七氟烷預處理后對大鼠腦缺血的神經(jīng)保護作用

廖春英　袁建清　李志剛

摘要：目的 觀察七氟烷預處理對大鼠缺血性腦損傷的神經(jīng)保護作用。方法 將SD大鼠分為實驗組、對照組和假手術(shù)組，七氟烷預處理實驗組大鼠后，實驗組和對照組建立局灶性腦缺血再灌注模型（MCAO），24 h后各組進行神經(jīng)功能缺損評估、測量腦梗死面積，MCAO 3d后TUNEL法檢測細胞凋亡。結(jié)果 實驗組神經(jīng)功能缺損評分明顯低于對照組（P<0.05），實驗組腦缺血損傷面積明顯小于對照組（P<0.05），MCAO 3d 后實驗組TUNEL陽性細胞明顯少于對照組（P<0.05）。結(jié)論 七氟烷預處理對于缺血性腦損傷有神經(jīng)保護作用。

關(guān)鍵詞：七氟烷；預處理；腦缺血；神經(jīng)保護

Abstract：Objective To investigate the neuroprotection of sevoflurane preconditioning for local cerebral ischemia. Methods 36 two-month old Sprague-Dawley male rats were randomly divided into sham group， experimental group and control group. Experimental group was exposed to sevoflurane for 30 min/day on 4 consecutive days and then underwent a 60 min middle cerebral arterial occlusion （MCAO）， while control group underwent MCAO only. At 24 h after reperfusion all the groups were investigated by neurological severity score （NSS） for neurological deficits， TTC staining for infarct percentage， TUNEL was performed to determine the percentage of cell death after MCAO 3d. Results The NSS score and infarct percentage in experimental group decreased significantly compared with those of control group at 24 h after reperfusion （P< 0.05）， The percentage of TUNEL positive cells of experimental group was reduced significantly compared to that of control group at 3 d after reperfusion （P< 0.05）. Conclusion Sevoflurane preconditioning provides neuroprotection against local cerebral ischemia.

Key words：Sevoflurane；Preconditioning；Cerebral Ischemia；Neuroprotection

缺血性腦損傷是一種致死率、致殘率極高的常見病，研究治療缺血性腦損傷的有效措施和藥物，是近年來醫(yī)學研究的一大熱點。近期有研究通過細胞培養(yǎng)和大鼠腦片電生理等離體實驗表明[1]，一種臨床上常用的揮發(fā)性麻醉藥七氟烷（sevoflurane），在腦缺氧中具有神經(jīng)保護作用，本研究通過七氟烷預處理大鼠后建立局灶性腦缺血再灌注模型（MCAO），進行神經(jīng)功能缺損評估、測量腦梗死面積、TUNEL法檢測細胞凋亡，在體研究來觀察七氟烷預處理腦缺血后神經(jīng)保護作用。

1 資料與方法

1.1實驗動物與分組 成年（月齡2個月）健康雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量250～300 g，由贛南醫(yī)學院動物實驗中心提供。隨機分為實驗組、對照組和假手術(shù)組，每組各12只。

1.2七氟烷預處理 實驗組進行1次/d七氟烷處理，將大鼠放入麻醉呼吸箱（Drager公司）中，保持清醒呼吸狀態(tài)，吸入1.0最小肺泡濃度（Minimum Alveolar Concentration， MAC）七氟烷（2.4%七氟烷/空氣）30 min，對照組和假手術(shù)組吸入100%空氣，連續(xù)4 d，最后1次預處理完畢后24 h，進行MCAO模型制備。動物吸入七氟烷期間的監(jiān)測生理指標pH、PaCO2、PaO2和肛溫（℃），保證生理參數(shù)在正常范圍。

1.3 MCAO模型建立 應用線栓法建立MCAO[2]模型，用6%水合氯醛麻醉（300 mg·kg-1體質(zhì)量），術(shù)中維持動物直腸溫度（37±0.5）℃。分離并結(jié)扎右側(cè)頸總動脈、頸外動脈，注意避免刺激迷走神經(jīng)。于頸總動脈近頸內(nèi)動脈、頸外動脈分叉處剪一小口，插入一前端5 mm涂以硅膠的4-0絲線進入頸內(nèi)動脈，深度為距離頸總動脈分叉處1.8～2.0 cm，1 h后拔出絲線進行再灌注。假手術(shù)組除不插線栓外余步驟同上。術(shù)后在約20℃的空調(diào)環(huán)境下單籠飼養(yǎng)，自由進水、進食。

1.4神經(jīng)功能缺損評分 各組MCAO后24 h通過雙盲法（兩人評分，取二者平均值）進行功能缺損評分，評分標準[3]：0分，無神經(jīng)功能缺損；1分，不能完全伸直右側(cè)前爪；2分，向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向右側(cè)傾倒；4分，無自動活動伴有意識障礙；5分，死亡。

