UPLC-MS/MS測定豬肉中3種β-受體激動(dòng)劑殘留量

張加穩(wěn)，白文莉*

（昆明市食品藥品檢驗(yàn)研究院，云南 昆明 650000）

β-受體激動(dòng)劑是一類具有腎上腺素功能的苯乙醇胺類人工合成物質(zhì)[1]，能有效提高養(yǎng)殖動(dòng)物飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉率，常被非法用于動(dòng)物養(yǎng)殖過程，人們食用殘留有一定劑量的β-受體激動(dòng)劑肉制品后會(huì)出現(xiàn)不同程度的中毒反應(yīng)，如面色潮紅、四肢麻木等，嚴(yán)重的可能危及到生命[2-3]。因此，國家和主管農(nóng)業(yè)部門加大了對β-受體激動(dòng)劑的監(jiān)管力度，2002年2月，原農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部、國家藥品監(jiān)督管理局聯(lián)合發(fā)布《禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用的藥物品種目錄》（農(nóng)業(yè)部公告第176號(hào)），明確將鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺等7種β-受體激動(dòng)劑列入目錄[4]。

目前國內(nèi)外動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑的檢測方法[5-6]主要有酶聯(lián)免疫法（enzyme-linked immunosorbent as say，ELISA）、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS/MS）。酶聯(lián)免疫法（ELISA）[7-9]適用于大批量樣品的快速篩查，樣品前處理相對簡單，所需儀器化程度低，但檢驗(yàn)過程易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，因此用該方法檢測到的陽性樣品需要用其他儀器方法進(jìn)行確認(rèn)。高效液相色譜法（HPLC）[10]分離度好、專屬性強(qiáng)，但樣品前處理和試劑要求較高，基質(zhì)干擾較大，也容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）[11-13]能在多種β-受體激動(dòng)劑同時(shí)存在的情況下對某種特定的殘留物進(jìn)行定性、定量分析，與HPLC法相比，檢測靈敏度較高，假陽性概率更低，但GC-MS適用于揮發(fā)性成分檢測，前處理需要衍生化，過程較繁瑣，檢測耗時(shí)長，樣品回收率也得不到保證。GC-MS[11-12]要求較高，基質(zhì)干擾較大，也容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS/MS）[14-15]與其他檢測方法相比，具有適用范圍廣、準(zhǔn)確，靈敏度高、分析周期短等優(yōu)點(diǎn)，已被越來越多地應(yīng)用于動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑的檢測和確認(rèn)。目前GB/T 22286—2008《動(dòng)物源性食品中多種β-受體激動(dòng)劑殘留量的測定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》[16]被廣泛用于監(jiān)督檢測中，但該標(biāo)準(zhǔn)方法在前處理過程未對肉制品進(jìn)行去除油脂處理，而是直接提取凈化，這樣做既會(huì)對樣品回收率造成影響，同時(shí)還易造成液相色譜柱堵塞。此外，已報(bào)道的文獻(xiàn)[17-21]對目標(biāo)物提取溶劑和凈化方式差異較大，提取回收率高低不同。本實(shí)驗(yàn)在GB/T 22286—2008的基礎(chǔ)上，選擇在豬肉基質(zhì)中添加克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇3種β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行研究，先用正己烷對加標(biāo)樣品做去除油脂處理，然后對其提取溶劑和固相萃取凈化柱作優(yōu)化研究，最終建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatographytriple quadrupole tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）的檢測方法，具有定性和定量準(zhǔn)確可靠、高靈敏度、基質(zhì)干擾小等優(yōu)點(diǎn)，可為動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑的檢測分析提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷、異丙醇（均為色譜純）：默克股份兩合公司；石油醚（分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；氯化鈉、氫氧化鈉、無水醋酸鈉、鹽酸、氨水、甲酸（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；β-葡萄糖醛甙酶（分析純）：Helix pomatia公司。豬肉樣品：市場抽檢。

克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：德國E.Q.公司；沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：中國食品藥品檢定研究院；萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：美國Stanford Chemicals公司。

