研究以Cav-1基因敲除小鼠作為研究對(duì)象，通過觀察腦缺血小鼠神經(jīng)功能評(píng)分、mTOR的蛋白與mRNA及其下游效應(yīng)因子磷酸化核糖體S6蛋白激酶（phospho-ribosomal S6 kinase， p-S6K1）、磷酸化真核細(xì)胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白-1（phospho-eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1， p-4E-BP1）的蛋白表達(dá)，探討Cav-1對(duì)腦缺血后

mTOR通路的影響及補(bǔ)陽還五湯對(duì)腦缺血小鼠的療效機(jī)制。

1 材料

1.1? 動(dòng)物

健康雄性Cav-1基因敲除（knock out， KO）小鼠與同源野生型（wild type， WT）C57小鼠，各40只。其中KO小鼠購(gòu)自美國(guó)JacksonLaboratory，批號(hào)：2909619，在湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心自行繁衍，均經(jīng)PCR鑒定為Cav-1基因敲除[8]，自由飲水進(jìn)食，光照規(guī)律。

1.2? 藥物

補(bǔ)陽還五湯按《醫(yī)林改錯(cuò)》原方組成：黃芪120 g，當(dāng)歸尾6 g，川芎3 g，紅花3 g，赤芍4.5 g，桃仁 3 g，地龍3 g，飲片自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院購(gòu)買。常規(guī)煎煮后濃縮至含生藥2 g/mL，冷藏備用。

1.3? 主要試劑與儀器

mTOR抗體、p-S6K1抗體、p-4E-BP1抗體、SABC-POD試劑盒（武漢博士德公司）;TRIzol Reagent（美國(guó)Life Technologies公司）;RevertAidFirst Strand cDNA合成試劑盒（美國(guó)Thermo公司）;PCR引物合成（上海生工生物工程公司），引物序列：β-actin-F：5-GCAGATGTGGATCAGCAAGC-3，β-actin-R：5-AGGGTGTAAAACGCAGCTCAG-3，片段長(zhǎng)度：102 bp;

mTOR-F：5-GGATGCAGTGGCGACATTTG-3，mTOR-

R：5-TTTCAGCATCGTGGGGTCAG-3，片段長(zhǎng)度：79? bp。

EG1150H石蠟包埋機(jī)、RM2235切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司）;BX71顯微鏡（日本奧林巴斯公司）;PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)BioRad公司）;核酸水平電泳儀（北京百晶生物技術(shù)公司）;核酸蛋白濃度測(cè)定儀（英國(guó)BIO-DROP公司）。

2 方法

2.1? 分組造模與干預(yù)

將KO小鼠及WT小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為KO假手術(shù)組、KO模型組、KO補(bǔ)陽還五湯組（補(bǔ)陽組）、WT假手術(shù)組、WT模型組及WT補(bǔ)陽組，運(yùn)用大腦中動(dòng)脈栓塞法復(fù)制腦缺血模型，每組12只。造模方法：將大鼠麻醉后固定，取頸正中切口，游離左側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈，依次結(jié)扎頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈。于頸總動(dòng)脈分叉部下方0.2～0.3 cm處剪一小口，將魚線通過頸總動(dòng)脈，插入頸內(nèi)動(dòng)脈，遇到輕微阻力后停止進(jìn)線，深度（7.5±0.5） mm，固定魚線并逐層縫合切口。假手術(shù)組僅切開皮膚、分離頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈后即縫合。術(shù)后2 h進(jìn)行模型評(píng)分。參照Longa等[9]報(bào)道的5分法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。分值在1～3分表明造模成功，予以納入研究。補(bǔ)陽組于術(shù)后2 h開始給藥，給藥劑量為每日18.5 g/kg（按70 kg成人與動(dòng)物體質(zhì)量藥量折算表換算），模型組和假手術(shù)組小鼠均給予等量蒸餾水，每日灌胃1次，持續(xù)14 d。

2.2? 檢測(cè)指標(biāo)

2.2.1? 神經(jīng)功能評(píng)分? 運(yùn)用Ayelet Levy 14分評(píng)分法評(píng)估神經(jīng)功能[10]。（1）運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)（正常=0;最大值=3）：提住尾巴將大鼠逐漸提高：前肢屈曲計(jì)1分，后肢屈曲計(jì)1分，30 s內(nèi)頭移動(dòng)與縱軸形成角度>10°計(jì)1分;（2）爬行姿勢(shì)測(cè)試（正常=0;最大值=3）：將大鼠置于地面：正常爬行計(jì)0分，無法直線爬行計(jì)1分，沿患側(cè)轉(zhuǎn)圈計(jì)2分，患側(cè)跌倒計(jì)3分;（3）梁平衡測(cè)試（正常=0;最大值=6）：靜態(tài)姿勢(shì)下可平衡計(jì)0分，抓握梁邊計(jì)1分，抱住梁，有一肢體掉落計(jì)2分，抱住梁，有兩肢體掉落，或在梁上旋轉(zhuǎn)（>60 s）計(jì)3分，試圖在梁上保持平衡但跌落（>40 s）計(jì)4分，試圖在梁上保持平衡但跌落（>20 s）計(jì)5分，跌落且沒有試圖保持平衡或抓梁（<20 s）計(jì)6分;（4）反射缺失或異常動(dòng)作（正常=0;最大值=2）：耳廓反射（當(dāng)觸耳道時(shí)搖頭）計(jì)1分，角膜反射（用棉花絲輕觸角膜可閉眼）計(jì)1分。4個(gè)實(shí)驗(yàn)共計(jì)14分，分?jǐn)?shù)越高，神經(jīng)功能損傷越大。