1.5氯化三苯基四氮唑（triphyl tetrazolium chloride，TTC）染色法測定腦梗死面積 各組MCAO后24 h隨機取6只斷頭取腦，自視交叉前4 mm開始連續(xù)冠狀面冰凍切片（2 mm厚），共取6片，置于2%TTC（Sigma公司）染色中，37℃避光孵育20 min，存活組織深紅，壞死組織呈白色，數(shù)碼相機（DSC-T300，SONY）將每張組織照相，輸入計算機，用圖像處理軟件（Image Tool）進行不顯色部分面積分析，并計算梗死面積[4- 5]：梗死面積%=[（∑缺血對側(cè)面積×2mm-∑缺血同側(cè)未梗死面積×2mm）/∑對側(cè)面積×2mm]×100%。

1.6 TUNEL法檢測細胞凋亡 各組MCAO后3 d 隨機取6只斷頭取腦，-20℃恒冷切片機自視交叉處開始，行10 μm厚連續(xù)冠狀切片。TUNEL染色嚴格按照TUNEL試劑盒（美國Milipore公司）說明書步驟操作。Olympus BX51熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，每張片子隨機取5個視野，同一曝光條件下照相，并計算TUNEL陽性細胞百分比。

1.7統(tǒng)計學處理 所得數(shù)據(jù)用（x±s）差表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1神經(jīng)功能缺損程度評估 建模前各組大鼠評分為0分，建模后24 h評分：假手術(shù)組評分無變化，為0分，實驗組評分為（1.5±0.7）分，對照組評分為（3.5±0.7）分，實驗組評分明顯低于對照組（P<0.05）。

2.2各組大鼠MCAO后腦梗死面積的比較 假手術(shù)組無明顯腦梗死發(fā)生，實驗組腦梗死的面積比率為（16.58±5.88）%，較對照組腦梗死的面積比率（31.98±10.14）%明顯減少（P<0.05）。

2.3七氟烷預處理對腦缺血后細胞凋亡的影響 假手術(shù)組可見極少數(shù)TUNEL陽性細胞（1.27±0.25）%，MCAO 3d 后實驗組TUNEL陽性細胞（8.25±1.40）%明顯少于對照組（31.45±2.42）%（P<0.05）。

3 討論

缺血性腦損傷是一種致死率、致殘率極高的多發(fā)病、常見病，且易再發(fā)和復發(fā)，嚴重危害人類身心健康。研究治療缺血性腦損傷的有效措施和藥物，是近年來醫(yī)學研究的一大熱點[6]。七氟烷（sevoflurane）是一種臨床上常用的揮發(fā)性麻醉藥，可增加腦血流量，降低腦的氧代謝率[7]，近期有研究通過離體細胞培養(yǎng)和大鼠腦片電生理實驗表明，這種吸入性麻醉藥七氟烷，在腦缺血中具有神經(jīng)保護作用[1，8-10]。

本研究通過七氟烷預處理大鼠后建立MCAO再灌注模型，進行神經(jīng)功能缺損評估、測量腦梗死面積，TUNEL法檢測細胞凋亡，結(jié)果顯示：實驗組神經(jīng)功能缺損評分明顯低于對照組（P<0.05）；實驗組腦梗死的面積比率較對照組明顯減少（P<0.05），MCAO 3d 后實驗組TUNEL陽性細胞明顯少于對照組（P<0.05）。在體研究證實了七氟烷預處理腦缺血后的神經(jīng)保護作用。但其作用的具體機制尚不清楚，可能對腦血流量、腦代謝、炎癥因子及其相關(guān)信號傳導產(chǎn)生一定影響[11]。有研究認為七氟烷可激活KATP，抑制缺血期神經(jīng)元的鈣離子和興奮性氨基酸濃度的升高[11]；減少NF-kB入核，降低其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的炎癥因子如COX-2、iNOS、TNFa、IL-1、IL-6等來抑制炎癥反應[12]；抑制腦缺血后的細胞凋亡[13]，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

最近，國外通過細胞培養(yǎng)離體研究表明，雙孔鉀通道TREK-1參與了七氟烷預處理在腦缺血中的神經(jīng)保護作用。TREK-1是一種新型的雙孔鉀離子通道亞型，可被機械牽張、多聚不飽和脂肪酸（如花生四烯酸、AA）、溶血磷脂和一些揮發(fā)性麻醉藥如氟烷、七氟烷、乙醚、氙氣等激活[14]。TREK-1廣泛表達于大鼠海馬、皮層，其活性可影響腦缺血時星形膠質(zhì)細胞的增殖活化以及平衡緩沖功能[15-16]。 TREK-1通道開放后，表達具有線性I-V關(guān)系的背景鉀電流，在細胞膜靜息電位的形成和膜電位的復極化中起著重要作用，能穩(wěn)定膜電位，調(diào)節(jié)細胞的興奮性，使細胞膜超極化，減少鈣離子內(nèi)流，降低谷氨酸的轉(zhuǎn)運和興奮性細胞毒性[14]。

本實驗通過七氟烷預處理大鼠后建立MCAO再灌注模型，進行神經(jīng)功能缺損評估、測量腦梗死面積，TUNEL法檢測細胞凋亡，在體研究證實了七氟烷預處理腦缺血后的保護作用，為進一步研究其神經(jīng)保護作用的機制提供了實驗基礎。

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編輯/金昊天