6cc 150 mg SCX、6cc 150 mg WCX、6cc 150 mg PCX、6cc 150mgMCX固相萃取柱：美國Waters公司；C18色譜柱（2.1mm×150 mm，1.8μm）：美國Agilent公司；PES濾膜（0.22 μm）：天津津騰有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EXION-QTRAP4500超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國AB公司；SK8210HP超聲波清洗儀：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；Reacti-Therm氮吹儀：美國Thermo Scientific公司；Allegra X-30R高速離心機(jī)：美國貝克曼公司；JJ500電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠；MF10組織搗碎機(jī)：德國IKA公司；S220K pH計(jì)：梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；HH-6恒溫水浴鍋：金壇市科析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確量取100 μg/mL的克倫特羅＋沙丁胺醇＋萊克多巴胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，用乙腈稀釋定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱保存。準(zhǔn)確量取1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用體積分?jǐn)?shù)30%乙腈依次稀釋成5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，避光4 ℃條件下保存，待用。

1.3.2 樣品前處理

（1）提?。簻?zhǔn)確稱取樣品約2 g（精確至0.01 g）置于50 mL離心管中，加入10 mL正己烷超聲10 min去除油脂處理后，加入8 mL乙酸鈉緩沖液，充分混勻，加入50 μLβ-葡萄糖醛甙酶于離心管中，混勻后，37 ℃條件下水浴水解12 h。

水解完成后，取出離心管，于水平振蕩器上振蕩15 min，5 000 r/min離心10 min，取4 mL上清液于另一離心管中，加入0.1 mol/L高氯酸溶液5 mL，混合均勻，用高氯酸調(diào)節(jié)pH值至1±0.3，5 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移全部上清液于50 mL離心管中，用10 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至11，加入10 mL飽和氯化鈉溶液和10 mL異丙醇-乙酸乙酯（6∶4，V/V）混合溶液，充分超聲提取5 min，5 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移有機(jī)相至另一50 mL離心管中，重復(fù)提取一次，合并有機(jī)相，于40 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?，加? mL乙酸鈉緩沖液，超聲混勻，殘?jiān)浞秩芙夂髠溆谩?/p>

（2）凈化：用3 mL甲醇和3 mL水活化MCX陽離子交換柱，將上述待測溶液過柱，依次用2 mL水、2 mL 2%甲酸水溶液和2 mL甲醇洗滌柱子并徹底抽干，再用2 mL 5%的氨水甲醇溶液洗脫柱子上的待測成分，洗脫液在40 ℃水浴條件下氮?dú)獯蹈?，最后? mL 0.1%甲酸/水-乙腈（70∶30，V/V）超聲溶解，過0.22 μm微孔濾膜，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.3.3 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

（1）超高效液相色譜條件為流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相A為含0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈，洗脫梯度見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

（2）電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜（electrospray ionization tandem mass spectrometry，ESI-MS/MS）條件：正離子掃描；質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；氣簾氣，離子源霧化氣，離子源輔助加熱氣，分別設(shè)定為38 L/h、55 L/h、55 L/h，噴霧電壓5 500 V，加熱器溫度為550 ℃；優(yōu)化后的監(jiān)測離子對（m/z）、去簇電壓（declusteringpotential，DP）、碰撞能量（collision energy，CE）、駐留時(shí)間等參數(shù)見表2。

表2 3種β-受體激動(dòng)劑保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Retention time and mass spectrometry parameters of three β-receptor agonists

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

該類化合物分子結(jié)構(gòu)中均含有胺基和羥基基團(tuán)，在質(zhì)譜檢測離子化過程中，容易形成穩(wěn)定的[M+H]+離子，故采用電噴霧電離（electrospray ionization，ESI+）正離子掃描模式。優(yōu)化過程用體積分?jǐn)?shù)50%乙腈水溶液將1 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋成約為200 ng/mL的溶液，針泵恒流注射進(jìn)樣，設(shè)置一定的質(zhì)譜參數(shù)，分別掃描3種化合物的母離子Q1和子離子Q3，選取兩對離子豐度較強(qiáng)、干擾較小的特征離子對來同時(shí)定性，避免假陽性結(jié)果的發(fā)生，再選取其中離子豐度最強(qiáng)的一對離子對來進(jìn)行定量，保證定量的準(zhǔn)確性。最后對確定的Q1和Q3來優(yōu)化去簇電壓、碰撞能量、駐留時(shí)間等參數(shù)，建立完整的質(zhì)譜參數(shù)。

正離子掃描模式下，在液相色譜流動(dòng)相中加入少量的甲酸會(huì)增強(qiáng)待測化合物的響應(yīng)強(qiáng)度，原因是甲酸會(huì)電離出更多的H+。因此本實(shí)驗(yàn)選用0.1%的甲酸水溶液與乙腈為流動(dòng)相，由于3種化合物的極性比較相近，故采用較長的C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）進(jìn)行梯度洗脫，從而保證各個(gè)化合物有較好的峰形、分離度和響應(yīng)強(qiáng)度。建立優(yōu)化后的超高效液相色譜參數(shù)和質(zhì)譜參數(shù)后對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、加標(biāo)樣品溶液和空白樣品溶液采集的離子色譜峰圖分別如圖1所示。