2.2.2? 免疫組化檢測(cè)蛋白表達(dá)? 小鼠處死后用4%多聚甲醛固定大腦，脫水后常規(guī)包埋，切片，厚度約4 μm，依次烤片、脫蠟水化，用3%過氧化氫去離子水滅活，熱修復(fù)抗原，BSA封閉液封閉，加入適量一抗4 ℃冰箱過夜，PBS沖洗后二抗孵育，再次PBS沖洗滴加增敏液孵育，最后DAB顯色并梯度脫水，透明，封片。每只大鼠取5張切片，使用OlympusBX71光學(xué)顯微鏡在200高倍鏡下觀察，運(yùn)行Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)。另因一抗特性不同，p-S6K1、p-4E-BP1指標(biāo)在DAB染色后再用蘇木素復(fù)染，使用OlympusBX71光學(xué)顯微鏡在200倍高倍鏡下觀察，運(yùn)行Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算平均光密度。

2.2.3? qRT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)? 從引物銀行下載基因序列，用Primer premier 6.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并由上海生工合成。運(yùn)用Trizol法提取腦組織總RNA;檢測(cè)RNA濃度及質(zhì)量;以O(shè)ligo（dT）18為引物采用兩步法逆轉(zhuǎn)錄cDNA：變性RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;PCR反應(yīng)：預(yù)變性溫度95 ℃ 2 min，變性溫度95 ℃ 15 s，退火溫度59.2～60.8 ℃，循環(huán)40次。溶解曲線反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，溫度緩慢上升（20 min）。內(nèi)參基因選用β-actin，采用2 -△△Ct進(jìn)行相對(duì)定量，表示該基因的相對(duì)表達(dá)水平。

△Ct值=基因Ct值-內(nèi)參Ct值

△△Ct值=實(shí)驗(yàn)組△Ct值-對(duì)照組△Ct值

2.3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件以及Graphpad Prism 8作圖軟件分析并處理。計(jì)量資料均以“x±s”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，符合正態(tài)性分布的組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 各組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分的比較

與同類型小鼠假手術(shù)組比較，KO模型組、KO補(bǔ)陽組、WT模型組及WT補(bǔ)陽組神經(jīng)功能評(píng)分明顯上升（P<0.01）;與同類型小鼠模型組比較，KO補(bǔ)陽組、WT補(bǔ)陽組神經(jīng)功能評(píng)分明顯下降（P<0.01）;與WT模型組比較，KO模型組神經(jīng)功能評(píng)分增高（P<0.05）;與WT補(bǔ)陽組比較，KO補(bǔ)陽神經(jīng)功能評(píng)分明顯增高（P<0.01）。見表1。

3.2? 各組小鼠mTOR、p-S6K1、p-4E-BP1蛋白表達(dá)的比較

與同類假手術(shù)組比較，KO模型組、KO補(bǔ)陽組、WT模型組及WT補(bǔ)陽組mTOR、p-S6K、p-4E-BP1蛋白表達(dá)升高（P<0.01）;與同類模型組比較，KO補(bǔ)陽組、WT補(bǔ)陽組各蛋白表達(dá)上升（P<0.01）;與WT模型組相比，KO模型組各蛋白表達(dá)明顯降低（P< 0.01）;與WT補(bǔ)陽組比較，KO補(bǔ)陽各蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01）。詳見圖1-圖3。

3.3? 各組小鼠mTOR mRNA表達(dá)的比較

與同類假手術(shù)組比較，KO模型組、KO補(bǔ)陽組、WT模型組及WT補(bǔ)陽組mTOR mRNA表達(dá)升高（P<0.01）;與同類模型組比較，KO補(bǔ)陽組、WT補(bǔ)陽組mRNA表達(dá)上升（P<0.01）;與WT模型組相比，KO模型組mTOR mRNA表達(dá)明顯下降（P<0.01）;與WT補(bǔ)陽組比較，KO補(bǔ)陽mTOR mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.01）。詳見圖4。

4 討論

中醫(yī)學(xué)將腦缺血?dú)w納于“中風(fēng)病”范疇，認(rèn)為其是在氣血陰陽虧損的基礎(chǔ)上，加之飲酒飽食或情志刺激等誘因，致人體臟腑陰陽失調(diào)，氣血運(yùn)行失約，上沖于腦，而發(fā)為中風(fēng)。補(bǔ)陽還五湯由清代王清任所創(chuàng)，本方重用生黃芪為君藥以大補(bǔ)元?dú)?配以當(dāng)歸尾活血和血為臣藥;紅花、桃仁、川芎、赤芍助當(dāng)歸活血祛瘀，地龍長(zhǎng)于行散走竄，通經(jīng)活絡(luò)，均為佐藥。全方共奏，使氣旺促血行，活血而不傷正，則筋肉得養(yǎng)，痿廢可愈，臨床上常用于治療缺血性中風(fēng)氣虛血瘀之證。課題組前期研究表明，補(bǔ)陽還五湯能在腦缺血后通過降低炎癥反應(yīng)[11]、抑制細(xì)胞凋亡[4]、促進(jìn)血管新生[3]、減少細(xì)胞自噬[12]等途徑發(fā)揮抗腦缺血損傷作用。