圖1 混合標(biāo)液（A）、加標(biāo)樣品（B）、空白樣品（C）的UPLC-MS/MS色譜圖Fig.1 UPLC-MS/MS chromatogram of mixed standard (A),adding standard sample (B) and blank sample (C)

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化

圖2 不同比例異丙醇-乙酸乙酯克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺提取回收率的影響Fig.2 Effct of different proportions of isopropanol-ethyl acetate on the extraction recovery rate of clenbuterol,salbutamol and ractopamine

克倫特羅、沙丁胺醇、和萊克多巴胺分子結(jié)構(gòu)均由苯環(huán)連接著胺基和羥基構(gòu)成，屬于中等極性化合物，本實(shí)驗(yàn)考察了異丙醇-乙酸乙酯兩種中等極性的溶劑以（10∶0、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、0∶10，V/V）等不同比例混合后提取效率的高低，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，異丙醇-乙酸乙酯（6∶4，V/V）混合液提取效果最好，3種β-受體激動(dòng)劑的回收率依次為78.7%、88.9%、83.4%，此結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了GB/T 22286—2008《動(dòng)物源性食品中多種β-受體激動(dòng)劑殘留量的測定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》所用異丙醇-乙酸乙酯（6∶4，V/V）混合溶液作為提取溶劑的正確性。

2.2.2 凈化條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)在前處理過程中，采用4種不同的陽離子交換小柱（WCX、PCX、SCX及MCX）對目標(biāo)提取液進(jìn)行凈化萃取，比較其對克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺的凈化效果，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，采用MCX固相萃取柱的凈化效果最好，樣品中3種β-受體激動(dòng)劑的回收率均在70%以上，原因可能是MCX填料對3種化合物所形成的[M+H]+離子吸附作用較強(qiáng)，且易于洗脫。因此本實(shí)驗(yàn)選擇MCX作為固相凈化柱。

圖3 不同凈化柱下克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺的提取回收率Fig.3 Extraction recovery rate of clenbuterol,salbutamol and ractopamine under different purification columns

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系及檢出限

采用外標(biāo)法定量，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度（x）作為橫坐標(biāo)，目標(biāo)物定量離子對的峰面積（y）作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表3。

表3 3種β-受體激動(dòng)劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 3 Linear equations,correlation coefficients and detection limits of three β-receptor agonists

由表3可知，3種β-受體激動(dòng)劑混合標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度范圍在5～100 ng/mL，相關(guān)系數(shù)R2均＞0.99。在空白豬肉樣品中加入3種混合標(biāo)液，經(jīng)過萃取濃縮和凈化后進(jìn)行儀器檢測，以3倍信噪比為方法檢出限。目前，國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22286—2008《動(dòng)物源性食品中多種β-受體激動(dòng)劑殘留量的測定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》[16]中對克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺殘留量的檢出限均為0.5 μg/kg，因此本實(shí)驗(yàn)建立的肉制品中β-受體激動(dòng)劑殘留量的檢測方法符合國家標(biāo)準(zhǔn)的檢測要求。

2.3.2 回收率和精密度

在豬肉中分別添加0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、5.0 μg/kg 3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，按照優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法測定，計(jì)算其加標(biāo)回收率及精密度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。3種β-受體激動(dòng)劑的平均回收率均為81.8%～103.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均＜10%，其加標(biāo)回收率和精密度均符合GB/T 27404—2008規(guī)定的要求[22]。

表4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 4 Results of adding standard recovery rate test (n=6)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定豬肉中克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺殘留量的分析方法，分別對提取溶劑、固相萃取柱、液相色譜和質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。該方法先用正己烷去除樣品中油脂，再用異丙醇-乙酸乙酯（6∶4，V/V）混合液萃取濃縮，最后用MCX固相萃取柱進(jìn)一步凈化，有效減弱了基質(zhì)效應(yīng)，提高了檢測方法的靈敏度和準(zhǔn)確度。3種β-受體激動(dòng)劑的平均回收率在81.8%～103.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜10%，表明該方法回收率高和重復(fù)性好，能夠滿足國外相關(guān)法規(guī)的要求，適合大批量豬肉中β-受體激動(dòng)劑殘留量的檢測分析。