腦缺血的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，但不管哪種原因?qū)е碌哪X缺血，其治療方法均以改善腦代謝，促進(jìn)受損腦組織血管重構(gòu)及誘發(fā)神經(jīng)再生為主。mTOR是細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞自噬的作用[13]?；罨蟮膍TOR則進(jìn)一步使下游底物S6K1、4E-BP1磷酸化，此兩者是相互平行的信號(hào)分子，其中4E-BP1在正常狀態(tài)下會(huì)與真核細(xì)胞翻譯啟動(dòng)因子（eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E）緊密結(jié)合，阻止帽依賴性翻譯的開始，當(dāng)4E-BP1磷酸化時(shí)則會(huì)與eIF4E分離，啟動(dòng)蛋白質(zhì)的翻譯，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng);而p-S6K1可以繼續(xù)活化細(xì)胞底物，促進(jìn)蛋白翻譯，抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)同樣有著調(diào)節(jié)作用[14]。因此，通過改善腦缺血后mTOR通路的活性，促進(jìn)受損腦組織的蛋白合成，可能是治療腦缺血的潛在靶點(diǎn)，我們推測(cè)補(bǔ)陽還五湯可能通過mTOR通路發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。

小窩是細(xì)胞膜上的特殊凹陷，是各類細(xì)胞信號(hào)分子的聚集地。Cav-1是小窩中重要的功能結(jié)構(gòu)與核心蛋白，可通過激活下游各類效應(yīng)因子，廣泛參與了細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等各個(gè)病理生理過程[15]，為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的樞紐。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)缺血性腦損傷能上調(diào)大鼠腦內(nèi)Cav-1的表達(dá)[16]，而Cav-1敲除則降低腦缺血早期腦內(nèi)細(xì)胞的增殖并增強(qiáng)膠質(zhì)活化，加重了腦缺血損傷[17]。隨著對(duì)Cav-1研究的深入，我們發(fā)現(xiàn)Cav-1可以通過降低炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管新生、抑制細(xì)胞自噬與促進(jìn)神經(jīng)再生等各種途徑[18]，對(duì)腦缺血后損傷神經(jīng)有保護(hù)作用[19]。那么mTOR作為能夠調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的關(guān)鍵信號(hào)通路，Cav-1的神經(jīng)保護(hù)作用是否與改善腦缺血后mTOR通路的活性來促進(jìn)蛋白合成及細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)呢？

本研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后小鼠mTOR的蛋白及mRNA表達(dá)上升、p-S6K1、p-4E-BP1的蛋白表達(dá)同樣上升，但整體活化程度有限，無法完全修復(fù)受損神經(jīng)，仍有明顯神經(jīng)功能缺損。補(bǔ)陽還五湯的干預(yù)讓其調(diào)控作用更加明顯，并能顯著改善神經(jīng)功能評(píng)分，表明補(bǔ)陽還五湯能夠調(diào)控mTOR通路相關(guān)的活性，改善神經(jīng)功能評(píng)分，推測(cè)補(bǔ)陽還五湯的抗腦缺血損傷的作用可能與調(diào)控mTOR通路，促進(jìn)損傷神經(jīng)的蛋白合成及細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)。值得注意的是，本研究還發(fā)現(xiàn)，與WT組小鼠相比，KO組小鼠腦缺血后神經(jīng)功能評(píng)分改善較低，mTOR通路相關(guān)因子的活性受損，表明Cav-1的缺失能夠影響mTOR通路的活性，加重腦缺血后神經(jīng)功能損傷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Cav-1基因的缺失會(huì)導(dǎo)致mTOR通路活性降低并加重腦缺血后神經(jīng)功能損傷;此外，本研究還初步驗(yàn)證了補(bǔ)陽還五湯的干預(yù)可以影響腦缺血后mTOR信號(hào)通路的活性，并改善腦缺血損傷，但是目前還無法肯定其作用機(jī)制與

mTOR信號(hào)通路相關(guān)。課題組將從上述思路出發(fā)，采取Cav-1敲除及mTOR抑制劑雙重阻斷Cav1/mTOR信號(hào)通路的方式，進(jìn)一步明確補(bǔ)陽還五湯抗腦缺血損傷的作用機(jī)制。

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〔收稿日期〕2019-11-12

〔基金項(xiàng)目〕國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81273989）;湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2018JJ2413、2018JJ3383）;湖南省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（2015140）。

〔作者簡(jiǎn)介〕陳博威，男，在讀碩士研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治心腦血管疾病。

〔通訊作者〕*劉柏炎，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：liubaiyan@126.com。